張光輝，張拴，龍旭，郭惠，孟慶華，左振宇

（陜西中醫(yī)藥大學(xué) 藥學(xué)院, 陜西 咸陽 712046）

異甘草素合成工藝優(yōu)化及其清除自由基活性研究

張光輝，張拴＊，龍旭，郭惠，孟慶華，左振宇

（陜西中醫(yī)藥大學(xué) 藥學(xué)院, 陜西 咸陽 712046）

對(duì)異甘草素的合成工藝進(jìn)行優(yōu)化和體外清除自由基活性進(jìn)行研究。通過間苯二酚、冰醋酸、對(duì)羥基苯甲酸合成異甘草素，考察物料比、溫度、反應(yīng)時(shí)間對(duì)產(chǎn)率的影響，通過紫外分光度法對(duì)其清除自由基活性進(jìn)行研究。酚與酸物料比1∶2.5，240 W微波輻射3 min，2,4-二羥基苯乙酮產(chǎn)率最高為65.75%；當(dāng)醛酮物質(zhì)的量比為3∶1，溫度控制在120～130 ℃，回流6 h，異甘草素產(chǎn)率最高為28.10%；反應(yīng)時(shí)間控制20 min，異甘草素加入量為1.00 mL清除DPPH自由基能力最強(qiáng)，為66.4%。異甘草素具有一定的抗自由基活性。

異甘草素；合成；抗自由基

Abstract:The synthesis process of isoliquiritigenin was optimized and its activity of scavenging free radicals in vitro was studied. Firstly, isoliquiritigenin was prepared from resorcinol, acetic acid and p-hydroxybenzoic acid. The influence of molar ratio of reactants, reaction temperature and reaction time on the yield of isoliquiritigenin product was investigated. The results showed that, when the molar ratio of resorcinol and acetic acid was 1:2.5, microwave radiation was 240 W for 3 min, the product yield of 2, 4-dihydroxyacetophenone reached the maximum value, 65.75%;When the molar ratio of aldehyde and ketone was 3:1, the temperature was about 120～ 130 oC with reflux time of 6 h,the yield of isoliquiritigenin product was as high as 28.10%. Then, the activity of scavenging DPPH free radicals was the highest, about 66.4 when 1.00 mL isoliquiritigenin was added to the solution with the reaction time of about 20 min.The results indicated that isoliquiritigenin has good anti-free radicals ability.

Key words:Isoliquiritigenin; Synthesis; Anti-free radicals

甘草為豆科植物甘草，脹果甘草和光果甘草的根及根莖[1]，又名拉烏爾草，早在《神農(nóng)本草經(jīng)》上就列為上品中藥，其性味甘平，傳統(tǒng)中醫(yī)藥認(rèn)為它具有補(bǔ)脾益氣、清熱解毒、通淋利尿、祛痰止咳、緩急止痛、調(diào)和諸藥的功效等作用，在我國(guó)主要分布于新疆、甘肅、西藏等地區(qū)。異甘草素是甘草中黃酮中的主要成份之一，結(jié)構(gòu)如圖1示，屬于二氫黃酮類化合物，分子式為C15H12O4，熔點(diǎn)198～200℃，黃色針狀結(jié)晶[2]。異甘草素有抗?jié)?、抗炎[3]、解痙、抗菌、抗腫瘤[4]、美白、抗氧化[5]、預(yù)防動(dòng)脈粥樣硬化、保護(hù)肝臟[6]等廣泛的藥理作用，但是甘草中的異甘草素的含量低，價(jià)格昂貴，提取過程繁瑣，限制了它的應(yīng)用。

為此，本實(shí)驗(yàn)擬對(duì)化學(xué)方法合成異甘草素條件進(jìn)行優(yōu)化，并對(duì)其體外清除自由基活性進(jìn)行研究，旨在為進(jìn)一步開發(fā)利用異甘草素提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

圖1 異甘草素的結(jié)構(gòu)Fig.1 The structure of isoliquiritigenin

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 實(shí)驗(yàn)試劑與儀器

間苯二酚(AR,天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司)，氯化鋅（AR,天津市天力化學(xué)試劑有限公司），冰醋酸(AR，天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司)，對(duì)羥基苯甲醛（AR，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司），石油醚(AR,成都市科龍化工試劑廠)，乙酸乙酯(AR,成都市科龍化工試劑廠)，二苯代苦味肼基自由基(日本東京化成工業(yè)株式會(huì)社) 。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)儀器

顯微熔點(diǎn)測(cè)定儀（XT4A，精確度1 ℃），恒溫磁力攪拌器（HJ-3A），微波化學(xué)反應(yīng)器（WBFY-205），循環(huán)水多用真空泵(SHB-III），紫外/可見分光光度計(jì)UV1102(日本島津)。

1.2 實(shí)驗(yàn)試劑與儀器

1.2.1 異甘草素的合成工藝優(yōu)化

以間苯二酚、冰醋酸和對(duì)羥基苯甲酸為原料[7]，通過兩步反應(yīng)，第一步通過微波反應(yīng)合成 2,4-二羥基苯乙酮，第二步再與對(duì)羥基苯甲醛反應(yīng)得到異甘草素[7,8]，考查反應(yīng)過程中物料比、反應(yīng)溫度、反應(yīng)時(shí)間條件對(duì)產(chǎn)率的影響。

（1） 2,4-二羥基苯乙酮的合成

稱取間苯二酚1.10 g，冰醋酸1.5 mL，無水氯化鋅1.45 g于100 mL圓底燒瓶中，于240 W微波輻射3 min，然后將反應(yīng)物倒入30 mL水中，有桔黃色沉淀析出，減壓抽濾，用去離子水洗滌 2～3次，得到淡桔黃色固體 2,4-二羥基苯乙酮[9]，熔點(diǎn)144 ℃。

（2） 異甘草素的合成

取上步合成的產(chǎn)物 2,4-二羥基苯乙酮與對(duì)羥基苯甲醛物質(zhì)的量比為1:3，再加硼酸2.0 g和助溶劑甘油3.0 g于100 mL圓底燒瓶，液體石蠟浴加熱升溫到120～130 ℃，反應(yīng)6 h,將反應(yīng)物倒入盛有10 mL水的燒杯中，趁熱抽濾，濾渣經(jīng)硅膠柱（石油醚-乙酸乙酯比例為 2:1）洗脫，揮干，即得黃色針狀晶體異甘草素。

建立多元供應(yīng)體系，大力推進(jìn)煤炭清潔高效利用，著力發(fā)展非煤能源，形成煤、氣、油、可再生能源多輪驅(qū)動(dòng)的能源供應(yīng)體系。

1.3 異甘草素抗自由基活性

稱取異甘草素樣品和DPPH自由基溶于乙醇，分別配制成濃度為0.50 mg/L和0.10 mmol/L的溶液。取樣品0.20、0.40、0.60、0.80、1.00 mL分別加入2.00 mL DPPH自由基溶液，加無水乙醇至4 mL搖勻，10 min后以無水乙醇為參比，在517 nm波長(zhǎng)處測(cè)吸光度A 樣；將樣品用等體積水代替[10]，按上述方法配制測(cè)定吸光度A空；利用公式：

計(jì)算清除率。A樣為加樣品反應(yīng)后DPPH溶液的吸光度；A空為不加樣品, 只加 DPPH溶液的吸光度。

2 結(jié)果與討論

2.1 2,4-二羥基苯乙酮產(chǎn)率的影響因素

2.1.1 酚酸物料比對(duì)2,4-二羥基苯乙酮產(chǎn)率的影響

在無水ZnCl2用量不變的情況下，改變間苯二酚與冰醋酸的用量，冰醋酸用量為1.5 mL時(shí)240 W微波輻射3 min，物料比為1∶2.5時(shí)，2,4-二羥基苯乙酮的產(chǎn)率最高。結(jié)果見表1。

表1 酚酸比對(duì)二羥基苯乙酮產(chǎn)率的影響Table 1 Effect of phenolic acid ratio on yield of dihydroxyacetophenone

表2 反應(yīng)時(shí)間對(duì)-二羥基苯乙酮產(chǎn)率的影響Table 2 Effect of reaction time on yield of dihydroxyacetophenone

2.2 異甘草素產(chǎn)率的影響因素

2.2.1 2,4-二羥基苯乙酮與對(duì)羥基苯甲醛的物質(zhì)的量比對(duì)異甘草素產(chǎn)率的影響

其他條件一定時(shí)，酮醛的物質(zhì)的量比3∶1時(shí)，異甘草素的產(chǎn)率最高，結(jié)果見表3。

表3 醛酮比對(duì)異甘草素產(chǎn)率的影響Table 3 Effect of aldehyde and ketone ratio on yield of isoliquiritigenin

2.2.2 反應(yīng)溫度對(duì)異甘草素產(chǎn)率的影響

改變反應(yīng)溫度，發(fā)現(xiàn)在 120～130 ℃異甘草素產(chǎn)率最高，結(jié)果見表4。

表4 反應(yīng)溫度對(duì)異甘草素產(chǎn)率的影響Table 4 Effect of reaction temperature on yield of isoliquiritigenin

2.2.3 反應(yīng)時(shí)間對(duì)異甘草素產(chǎn)率的影響

固定其它條件不變，在 120～130 ℃溫度段，改變反應(yīng)時(shí)間，發(fā)現(xiàn)反應(yīng)6 h時(shí)異甘草素產(chǎn)率最高，結(jié)果見表5。

表5 反應(yīng)時(shí)間對(duì)異甘草素產(chǎn)率的影響Table 5 Effect of reaction time on yield of isoliquiritigenin

2.3 異甘草素結(jié)構(gòu)表征

樣品熔點(diǎn)測(cè)定結(jié)果為 183～185 ℃，與異甘草素熔點(diǎn)基本一致。核磁共振與文獻(xiàn)報(bào)道一致[11]。1H NMR (DMSO-d6,400MHz) δ∶13. 60 (1H,s,OH-2')，10.66 (1H,s,OH-4')，10. 14 (1H,s,OH-4)，8. 15 (1H,d,J =8.4 Hz,H-6')，7. 74 (4H,m,H-α,H-β, H-2,6)，6. 84(2H,d,J = 8. 4 Hz,H-3，5)，6. 39 (1H,dd,J = 8. 4,2. 4 Hz,H-5')，6. 27 (1H,d,J = 2. 4 Hz,H-3')。從化學(xué)位移數(shù)據(jù)可以看出，在7. 74處有4個(gè)H，2,4-二羥基苯乙酮的甲基氫和對(duì)羥基苯甲醛的醛基氫的化學(xué)位移消失，說明醛酮發(fā)生了反應(yīng)，證明產(chǎn)物為異甘草素。

2.4 異甘草素的抗自由基活性

DPPH (2, 2-diphenyl-1-picry-hydrazylradical)自由基較為穩(wěn)定，其乙醇溶液呈藍(lán)紫色，最大吸收波長(zhǎng)為517 nm。當(dāng)其孤對(duì)電子配對(duì)后，吸光度值會(huì)降低，吸光度與其所接受的電子數(shù)呈反比關(guān)系。結(jié)果見圖2。

吸光度測(cè)定表明，當(dāng)反應(yīng)20 min以后，吸光度趨于水平，所以最佳顯色時(shí)間控制在20 min；隨著異甘草素用量增加，吸光度逐漸減小，表明清除自由基能力逐漸增強(qiáng)；當(dāng)加入異甘草素量為1.00 mL時(shí)，利用公式（1）計(jì)算清除率最大為66.4%，表明異甘草素具有一定的抗氧化性。

圖2 異甘草素不同加入量時(shí)吸光度Fig.2 The absorbance of different dosage isoliquiritigenin.

3 結(jié) 論

當(dāng)間苯二酚與冰醋酸物料比1∶2.5，240 W微波輻射 3 min，2,4-二羥基苯乙酮產(chǎn)率最高為65.75%；當(dāng)醛酮物質(zhì)的量比為 3∶1，溫度控制在120～130 ℃，回流 6 h，異甘草素產(chǎn)率最高為28.10%?；钚詼y(cè)試結(jié)果表明，反應(yīng)時(shí)間控制20 min，異甘草素加入量為1.00 mL清除DPPH自由基能力最強(qiáng)，為66.4%。異甘草素有一定的抗自由基活性，可以作為藥品或者保健美容產(chǎn)品。

［1］ 國(guó)家藥典編委會(huì).中國(guó)藥典[S].北京:中國(guó)醫(yī)藥科技出版社，2010:230-231.

［2］ 陳日來，李玉珍，李成.異甘草素的研究進(jìn)展[J].臨床醫(yī)藥實(shí)踐雜志，2008(6):413-415.

［3］ 曲曉梅，金鐘太，尚艷華，等.甘草水煎液抗炎作用的實(shí)驗(yàn)研究[J].實(shí)用藥物與臨床, 2005, 8(5): 14-16.

［4］王志強(qiáng)，張秀英，李文廣，等. 異甘草素抗腫瘤活性及初步機(jī)制研究[J].中國(guó)藥理學(xué)通報(bào)，2015,31( 8):1159-1164.

［5］ 潘英明，粱英.槐花米中清除自由基活性成分的提取及其性能研究[J].現(xiàn)代化工,2005, 11 (5):16 -20.

［6］ 尹龍武，呂曉君，楊靜，等.異甘草素對(duì)小鼠兔疫性肝損傷的保護(hù)作用及其機(jī)制[J].中國(guó)藥理通訊,2007, 24(3):27.

［7］楊昆，楊澤華，劉顯華，等.甘草素的合成及其抗癌活性[J].合成化學(xué),2010,18(4):513-516.

［8］ 楊立，沈鳳嘉.甘草素與異甘草素的合成[J].藥學(xué)學(xué)報(bào),1994,29(11):877-880.

［9］ 徐鎖平，徐郭，裴元，等.2,4-二羥基苯乙酮的微波合成及晶體結(jié)構(gòu)[J].徐州師范大學(xué)學(xué)報(bào):自然科學(xué)版,2010,28(1):68-70.

［10］張曉璐,徐凱宏.山楂葉總黃酮清除 DPPH和超氧陰離子自由基的活性研究[J].林業(yè)科技,2008, 3(5):51-54.

［11］李宏智，艾尼瓦爾·買買提，木合布力·阿布力孜，等.異甘草素的合成及結(jié)構(gòu)表征[J].中國(guó)新藥雜志,2009,10(19):1882-1885.

Optimization of Synthesis Process of Isoliquiritigenin and Its Activity of Scavenging Free Radicals in Vitro

ZHANG Guang-hui，ZHANG Shuan*，LONG Xv，GUO Hui，MENG Qing-hua,ZUO Zhen-yu

（College of Pharmacy, Shaanxi University of Chinese Medicine, Shaanxi Xianyang 712046, China）

R 284

A

1671-0460（2017）09-1749-03

陜西中醫(yī)藥大學(xué)青年基金，項(xiàng)目號(hào)：2015QN22。中國(guó)博士后基金面上項(xiàng)目，編號(hào)：2016M602994。陜西省教育廳項(xiàng)目：16JK1220。

2017-03-01

張光輝（1987-），男，陜西咸陽人，講師，碩士，2013年畢業(yè)于陜西師范大學(xué)無機(jī)化學(xué)專業(yè)，研究方向：天然藥物結(jié)構(gòu)修飾。E-mail：1038109280@qq.com。

張拴（1976-），男，副教授，研究方向：中藥物質(zhì)基礎(chǔ)研究。E-mail：4216827116@163.com。