劉曄 車念聰 杜宇瓊 王金光 李文新

芪水煎對(duì)糖尿病腎病小鼠肝、腎組織細(xì)胞外基質(zhì)調(diào)節(jié)因子表達(dá)的影響

劉曄 車念聰 杜宇瓊 王金光 李文新

目的 基于肝腎同源理論,觀察糖尿病腎病(kk-ay)小鼠后期谷丙轉(zhuǎn)氨酶(alanine aminotransferase,ALT)、谷草轉(zhuǎn)氨酶含量(aspartate transaminase,AST)變化以及芪水煎對(duì)肝、腎基質(zhì)金屬蛋白酶-9(Matrix metalloe proteinas-9,MMP-9)及基質(zhì)金屬蛋白酶組織抑制因子-1(tissue inhibitor of metalloproteinase-1,TIMP-1)表達(dá)的影響。方法 采用kk-ay小鼠高糖高脂飲食4周建立糖尿病腎病模型后,隨機(jī)分為模型組、黃芪水組、通心絡(luò)組,設(shè)立C57BL/6J小鼠作為對(duì)照組。予芪水煎及通心絡(luò)干預(yù)12周后,監(jiān)測各組小鼠血 ALT、AST,采用 Western Blot、Realtime-PCR檢測肝、腎組織MMP-9和TIMP-1蛋白含量及mRNA表達(dá)水平。結(jié)果 與模型組比較,芪水煎組AST顯著降低(P＜0.01)、ALT呈下降趨勢(P＞0.05),肝MMP-9蛋白及mRNA表達(dá)顯著升高(P＜0.01),TIMP-1蛋白顯著降低(P＜0.01),mRNA表達(dá)降低(P＜0.05),腎MMP-9蛋白及mRNA表達(dá)升高(P＜0.05),TIMP-1蛋白及mRNA表達(dá)降低(P＜0.05)。結(jié)論 kk-ay小鼠后期會(huì)出現(xiàn)肝損傷,芪水煎對(duì)kk-ay小鼠肝、腎損傷具有一定的保護(hù)作用。

黃芪; 水紅花子; 肝腎同源; 肝損傷; 腎基質(zhì)金屬蛋白酶-9; 基質(zhì)金屬蛋白酶組織抑制因子-1

糖尿病以代謝紊亂和高血糖為主要特征,由于長期存在的血糖代謝障礙,會(huì)導(dǎo)致多個(gè)臟腑器官受累。糖尿病常見并發(fā)癥首先當(dāng)屬腎損傷,其危害性表現(xiàn)為發(fā)病率高,病情預(yù)后較差;此外,肝臟作為糖代謝的功能器官,長期的代謝異常亦會(huì)對(duì)肝臟造成損害,由于其代償能力較強(qiáng),肝損傷早期并不明顯,但到后期肝損傷隨著病情發(fā)展嚴(yán)重將無法逆轉(zhuǎn)[1]。反之,肝臟功能受損亦會(huì)糖、脂代謝紊亂,從而形成惡性循環(huán)[2-3]。肝腎同屬人體重要器官,病理上互相影響,發(fā)病機(jī)制復(fù)雜,病情發(fā)生發(fā)展過程中相互作用也不是簡單的因果關(guān)系,相關(guān)性的具體機(jī)制目前尚不清楚[4]。認(rèn)識(shí)不足、手段有限使現(xiàn)代醫(yī)學(xué)在治療糖尿病肝腎并發(fā)癥時(shí)并不理想。而中醫(yī)基礎(chǔ)理論早已揭示了肝腎之間物質(zhì)基礎(chǔ)和生理作用上密切關(guān)聯(lián),所以在整體觀念指導(dǎo)下的“肝腎同源”和絡(luò)病理論給復(fù)雜病情治療提供新的思維。在糖尿病肝腎損傷中,都能觀測到與基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metallo proteinas,MMPs)和金屬蛋白酶組織抑制劑(tissue inhibitor of metalloproteinases,TIMPs)的平衡改變密切相關(guān)。TIMP-1升高則會(huì)抑制MMP-9活性,平衡打破,提示臟器受到損傷[5]?；诖?本實(shí)驗(yàn)在上述中醫(yī)理論的指導(dǎo)下,通過觀察芪水煎對(duì)kk-ay小鼠肝腎TIMP-1、MMP-9治療前后表達(dá)的影響,探討芪水煎對(duì)肝損傷的作用,進(jìn)而探討肝腎同源性理論,從而指導(dǎo)臨床。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

雄性kk-ay小鼠24只(生產(chǎn)許可號(hào)：SXCK京2015-0008),8周齡,體重20～30 g,購自北京華阜康生物科技股份有限公司,飼養(yǎng)在首都醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科學(xué)部SPF級(jí)動(dòng)物室。實(shí)驗(yàn)小鼠隨機(jī)分為3組,即模型組、通心絡(luò)組、黃芪水紅花子組,每組8只;設(shè)立C57BL/6J小鼠8只為空白對(duì)照組。

1.2 藥物

芪水煎(臨床常用成人劑量為黃芪20 g、水紅花子5 g,購于北京同仁堂),按等效劑量換算,小鼠水紅花子生藥量0.75 g/(kg·d),黃芪生藥3 g/(kg·d),按照每100 g小鼠灌胃2 mL的體積配成相應(yīng)濃度,取黃芪和水紅花子加相當(dāng)于藥材量5倍的冷水浸泡1～2小時(shí),煮沸30分鐘,過濾。藥渣加3倍量水繼續(xù)煎煮,煮沸20分鐘,過濾,合并2次濾液。冷卻裝入滅菌藥瓶,高溫滅菌后,置4℃冰箱保存?zhèn)溆谩Ｍㄐ慕j(luò)超微粉(主藥為人參、水蛭、全蝎、土鱉蟲、蜈蚣、蟬蛻、赤芍等,由河北以嶺醫(yī)藥研究院有限公司提供)將通心絡(luò)超微粉溶解,按照每100 g小鼠灌胃2 mL的體積,配成相應(yīng)濃度,冷卻裝入滅菌藥瓶,高溫滅菌后,置4℃冰箱保存?zhèn)溆?.9%,氯化鈉溶液購自北京市普京康利科技有限公司,批號(hào)：150526。

1.3 試劑

MMP-9 antibody(Abcam、Ab38898)、TIMP-1 antibody(Abcam、Ab38978)、Goat anti rabbit IgG,(H+L)HRP 二 抗 (Jackson、111-035-003、B-Actin antibody(Abcam、Ab8227);RNA抽提試劑盒、oligo-(dT)、 Ribonuclease Inhibitor、 M-MLV Reverse Transcriptase、M-MLV Reverse Transcriptase 均購于Takara.。

1.4 儀器和設(shè)備

搖床(其林貝爾、TS-92)、電泳儀(Bio-rad、165-8004)、旋渦混合器(其林貝爾、QL-901)、Linegene熒光定量PCR檢測系統(tǒng)(杭州博日科技有限公司)、臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)TGL-16(湘儀離心機(jī))、DYY-7C型電泳儀(北京六一儀器廠)。

1.5 動(dòng)物模型制備及分組

本實(shí)驗(yàn)采用8周齡2型糖尿病kk-ay小鼠建立糖尿病腎病模型,設(shè)立C57BL/6J小鼠8只為空白組,空白組C57BL/6J小鼠予以普通飼料喂養(yǎng)、kk-ay小鼠予以高脂飼料喂養(yǎng)4周。4周后kk-ay小鼠隨機(jī)分為3組,即模型組、通心絡(luò)組、黃芪水紅花子組,每組8只。在保持造模不變的情況下,開始予藥物治療,黃芪水紅花子予芪水煎溶液2 mL/100 g灌胃,通心絡(luò)組予通心絡(luò)溶液2 mL/100 g灌胃,同時(shí)正常組及模型組予等量生理鹽水灌胃。治療1次/日,共11周。每周一稱量小鼠體重,隨體重變化更改造模及治療劑量。

1.6 樣本采集及處理

治療11周后,小鼠麻醉后,眼球取血,3500 r/min離心10分鐘,取上清分裝。打開腹腔,分離肝臟、腎臟,觀察形態(tài),稱重。取肝、腎組織,分裝入凍存管,-80℃低溫冰箱冷藏。

1.7 肝功監(jiān)測

檢測血清ALT、AST等肝功能指標(biāo)。

1.8 Western Blot法檢測小鼠肝、腎組織中MMP-9和TIMP-1蛋白含量

取肝、腎組織,BCA法蛋白定量,在 10%SDS-PAGE膠上電泳分離之后轉(zhuǎn)印至PVDF膜上,用5%脫脂奶粉封閉振蕩,一抗4℃孵育過夜,TBST搖床洗膜5分鐘×3次,二抗孵育,TBST搖床洗膜5分鐘×3次,ECL試劑暗室內(nèi)膠片曝光,掃描膠片,用圖像分析軟件分析目標(biāo)條帶。

1.9 Quantitative Real-time PCR檢測小鼠肝、腎組織MMP-9和TIMP-1的mRNA表達(dá)水平

取肝、腎組織,加入1 mL的Trizol,抽取待測樣品的RNA并進(jìn)行質(zhì)量檢測,采用oligo-(dT)試劑盒,將樣品RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA并進(jìn)行擴(kuò)增,記錄相應(yīng)的Ct值?；蛳鄳?yīng)表達(dá)量采用公式2-ΔΔCt方法計(jì)算。引物序列如下。

表1 引物序列

1.10 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理,結(jié)果用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x±s)表示,多組間比較采用單因素方差分析,組間兩兩比較采用最小顯著性差異法(LSD法),P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,P＜0.01為有顯著性差異。

2 結(jié)果

2.1 各組小鼠血清ALT、AST檢測結(jié)果對(duì)比

與正常組相比,模型組ALT升高(P＜0.05),AST顯著升高(P＜0.01);與模型組相比,芪水煎組AST顯著降低(P＜0.01),ALT呈下降趨勢,沒有統(tǒng)計(jì)意義;與模型組相比,通心絡(luò)組ALT、AST顯著升高(P＜0.01);與通心絡(luò)組相比,芪水煎組ALT、AST顯著降低(P＜0.01),見表2。

表2 小鼠ALT、AST比較(n=8,x±s,U/L)

2.2 各組小鼠肝、腎MMP-9、TIMP-1 mRNA表達(dá)檢測

與正常組相比,模型組肝、腎MMP-9表達(dá)顯著降低(P＜0.01),TIMP-1表達(dá)升高(P＜0.05);與模型組相比,芪水煎組肝 MMP-9表達(dá)顯著升高(P＜0.01),腎表達(dá)升高(P＜0.05),肝、腎 TIMP-1 表達(dá)降低(P＜0.05);與模型組相比,通心絡(luò)組肝MMP-9表達(dá)顯著升高(P＜0.01),腎表達(dá)升高(P＜0.05),肝、腎 TIMP-1 表達(dá)降低(P＜0.05);與通心絡(luò)組相比,芪水煎組肝 TIMP-1表達(dá)降低(P＜0.05),其他指標(biāo)沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見表3。

2.3 各組小鼠肝、腎MMP-9、TIMP-1的蛋白表達(dá)檢測

與正常組相比,模型組肝、腎MMP-9蛋白表達(dá)顯著降低(P＜0.01),肝、腎TIMP-1蛋白表達(dá)顯著升高(P＜0.01);與模型組相比,芪水煎組肝MMP-9蛋白表達(dá)顯著升高(P＜0.01)、腎MMP-9蛋白表達(dá)升高(P＜0.05),肝TIMP-1蛋白顯著降低(P＜0.01),腎表達(dá)降低(P＜0.05);與模型組相比,通心絡(luò)組肝MMP-9蛋白表達(dá)顯著升高(P＜0.01)、腎MMP-9蛋白表達(dá)升高(P＜0.05),肝、腎TIMP-1蛋白顯著降低(P＜0.01);與通心絡(luò)組相比,芪水煎組肝TIMP-1蛋白表達(dá)降低(P＜0.05)。見圖1。

表3 小鼠肝、腎MMP-9、TIMP-1 mRNA比較(n=8,x±s)

圖1 小鼠肝、腎MMP-9、TIMP-1蛋白表達(dá)水平

3 討論

《素問·陰陽應(yīng)象大論》曰“腎生骨髓,髓生肝”,明代李中梓《醫(yī)宗必讀》提出“乙癸同源,肝腎同源”理論,肝腎同居下焦,精血互生,母子相生[6],中醫(yī)理論揭示了肝腎在物質(zhì)方面相生相養(yǎng),生理功能上相互為用,互相調(diào)節(jié)制約的密切關(guān)系。正因如此,肝腎兩臟母子相生,精血相互轉(zhuǎn)化中一環(huán)出現(xiàn)問題,必然在病理上漸漸展現(xiàn)出肝腎同病的趨勢。在糖尿病發(fā)生發(fā)展慢性病程中,日久侵襲腎絡(luò),導(dǎo)致腎絡(luò)瘀滯,中醫(yī)認(rèn)為肝腎之氣互通、精血互化,故腎絡(luò)病變必然會(huì)導(dǎo)致肝的疏泄和藏血等功能受損,終致肝血行不暢從而發(fā)生肝絡(luò)瘀阻[7]。實(shí)驗(yàn)中糖尿病腎病模型小鼠AST、ALT升高,證明糖尿病腎病后期存在肝損傷,佐證了“肝腎同源”理論。

其次,糖尿病肝腎合病病理上關(guān)系復(fù)雜,兩者可互為因果,治療起來頗為棘手。臨床用藥亦需要兼顧疾病與防止肝腎功能損害。根據(jù)本課題組前期實(shí)驗(yàn)研究,臨床常用成人劑量黃芪20 g、水紅花子5 g效果最優(yōu),故本實(shí)驗(yàn)選用黃芪和水紅花子4∶1的配比組成的芪水煎進(jìn)行治療,黃芪、水紅花子是名老中醫(yī)關(guān)幼波臨床治療肝病方子中常用的中草藥,后經(jīng)錢英教授總結(jié)出來的藥對(duì),實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)黃芪可以緩解水鈉潴留,臨床上多用于治療糖尿病[8],黃芪多糖可有效保護(hù)糖尿病大鼠肝功,緩解肝細(xì)胞的損傷[9],水紅花子可以改善大鼠血清肝纖維指標(biāo)[10],依據(jù)絡(luò)病理論,糖尿病肝損傷的基本病機(jī)為氣虛血瘀,中醫(yī)理論認(rèn)為氣虛則血行無力,血行緩慢滯而為瘀,故瘀阻脈絡(luò),故用益氣活血通絡(luò)的黃芪,解毒通絡(luò)的水紅花子,兩者配伍益氣活血通絡(luò)。

糖尿病腎病主要的病理特征是腎小球及腎間質(zhì)的細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix,ECM)沉積,導(dǎo)致腎小球硬化及腎間質(zhì)纖維化,因此改善糖尿病腎病可以從 ECM降解系統(tǒng)著手[11],高糖狀態(tài)下,TIMP-1表達(dá)增加,MMPS/TIMPS失衡,大鼠肝纖維化程度加重[12]。MMPS/TIMPS是參與ECM降解過程的重要酶系,MMPs及其組織抑制劑在細(xì)胞外基質(zhì)的合成、降解及組織重塑過程中起決定性調(diào)節(jié)作用。MMPs屬于降解酶系,其中MMP-9是降解Ⅳ型膠原的最主要成分。TIMPs是MMPs的天然抑制劑,目前對(duì)TIMP-1的研究較為深入,在細(xì)胞因子的誘導(dǎo)下產(chǎn)生,與激活后的MMP-9以1∶1的方式形成復(fù)合體,從而抑制MMP-9的活性,阻斷其對(duì)ECM的降解,引起ECM沉積,使纖維化加重[13]。本研究結(jié)果顯示,經(jīng)芪水煎治療后小鼠肝、腎組織TIMP-1降低,減輕TIMP-1對(duì)MMP-9的抑制作用,MMP-9/TIMP-1失衡有所改善,促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)的降解,減少細(xì)胞外基質(zhì)的合成,改善肝、腎纖維化,提示芪水煎能夠抑制 kk-ay小鼠肝、腎組織纖維化,延緩病程。

實(shí)驗(yàn)研究表明,kk-ay小鼠后期存在肝損傷,為肝腎同源理論提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。芪水煎通過調(diào)控ECM降解酶系MMP-9/TIMP-1蛋白及mRNA表達(dá),減少肝、腎組織ECM沉積,保護(hù)肝腎功,具有減少用藥造成的肝腎損傷的優(yōu)勢。此外,作為誘發(fā)肝腎損傷的危險(xiǎn)因素高血糖,芪水煎對(duì)血糖代謝作用有待深入研究。

[1] 高磊,鄒志強(qiáng),孫榮玲,等.糖尿病在肝損傷患者中的危險(xiǎn)性分析[J].中國醫(yī)藥導(dǎo)報(bào),2012,9(30)：30-32.

[2] 韓文兵.基于“肝腎同源”理論探討柴黃益腎顆粒防治糖尿病肝腎并發(fā)癥的機(jī)制研究[D].北京：北京中醫(yī)藥大學(xué),2013.

[3] Lakshmanan AP,Thandavarayan RA,Watanabe K,et al.Modulation of AT-1R/MAPK cascade by an olmesartan treatment attenuates diabetic nephropathy in streptozotocin-induced diabetic mice[J].Mol Cell Endocrinol,2012,348(1)：104-11.

[4] 謝瑞奎,班博.非酒精性脂肪性肝病與2型糖尿病及糖尿病腎病關(guān)系的研究進(jìn)展[J].醫(yī)學(xué)綜述,2015,(1)：107-108.

[5] 李風(fēng)華.鱉甲煎丸對(duì)肝纖維化大鼠的治療作用及其對(duì)細(xì)胞因子 p38、CTGF、TIMP-1及MMP-9表達(dá)的影響[D].石家莊：河北醫(yī)科大學(xué),2013.

[6] 羅俊華,巴元明.“肝腎同源”理論的研究進(jìn)展[J].云南中醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào),2013,36(1)：91-93.

[7] 李光超,車念聰,耿建國,等.基于“肝腎同源”探討DN大鼠肝中TGF-β1、Smad-4、α-SMA和 PDGF在中藥治療前后的變化[J].中國中醫(yī)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)雜志,2014,(4)：459-461.

[8] 穆鑫,袁霞,康白,等.糖尿病大鼠腎臟水通道蛋白-2mRNA的表達(dá)及黃芪的調(diào)節(jié)作用[J].中國藥理學(xué)通報(bào),2010,26(9)：1176-1179.

[9] 王曉琳,翁孝剛,王憲華,等.黃芪多糖預(yù)防2型糖尿病大鼠肝損傷的實(shí)驗(yàn)研究[J].現(xiàn)代生物醫(yī)學(xué)進(jìn)展,2016,16(10)：1846-1849.

[10] 杜宇瓊,趙暉,張秋云,等.水紅花子對(duì)免疫肝纖維化大鼠肝功能及血清肝纖維化標(biāo)志物的影響[J].中國中醫(yī)急癥,2011,(9)：1433-1434.

[11] 鄒大威,高彥彬,劉迎新,等.糖腎寧對(duì)自發(fā)性2型糖尿病kkay小鼠腎組織MMP-9、TIMP-1表達(dá)的影響[J].環(huán)球中醫(yī)藥,2015,8(11)：1324-1328.

[12] 陳楓,楊愛萍,李燕,等.糖尿病對(duì)大鼠肝纖維化組織TIMP-1/MMP-1表達(dá)的影響[J].重慶醫(yī)學(xué),2013,42(9)：964-967.

[13] 余毅,李增棋,陳昆,等.烏司他丁對(duì)心臟聯(lián)合瓣膜置換術(shù)患者S100β蛋白及早期認(rèn)知功能障礙的影響[J].中國現(xiàn)代醫(yī)生,2015,(14)：74-77.

Effects of Qishui decoction on the expression of extracellular matrix regulatory factors in liver and kidney of diabetic nephropathy mice

LIU Ye,CHE Niancong,DU Yuqiong,et al.
the Capital Medical University,traditional Chinese medicine,Beijing 100069,China

Che Niancong,E-mail： cnc088@sohu.com

Objective To investigate the content changes of alanine aminotransferase(ALT)and aspartate aminotransferase(AST)of diabetic nephropathy(kk-ay)mice in later stage,and to investigate the influence of Qishui decoction on the expression of MMP-9,TIMP-1 in the hepatic and nephritic tissues based on the theory of“homogeny of liver and kidney”.Methods The diabetic nephropathy model was established by kk-ay mice with high glucose and high fat diet for 4 weeks.The mice were randomly divided into model group,Qishui group and Tongxinluo group,and C57BL/6J mice were used as control group.After 12 weeks of drug intervention,the level of ALT and AST was detected,and the protein and mRNA expressions of MMP-9 and TIMP-1 in liver and kidney were detected by Western Blot and realtime-PCR.Results Compared with the model group,the level of AST in Qishui group was significantly decreased(P＜0.01),while the level of ALT was decreased(P＞0.05).The protein and mRNA expression of MMP-9 in liver was significantly increased(P＜0.01),while the protein expression of TIMP-1 was significantly decreased(P＜0.01),and mRNA was decreased(P＜0.05).The protein and mRNAexpression of MMP-9 in kidney was increased(P＜0.05),while the protein and mRNA expression of TIMP-1 was decreased(P＜0.05).Conclusion kk-ay mice have liver injury in the later stage of diabetic nephropathy,and Qishui decoction has protective effects on liver and kidney injury in kk-ay mice.

Astragalus membranaceus; Fructus polygoni orientalis; Homogeny of liver and kidney; Hepatic injury; Matrix metalloproteinase-9; Tissue inhibitor of metalloproteinase-1

R285.5

A

10.3969/j.issn.1674-1749.2017.10.003

2017-03-10)

(本文編輯：王馨瑤)

國家重點(diǎn)基礎(chǔ)研究發(fā)展計(jì)劃(973計(jì)劃)(2012CB518602)

100069 北京,首都醫(yī)科大學(xué)中醫(yī)藥學(xué)院中醫(yī)臨床基礎(chǔ)學(xué)系[劉曄(碩士研究生)、車念聰、杜宇瓊、王金光(碩士研究生)、李文新(碩士研究生)]

劉曄(1992-),女,2015級(jí)在讀碩士研究生。研究方向：中醫(yī)肝病的證治規(guī)律研究。E-mail：liuye7562@163.com

車念聰(1957-),博士,教授,博士生導(dǎo)師,主任醫(yī)師。研究方向：中醫(yī)肝病。E-mail：cnc088@sohu.com