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Beclin 1和MAP1-LC3在家兔激素性股骨頭缺血壞死中表達的實驗研究

2017-09-27 12:56:47王文選趙振群劉萬林白銳
實用骨科雜志 2017年9期
關(guān)鍵詞:家兔骨細胞股骨頭

王文選,趙振群,劉萬林*,白銳

(1.內(nèi)蒙古醫(yī)科大學第二附屬醫(yī)院手足顯微外科,內(nèi)蒙古 呼和浩特 010030;2.內(nèi)蒙古醫(yī)科大學第二附屬醫(yī)院小兒骨科,內(nèi)蒙古 呼和浩特 010030)

實驗研究

Beclin 1和MAP1-LC3在家兔激素性股骨頭缺血壞死中表達的實驗研究

王文選1,趙振群2,劉萬林2*,白銳2

(1.內(nèi)蒙古醫(yī)科大學第二附屬醫(yī)院手足顯微外科,內(nèi)蒙古 呼和浩特 010030;2.內(nèi)蒙古醫(yī)科大學第二附屬醫(yī)院小兒骨科,內(nèi)蒙古 呼和浩特 010030)

目的觀察家兔激素性股骨頭缺血壞死模型中自噬相關(guān)基因Beclin 1和微管相關(guān)蛋白1輕鏈3(microtubule-associated protein 1 light chain 3,MAP1-LC3)的表達情況,探討自噬在激素性股骨頭缺血壞死中的作用。方法成年日本大耳白兔40只,隨機分為實驗組(n=28)與對照組(n=12)。實驗組肌肉注射甲基強的松龍7.5 mg/kg,2次/周,共8周;對照組肌肉注射生理鹽水2 mL/只,2次/周,共8周。8周后處死家兔,取雙側(cè)股骨頭。左側(cè)股骨頭制成普通病理切片后進行HE染色,用免疫組化法檢測Beclin 1和MAP1-LC3的表達;右側(cè)股骨頭迅速置于液氮中保存,蛋白提取后,采用Western blot方法檢測股骨頭中Beclin 1及MAP1-LC3蛋白的表達。結(jié)果HE染色顯示家兔激素性股骨頭壞死模型制造成功。免疫組化:實驗組Beclin 1和MAP1-LC3的陽性率分別為96.43%、92.86%,明顯高于對照組16.67%、8.33%,差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。Western blot檢測:實驗組與對照組比較Beclin 1及MAP1-LC3蛋白表達增高,差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。結(jié)論腎上腺皮質(zhì)激素造成的家兔早期股骨頭缺血壞死模型中,自噬基因Beclin 1和MAP1-LC3的表達增高,表明自噬參與了激素性股骨頭缺血壞死的發(fā)病。

糖皮質(zhì)激素;骨壞死;自噬;Beclin 1;微管相關(guān)蛋白1輕鏈3

激素性股骨頭缺血壞死(steroid-induced avascular necrosis of femoral head,SANFH)是指因長期或短期大量使用腎上腺皮質(zhì)激素(以下簡稱激素)后造成股骨頭活性成分死亡所引起的病理過程。SANFH占非創(chuàng)傷性股骨頭缺血壞死病因的首位。關(guān)于SANFH的發(fā)病機制已有多種假說,包括:骨內(nèi)壓增高、骨的灌注下降、脂肪栓塞、高凝狀態(tài)等[1]。近年來,國內(nèi)外學者把焦點集中于Ⅰ型程序性細胞死亡-細胞凋亡在SANFH中的作用的研究[2-3],研究表明細胞凋亡參與了SANFH的發(fā)病[4-9]。

自噬現(xiàn)象最早是Ashford和Porten于1962年在肝細胞中觀察到的,他們將高血糖素加入鼠的肝灌流液中,結(jié)果在電鏡下發(fā)現(xiàn)肝細胞的溶酶體增多并發(fā)生自食現(xiàn)象,De Duve將該現(xiàn)象命名為“autophagy(自噬)”。自噬是機體選擇性降解細胞內(nèi)成分的基本過程,當細胞遭受應(yīng)激時,自噬可維持細胞的存活,但是當這種應(yīng)激超過一定水平時,自噬還可導致非凋亡形式的自噬性程序性細胞死亡,因其有別于凋亡而被稱為Ⅱ型程序性細胞死亡[10]。已有研究表明,激素既可以誘導骨細胞發(fā)生凋亡又可以誘導骨細胞發(fā)生自噬[11-12],但研究只是局限于激素導致的骨質(zhì)疏松模型中以及經(jīng)激素刺激體外培養(yǎng)的骨細胞中。國內(nèi)外未見到在SANFH模型中研究自噬表達的相關(guān)報道。研究表明自噬基因Beclin 1可以調(diào)節(jié)自噬活性[13],微管相關(guān)蛋白1輕鏈3(microtubule-associated protein 1 light chain 3,MAP1-LC3)作為自噬的標志性分子,已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于自噬活性的檢測。因此,本實驗通過檢測家兔SANFH模型的股骨頭組織中Beclin 1及MAP1-LC3的表達,探討自噬在SANFH中的作用,從而可能為治療SANFH提供新的分子靶標。

1 資料與方法

1.1 實驗動物及分組 成年日本大耳白兔(北京富豪動物養(yǎng)殖中心提供,合格證編號:20100137)40只,體重為(2.32+0.14)kg,隨機分為實驗組(n=28)與對照組(n=12),雌雄不限。實驗組肌肉注射甲基強的松龍7.5 mg/kg,2次/周,共8周;對照組肌肉注射生理鹽水2 mL/只,2次/周,共8周。8周后用空氣栓塞法處死兩組家兔,取雙側(cè)股骨頭,沿冠狀面剖開。左側(cè)股骨頭置于4%多聚甲醛溶液固定24 h,右側(cè)股骨頭立即置于液氮中保存。

1.2 實驗方法

1.2.1 微波脫鈣 將左側(cè)股骨頭組織放入小燒杯內(nèi),加入10%乙二胺四乙酸(ethylenediaminetetraacetic acid,EDTA)脫鈣液,以微波2檔(溫度為40~60℃)間歇脫鈣,每次輻射1 min,每次輻射之間都將燒杯移至室溫冷卻15 min,并更換新液。脫鈣時間為1 min/次,20次/d,共7 d;以大頭針能夠刺進骨密質(zhì)為完成脫鈣標準。

1.2.2 組織形態(tài)學觀察 左側(cè)股骨頭經(jīng)4%多聚甲醛溶液固定24 h后,在10%EDTA脫鈣液中微波脫鈣7 d,梯度乙醇脫水,石蠟包埋,制成厚5 μm切片。取左側(cè)一半股骨頭做常規(guī)HE染色,待中性樹膠封片后將上述切片分別置于100倍及400倍光鏡下觀察組織病理學改變;左側(cè)另一半股骨頭用作免疫組化實驗。

1.2.3 免疫組化方法檢測股骨頭Beclin 1及MAP1-LC3的表達 采用SABC法,滴加兔抗兔Beclin 1多克隆抗體和兔抗兔MAP1-LC3多克隆抗體,20℃放置2 h,滴加辣根過氧化酶標記的山羊抗兔IgG,37℃放置20 min,使用二氨基聯(lián)苯胺(diaminobenzidine,DAB)顯色試劑盒(AR1022)顯色,磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered solution,PBS)代一抗作陰性對照,蘇木素復染,梯度酒精中脫水、透明,中性樹膠封片后在顯微鏡下觀察。股骨頭組織免疫組化結(jié)果的分析:所有組織切片均采用盲法由兩位病理科醫(yī)生獨立閱片,以胞漿內(nèi)或細胞膜上出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽性細胞。隨機觀察10個高倍鏡視野,每個視野計數(shù)50個細胞。根據(jù)陽性細胞的比率和染色深度分別進行評估,最后綜合評定。

1.3 Western blot檢測股骨頭骨組織中Beclin 1和MAP1-LC3蛋白的表達水平 將右側(cè)股骨頭電子天平迅速稱重,于液氮中研碎后加入細胞裂解液冰上裂解30 min,收集到的上清即為總蛋白,然后用二辛可寧酸(bicinchonininc acid,BCA)法測定蛋白濃度??偟鞍走M行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis,SDS-PAGE),然后電轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯(polyvinylidene fluoride,PVDF)膜,用濃度5%的脫脂奶粉室溫封閉2 h,三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽吐溫緩沖液(tris-buffered saline with tween,TBST)洗膜后分別加入兔抗兔Beclin 1多克隆抗體和兔抗兔MAP1-LC3多克隆抗體,4℃孵育過夜,加入含有山羊抗兔二抗(1︰500)孵育2 h。經(jīng)電化學發(fā)光(electro-chemi-luminescence,ECL)顯色,X線片放射自顯影,掃描,照片。用凝膠圖像掃描系統(tǒng)對顯影膠片進行吸光度的掃描。用ImageJ 2x軟件分析各條條帶的灰度值,然后將目的蛋白灰度值與內(nèi)參β-actin的灰度值進行比較,根據(jù)條帶的相對灰度值進行統(tǒng)計學分析,實驗結(jié)果重復3次以上。

2 實驗結(jié)果

2.1 組織學觀察 對照組(見圖1a、1c):骨小梁結(jié)構(gòu)清晰完整,粗大且排列規(guī)則,髓腔中脂肪細胞較少,造血細胞豐富,空骨陷窩少見;實驗組(見圖1b、1d):骨小梁稀疏變細、甚至斷裂,髓腔中脂肪細胞增多、肥大,造血細胞數(shù)量減少,空骨陷窩數(shù)量明顯多于對照組。家兔股骨頭組織病理學改變顯示,SANFH模型制造成功。

2.2 免疫組化結(jié)果 細胞漿或者細胞膜內(nèi)出現(xiàn)黃色或棕黃色顆粒即為Beclin 1和MAP1-LC3陽性細胞(見圖2~3)。Beclin 1在實驗組中表達的陽性率為96.43%,而在對照組中表達的陽性率為16.67%;MAP1-LC3在實驗組中表達的陽性率為92.86%,而在對照組織中表達的陽性率為8.33%(見表1)。Beclin 1和MAP1-LC3在實驗組中的表達均較對照組高,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

2.3 Western blot檢測 采用Western blot法檢測股骨頭骨組織中Beclin 1和MAP1-LC3蛋白的表達水平,根據(jù)目的蛋白分子量大小,在相應(yīng)位置出現(xiàn)目的條帶(見圖4)。結(jié)果顯示以β-actin做內(nèi)參,Beclin 1和MAP1-LC3蛋白在實驗組的相對灰度值分別為(1.604 7±0.007 0)、(2.582 0±0.005 7),高于對照組中的相對灰度值(0.792 1±0.006 2)、(0.989 4±0.003 6),差異有統(tǒng)計學意義(t值分別為194.641、526.210,P<0.05)。表明Beclin 1和MAP1-LC3蛋白在實驗組中的表達較對照組增高。

表1 Beclin 1和MAP1-LC3實驗組與對照組中的表達(例,%)

3 討 論

自噬是依賴溶酶體的細胞器或細胞質(zhì)成分的降解途徑,是細胞通過降解自身成分以維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定的基本過程[14]。自噬可被多種形式的細胞應(yīng)激所激活,其中包括:營養(yǎng)物質(zhì)缺乏、激素、缺氧、活性氧、脫氧核糖核酸(deoxyribonucleic acid,DNA)損傷、蛋白質(zhì)聚集體、損傷的細胞器或細胞內(nèi)的病原體等。當細胞遭受以上這些應(yīng)激時,自噬過程被激活,試圖去維持細胞存活[15]。自噬過程一旦啟動,部分胞漿和胞質(zhì)內(nèi)的細胞器進入自噬泡中,最終進入溶酶體內(nèi)大量的降解[16]。在代謝應(yīng)激時,自噬提供腺嘌呤核苷三磷酸(adenosine triphosphate,ATP)或其他的大分子作為能量資源增加細胞存活能力,但是當代謝應(yīng)激的強度過大或持續(xù)時間過長時,細胞可能會發(fā)生自噬性程序性細胞死亡[17]。自噬作用就像一把“雙刃劍”,在已有的研究中,既有自噬促進細胞存活的報道又有其導致細胞死亡的報道[18-19],這依賴于細胞的種類和應(yīng)激的水平及持續(xù)時間。無論在細胞還是動物實驗中,MAP1-LC3Ⅱ結(jié)構(gòu)均是公認的自噬體膜存在的標記物[20]。研究表明,MAP1-LC3Ⅱ在細胞中的含量或MAP1-LC3Ⅱ/MAP1-LC3Ⅰ的比例和自噬泡的數(shù)目呈正相關(guān)[21]。本實驗分別采用免疫組化和Western blot兩種方法檢測家兔SANFH模型中MAP1-LC3的表達。在免疫組化結(jié)果中顯示SANFH模型中MAP1-LC3表達的陽性率較對照組增高;Western blot結(jié)果同樣證明SANFH模型中MAP1-LC3Ⅱ蛋白含量較對照組增高。實驗結(jié)果顯示SANFH模型中自噬的表達增高,表明自噬參與了SANFH的發(fā)病。

a 對照組(×100) b 實驗組(×100)

c 對照組(×400) d 實驗組(×400)

a 對照組(×400) b 實驗組(×400)

a 對照組(×400) b 實驗組(×400)

圖4 Western blot結(jié)果

研究表明,激素可同時誘導骨細胞發(fā)生細胞凋亡和自噬[11,22],骨細胞的命運與激素的劑量有關(guān),較低劑量的激素激活自噬,而高劑量的激素則增強凋亡。Jia等[22]用潑尼松龍緩釋劑埋置在雄性Swiss-Webster小鼠皮下,按緩釋劑類型分為低、中、高劑量組,28 d后觀察到低劑量GC組的小鼠與安慰劑組的小鼠相比較,在股骨遠端的皮質(zhì)骨區(qū)域中骨細胞自噬明顯增加,而在高劑量組的皮質(zhì)骨中觀察到骨細胞凋亡明顯增加。Xia等[11]用內(nèi)源性蛋白降解抑制劑3-甲基腺嘌呤(3-methyl adenine,3-MA)抑制骨細胞的自噬過程,可以觀察到骨細胞死亡數(shù)量的增加。由此認為,在持續(xù)時間短的或緩和的應(yīng)激條件下,自噬很可能作為一種保護性機制對抗細胞的死亡;在持續(xù)時間較長的或者激烈的應(yīng)激條件下,細胞內(nèi)可產(chǎn)生大量的自噬體,這些自噬體的堆積可導致細胞發(fā)生死亡。但以上實驗只是以骨質(zhì)疏松為模型和體外培養(yǎng)骨細胞來研究探討自噬過程,國內(nèi)外尚未見關(guān)于自噬在SANFH中表達的相關(guān)報道。所以本實驗使用腎上腺皮質(zhì)激素造成家兔早期SANFH模型,通過檢測股骨頭中自噬標記物MAP1-LC3的表達來觀察自噬在SANFH中的表達情況,實驗檢測到實驗組中MAP1-LC3的表達均較對照組增高,表明早期SANFH中存在細胞凋亡和自噬的增強。由此我們推測:當GC劑量較低或療程較短時,自噬過程被激活,可成功的使受損的骨細胞得以存活,不容易導致SANFH發(fā)生;然而當GC使用時間增加和劑量增大時,自噬過程減弱,甚至會發(fā)生自噬性程序性細胞死亡,骨細胞存活能力降低,加之細胞凋亡的增加,致使SANFH發(fā)生或進一步發(fā)展。Almonte-Becerril等[23]在骨關(guān)節(jié)炎實驗?zāi)P偷难芯恐凶C實:在骨關(guān)節(jié)炎早期軟骨細胞自噬活性增高,作為一種適應(yīng)性反應(yīng)去避免軟骨細胞死亡,而到骨關(guān)節(jié)炎晚期階段,細胞自噬和細胞凋亡可共同導致軟骨細胞死亡的增加,最終導致疾病的加重,這一結(jié)論與我們的推斷相一致。

Beclin 1基因是酵母自噬相關(guān)基因6在哺乳動物中的同源物。Liang等[24]于1998年在致死性Sinbis病毒性腦炎的大鼠模型中發(fā)現(xiàn)一種分子量大小為60 kd的蛋白質(zhì),并將編碼這種蛋白的基因命名為Beclin 1,同時證實在哺乳動物的細胞中通過上調(diào)Beclin 1基因的表達可以刺激自噬的發(fā)生。Aita等[25]于1999年發(fā)現(xiàn)編碼這種蛋白的基因Beclin 1位于人類17q21染色體上,并成功的克隆了Beclin 1基因,發(fā)現(xiàn)Beclin 1基因與酵母的自噬基因atg6/vps30有高度的同源性。Beclin 1對自噬蛋白在前自噬體結(jié)構(gòu)的定位上起到關(guān)鍵性作用,這一過程依賴于Beclin 1與磷脂酰肌醇3-激酶(phosphatidylinositol 3-kinase,PI3-K)的相互作用,他們共同形成Beclin 1-Vps34-Vps15復合物而進一步調(diào)節(jié)自噬活性[26]。研究表明:B淋巴細胞瘤-2基因(B-cell lymphoma-2,bcl-2)可與Beclin l結(jié)合而抑制自噬的活性,因Beclin 1可與Bcl-2家族中抑制凋亡的蛋白相結(jié)合,而不能和促進凋亡的蛋白相結(jié)合。在研究Beclin 1分子結(jié)構(gòu)時發(fā)現(xiàn),Beclin 1蛋白具有Bcl-2家族中促凋亡蛋白共有的Bcl-2同源結(jié)構(gòu)域3(Bcl-2 homology domain 3,BH3)結(jié)構(gòu)[27],因此認為Beclin l可能同時參與自噬與凋亡的調(diào)節(jié)。實驗同樣采用免疫組化和Western blot兩種方法對SANFH模型中Beclin 1的表達進行檢測,結(jié)果顯示兩種方法測得的Beclin 1的表達均較對照組增高,證明Beclin 1基因參與了SANFH的發(fā)病。然而,Beclin 1基因是如何調(diào)節(jié)細胞凋亡及自噬在SANFH各階段中的表達,以及細胞凋亡及自噬在SANFH整個病理過程中的相互作用有待更進一步研究。

綜上所述,本研究通過在家兔SANFH模型股骨頭中檢測Beclin 1和MAP1-LC3的表達,結(jié)果證實自噬參與了SANFH的發(fā)病,Beclin 1通過調(diào)節(jié)自噬的表達進而調(diào)節(jié)SANFH的發(fā)病進程。本實驗未能在激素性股骨頭壞死造模過程中的各個時間點檢測Beclin 1和MAP1-LC3的表達,未能夠在同一時間點比較細胞凋亡與自噬在SANFH發(fā)病過程中的表達,從而不能詳細了解自噬及Beclin 1在SANFH發(fā)病過程中的每個階段的作用,以及細胞凋亡及自噬在這一疾病中的相互作用。深入探討B(tài)eclin 1參與SANFH發(fā)生發(fā)展的分子病理機制,尤其是在細胞自噬和凋亡中的作用,有助于明確SANFH生物學行為及發(fā)病機理,有望為SANFH的臨床治療提供新的分子靶標。

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AnExperimentalStudyontheExpressionofBeclin1andMAP1-LC3inAvascularNecrosisoftheFemoralHeadInducedbyGlucocorticoids

Wang Wenxuan1,Zhao Zhenqun2,Liu Wanlin2,et al

(1.Department of Hand and Foot Surgery,Second Affiliated Hospital of Inner Mongolia Medical University,Hohhot 010030,China;2.Department of Pediatric Orthopedics,Second Affiliated Hospital of Inner Mongolia Medical University,Hohhot 010030,China)

ObjectiveTo investigate the expression of autophagy-related gene Beclin 1 and microtubule-associated protein 1 light chain 3(MAP1-LC3)in avascular necrosis of the femoral head model induced by glucocorticoids,and explore the role of autophagy in avascular necrosis of the femoral head model induced by glucocorticoids.MethodsForty mature Japanese rabbits were randomly divided into experimental group(n=28)and control group(n= 12).The experimental group was given an intramscular injection of 7.5 mg/kg of methylprednisolone twice per week for 8 weeks in all;the control group was given equal isotonic Na chloride.Rabbits of each group were killed at the 8th week respectively,and the hibateral heads of femur were taken out.The left heads of femur were made into general sections,dyed by HE.The expression of Beclin-1 and MAP1-LC3 were detected by immunohistochemical method.The right heads of femur were put into liquid nitrogen quickly,protein were extracted from bone tissue,right head of femur was detected the protein expression of Beclin 1 and MAP1-LC3 by Western blot.ResultsHematoxylin and eosin stain showed the successfuluccessful production of steroid induced avascular necrosis of the femoral head in rabbits.The expression of Beclin l and MAPI-LC3 in the experimental group were 96.43%and 92.86% respectively,and the expression of Beclinl and MAPI-LC3 in the control group were 16.67%and 8.33% respectively.And the difference was significant (P<0.05).Compared to the control group,the protein expression of Beclinl and MAPI-LC3 increased remarkably in the experimental group,the difference was significant (P<0.05).ConclusionAdrenal cortex hormones cause the rabbits early avascular necrosis of the femoral head,Beclin 1 and MAP1-LC3 expression increased.This study suggests that autophagy may play an important role in the development of femoral head model induced by glucocorticoids.

gucocorticoids;osteonecrosis;autophagy;Beclin 1;microtubule-associated protein 1 light chain 3

1008-5572(2017)09-0811-05

國家自然科學基金(81360273);*本文通訊作者:劉萬林

R681.8

:A

2017-02-22

王文選,趙振群,劉萬林,等.Beclin 1和MAP1-LC3在家兔激素性股骨頭缺血壞死中表達的實驗研究[J].實用骨科雜志,2017,23(9):811-815.

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