羅本華 羅梅桂 張亞飛 王 燕

(廣西中醫(yī)藥大學(xué)，廣西 南寧 530001)

“益氣調(diào)血、扶本培元”藥線灸對(duì)多發(fā)梗死性癡呆大鼠海馬乙酰膽堿、乙酰膽堿酯酶、膽堿乙酰轉(zhuǎn)移酶含量的影響

羅本華 羅梅桂1張亞飛2王 燕2

(廣西中醫(yī)藥大學(xué)，廣西 南寧 530001)

目的觀察“益氣調(diào)血、扶本培元”藥線灸對(duì)多發(fā)梗死性癡呆(MID)大鼠海馬乙酰膽堿(ACh)、乙酰膽堿酯酶(AChE)、膽堿乙酰轉(zhuǎn)移酶(ChAT)含量的影響。方法100只雄性大鼠經(jīng)MID造模、癡呆篩選后，隨機(jī)分為正常組、模型組、假手術(shù)組、藥線灸組、藥物組和藥線非穴組6組，各組10只；藥線灸組予壯醫(yī)藥線點(diǎn)灸治療，藥物組給予多奈哌齊口服治療，藥線非穴組給予針刺兩肋下非穴點(diǎn)治療，余3組未給予特別治療。經(jīng)4 w干預(yù)后處死動(dòng)物，分離海馬，勻漿、分離上清，檢測(cè)ACh、AChE與ChAT含量。結(jié)果模型組ACh、ChAT含量較正常組顯著降低，AChE含量顯著升高(P<0.05)；藥線穴組與模型組ACh、AChE無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)，藥線灸組能顯著升高ACh、ChAT和降低AChE含量，而藥物組只顯著升高ACh和降低AChE含量(P<0.05)；藥物組與藥線灸組比較無差異(P>0.05)。結(jié)論“益氣調(diào)血、扶本培元”藥線灸可以全面改善MID大鼠海馬ACh代謝障礙，且較多奈哌齊有療效優(yōu)勢(shì)。

藥線灸；血管性癡呆(VD)；乙酰膽堿(ACh)；乙酰膽堿酯酶(AChE)；鹽酸多奈哌齊

血管性癡呆(VD)以大腦認(rèn)知功能損害為核心癥狀的一種慢性進(jìn)行性疾病〔1〕，是癡呆的第二大原因〔2〕，也有報(bào)道是亞洲國(guó)家癡呆的首發(fā)原因〔3〕。研究表明針灸治療VD具有療效確切、安全、無毒副作用等優(yōu)點(diǎn)〔4〕。本實(shí)驗(yàn)觀察“益氣調(diào)血、扶本培元”藥線灸對(duì)多發(fā)梗死性癡呆(MID)大鼠海馬乙酰膽堿(ACh)、乙酰膽堿酯酶(AChE)及膽堿乙酰轉(zhuǎn)移酶(ChAT)含量的影響。

1 材料與方法

1.1材料與試劑 健康SPF級(jí)Wistar雄性大鼠100只，體重(280±20)g，由廣西醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供；室溫18～22℃，相對(duì)濕度45%，室內(nèi)采光按照白晝循環(huán)模式，標(biāo)準(zhǔn)粒飼料定時(shí)喂養(yǎng)，自由飲水，適應(yīng)性喂養(yǎng)15 d。大鼠AChE、ACh、ChAT酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)試劑盒96T(武漢基因美生物科技有限公司)；水合氯醛AR250G(No.SHLQ-250)；鹽酸多奈哌齊〔5 mg/片，衛(wèi)材(中國(guó))藥業(yè)有限公司制造，國(guó)藥準(zhǔn)字H20050978〕，由廣西中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院制劑室協(xié)助配成濃度為10%的藥液。高速冷凍離心機(jī)(TGL-16M)，酶標(biāo)儀(芬蘭LabsystemsMultiskan MS公司)，洗板機(jī)(芬蘭ThermoLabsystems公司)，微量高速離心機(jī)(國(guó)產(chǎn))，HH.CP-01W隔水式恒溫培養(yǎng)箱(國(guó)產(chǎn))，PR0200電動(dòng)玻璃勻漿儀(No.FLUKO)，Morris水迷宮(中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥物研究所)。

1.2動(dòng)物分組 采用隨機(jī)數(shù)字表法將100只大鼠隨機(jī)分為正常組10只、假手術(shù)組10只和預(yù)用栓子造模組80只；栓子造模組在經(jīng)過Morris水迷宮篩選出癡呆鼠40只，隨機(jī)分為模型組、藥線灸組、藥物組和藥線非穴組，各組10只。

1.3MID造模方法〔5〕取同種大鼠股動(dòng)脈采血，無菌條件下于37℃溫箱內(nèi)自然干燥24 h，用100目篩子過篩，制備200 μm以下的血凝塊備用。應(yīng)用時(shí)每10 mg血栓加0.3 ml生理鹽水制成混懸液。3.5%水合氯醛按35 mg/100 g體重腹腔麻醉。頸正中切開皮膚(約1 cm)，剝離胸骨舌骨肌、肩胛舌骨肌與胸骨乳突肌，暴露頸外動(dòng)脈，分離頸外動(dòng)脈上兩分支，避開兩分支，分別在頸外動(dòng)脈上備2根手術(shù)縫合線，結(jié)扎遠(yuǎn)心端，近心端先套一活結(jié)。用兒科4號(hào)頭皮針針頭逆行穿刺右頸外動(dòng)脈至右頸內(nèi)動(dòng)脈起始處，隨即用1 ml注射器緩慢(60～90 s)注入栓子鹽水懸液0.3 ml，使栓子通過頸內(nèi)動(dòng)脈進(jìn)入顱內(nèi)至大腦各動(dòng)脈，造成MID，然后結(jié)扎頸外動(dòng)脈，縫合皮膚。切口處滴注慶大霉素抗感染。假手術(shù)組手術(shù)方法同模型制作，只是注射時(shí)以生理鹽水0.3 ml代替栓子溶液。

1.4模型篩選 栓子造模組于造模后7 d進(jìn)行Morris水迷宮隱蔽平臺(tái)試驗(yàn)〔6〕，連續(xù)訓(xùn)練5 d，1次/d。取第5天正常組大鼠逃避潛伏期的均值為參考值，同時(shí)計(jì)算栓子造模組大鼠第5天的平均逃避潛伏期與參考值之差占該鼠的平均逃避潛伏期時(shí)間的比值，>20%定義為癡呆鼠。只有符合癡呆條件的動(dòng)物才用于本課題MID模型。

1.5針刺干預(yù)方法及療程 ①藥線灸組：治則：益氣調(diào)血，扶本培源。取穴：按“益氣調(diào)血、扶本培元”針法取穴，即按照華興邦動(dòng)物穴位圖譜，取膻中、中脘、氣海及雙側(cè)血海、足三里。藥線灸操作方法：按《壯醫(yī)藥線灸療法》〔7〕采用2號(hào)藥線(直徑0.5 mm)，輕刺激手法點(diǎn)灸，按先上后下、先軀干再四肢、先陽后陰：次序點(diǎn)灸以上相應(yīng)腧穴各1壯。②模型組：給予藥線灸組相同時(shí)間、相同程度的捉抓刺激。③藥線非穴組：選取雙側(cè)肋下2個(gè)固定非穴點(diǎn)，針刺雙側(cè)肋下各兩個(gè)固定非穴點(diǎn)〔8〕，約相當(dāng)于乳正中線外開2.5 mm肋弓下1 mm平行肋弓方向向外下斜刺3 mm；作為對(duì)照刺激點(diǎn)，輕刺激手法藥線灸左3右4壯，或左4右3壯，交替。④假手術(shù)組：給予藥線灸組相同時(shí)間、相同程度的捉抓刺激。⑤正常組：給予藥線灸組相同時(shí)間、相同程度的捉抓刺激。⑥藥物組：于造模并癡呆篩選后將1 mg·kg-1·d-1鹽酸多奈哌齊溶于2 ml生理鹽水中灌胃，于每日早晨8∶00灌胃。以上各組于模型篩選后開始按相應(yīng)干預(yù)方法治療，每日治療1次，每周6次，共治4 w。

1.6大鼠海馬取材方法 實(shí)驗(yàn)干預(yù)方案完成后，即斷頭處死動(dòng)物，開顱迅速取出整個(gè)腦組織，在冰上分離各組大鼠海馬組織，在冰冷生理鹽水中洗去血液，在電子天平上稱重后置于-80℃冰凍保存?zhèn)溆茫邢嚓P(guān)檢測(cè)。

1.7ACh、AChE與ChAT含量測(cè)定 標(biāo)本融化后保持6℃的溫度備用，以0.1 g加0.9 ml磷酸鹽緩沖液(PBS)(pH7.4)比例加入PBS液，用超聲勻漿器冰上將標(biāo)本勻漿充分，離心5 min(3 000 r/min)，仔細(xì)收集上清，分裝后待檢測(cè)。采用雙抗體夾心法檢測(cè)ACh、AChE與ChAT含量；按ACh、AChE與ChAT相應(yīng)試劑盒步驟進(jìn)行檢測(cè)。

1.8統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS16.0軟件進(jìn)行單因素方差分析。

2 結(jié) 果

模型組與正常組、假手術(shù)組比較，ACh含量顯著降低，AChE顯著增高(P<0.01)，而正常組與假手術(shù)組比較無差異(P>0.05)；藥線非穴組與模型組ACh、AChE無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)；藥物組、藥線非穴組與模型組ChAT無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。藥物組、藥線灸組分別與模型組、藥線非穴組比較，ACh含量顯著升高，AChE顯著降低(P<0.05)；藥物組與藥線灸組比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。藥線灸組分別與模型組、藥線非穴組比較ChAT含量均有顯著升高(P<0.05)，并具有穴位特異性，但與正常組比較無差異(P>0.05)，已接近正常組水平；藥物組與藥線灸組比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。見表1。

表1 各組大鼠海馬ACh、AChE與ChAT含量比較

與模型組比較:1)P<0.05，2)P<0.01；與藥線非穴組比較：3)P<0.05，4)P<0.01；與正常組比較:5)P<0.05

3 討 論

膽堿能傳導(dǎo)通路受損可引起膽堿能缺陷和學(xué)習(xí)記憶功能障礙〔9，10〕。而ACh是膽堿能傳導(dǎo)通路的重要神經(jīng)遞質(zhì)，腦內(nèi)Ach存在于膽堿能神經(jīng)元囊泡中；由ChAT合成，AChE分解，通過ACh受體發(fā)揮生物效應(yīng)，在記憶、思維和智力中起著不可替代的作用。VD的膽堿能系統(tǒng)受損機(jī)制可能是由于缺血缺氧影響葡萄糖氧化代謝，使丙酮酸生成減少，從而使乙酰輔酶A生成減少，而后者為ACh的合成原料，最終導(dǎo)致ACh合成不足〔11〕，因而ACh是進(jìn)行及維持高級(jí)神經(jīng)功能的一種重要神經(jīng)遞質(zhì)，ACh濃度升高有利于學(xué)習(xí)記憶的恢復(fù)，有利于改善癡呆癥狀〔12〕，是直接反映學(xué)習(xí)記憶能力的指標(biāo)。AChE是ACh的水解酶，為觀察膽堿能神經(jīng)元的一個(gè)重要指標(biāo)；ChAT是細(xì)胞內(nèi)催化ACh合成的關(guān)鍵酶，在膽堿能神經(jīng)元胞體內(nèi)合成，與ACh分布幾乎平行，常作為研究膽堿能神經(jīng)元的標(biāo)志或評(píng)估ACh含量的間接指標(biāo)〔13〕；此二者相輔相成共同維持腦內(nèi)ACh含量的動(dòng)態(tài)平衡。腦缺血時(shí)AChE釋放過多，分解ACh增強(qiáng)，導(dǎo)致ACh濃度降低，促進(jìn)癡呆的發(fā)生〔14〕，因此通過抑制AChE活性，有利于改善VD癥狀。研究發(fā)現(xiàn)，VD 患者海馬區(qū)和顳葉AChE有不同程度活性升高〔15〕。免疫組化染色發(fā)現(xiàn)，VD大鼠模型海馬各區(qū)ChAT陽性神經(jīng)元和纖維數(shù)量明顯減少，且與大鼠的學(xué)習(xí)記憶障礙程度呈正相關(guān)〔16〕。MID模型是國(guó)內(nèi)外認(rèn)可的VD動(dòng)物模型之一，具備VD最核心的認(rèn)知行為學(xué)障礙，是進(jìn)行VD基礎(chǔ)研究和療效評(píng)價(jià)的理想模型〔17,18〕。本實(shí)驗(yàn)證明：MID模型組大鼠海馬ACh含量及ChAT活性較正常組大鼠明顯降低，AChE活性顯著性升高，是模擬VD的認(rèn)知功能障礙和中樞膽堿能系統(tǒng)受損機(jī)制的理想模型，是本實(shí)驗(yàn)研究可行的保證。

“益氣調(diào)血、扶本培元”該治則是基于“VD是與老年相關(guān)的、涉及三焦多個(gè)臟腑多臟器相關(guān)并夾雜諸多病理產(chǎn)物的疾病”、“三焦氣化失常與衰老相關(guān)論”〔19〕提出的，并隨筆者三焦與腦神經(jīng)病變的理論及“三焦與癡呆的發(fā)病觀、病機(jī)觀及取穴優(yōu)選”而相對(duì)完善〔20〕。“益氣調(diào)血、扶本培元”藥線灸又基于“益氣調(diào)血、扶本培元”針法的成熟，該針法經(jīng)歷幾十年臨床及臨床研究肯定療效，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)肯定了取穴優(yōu)選、改善VD認(rèn)知功能和改善VD發(fā)病的中樞ACh代謝障礙機(jī)制。而在此基礎(chǔ)上，數(shù)年來筆者發(fā)展為壯醫(yī)藥線灸方法的有效方法，在VD治療上，臨床已取得改善VD患者認(rèn)知功能的證據(jù)〔21,22〕，實(shí)驗(yàn)提示該療法的有效性。壯醫(yī)藥線灸療法操作較麥粒灸等著膚灸簡(jiǎn)便，而不失著膚灸之功，保持了歷代灸法尤其直接灸養(yǎng)生保健、抗老防衰的功用，是臨床卓越的抗衰防老和防治VD的方法；此藥線灸法防治VD具有從“三焦氣化”論治VD的發(fā)病觀、病機(jī)觀、防治觀與“益氣調(diào)血，扶本培元”治則、組穴優(yōu)選、臨床療效和實(shí)驗(yàn)機(jī)理的基礎(chǔ)；本藥線灸法顯示的多途徑、多靶點(diǎn)和多層次作用于VD的中樞ACh代謝障礙機(jī)制，是本實(shí)驗(yàn)取得更佳療效的關(guān)鍵。

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〔2016-08-25修回〕

(編輯 苑云杰/曹夢(mèng)園)

R749

A

1005-9202(2017)18-4467-03；doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2017.18.015

廣西壯族自治區(qū)衛(wèi)生廳中醫(yī)藥科技專項(xiàng)任務(wù)書(No.GZZY13-06)；廣西中醫(yī)藥大學(xué)重大課題(No.ZD12005)

1 2013級(jí)針灸碩士研究生 2 2014級(jí)針灸碩士研究生

羅本華(1968-)，男，醫(yī)學(xué)博士，主任醫(yī)師，碩士生導(dǎo)師，主要從事中醫(yī)及壯醫(yī)針灸防治神經(jīng)系統(tǒng)疾病基礎(chǔ)與臨床研究。