張應(yīng)愛，王順蘭，何浩偉，陳 揚，羅思琴，張淑芳，黃群生

（1.?？谑腥嗣襻t(yī)院中心實驗室，海南 海口570208；2.海南司法醫(yī)院法醫(yī)鑒定中心，海南 ?？?71100）

親子鑒定中46，XX性發(fā)育異常1例

張應(yīng)愛1，王順蘭1，何浩偉1，陳 揚1，羅思琴1，張淑芳1，黃群生2

（1.海口市人民醫(yī)院中心實驗室，海南 ?？?70208；2.海南司法醫(yī)院法醫(yī)鑒定中心，海南 ?？?71100）

法醫(yī)遺傳學(xué)；親子關(guān)系；46，XX性發(fā)育障礙

1 案 例

1.1 簡要案情

自稱父親的男子（假定父）以給孩子落戶為名，攜妻子（假定母）和女兒及有效證件來本鑒定中心進行親子鑒定。根據(jù)知情同意原則，采集血樣備檢。

1.2 檢驗方法

1.2.1 DNA檢驗

采用常規(guī)Chelex-100法分別提取假定父母和孩子待檢血樣的DNA，使用PowerPlex?21試劑盒（美國Promega公司）進行PCR復(fù)合擴增，對三人進行基因分型檢測。采用AGCU Y18 STR和AGCU X12 STR熒光檢測試劑盒（無錫中德美聯(lián)生物技術(shù)有限公司）對假定父18個Y-STR基因座和12個X-STR基因座進行檢測分型。以上檢測均按照相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)化操作規(guī)程手冊進行。

1.2.2 STR分型

采用MJ Mini型擴增儀（美國BIO-RAD公司）進行PCR擴增，使用3130基因分析儀（美國Thermo Fisher Scientific公司）進行毛細管電泳，運用Gene-Mapper?ID v3.2.1軟件（美國Thermo Fisher Scientific公司）進行基因型結(jié)果分析，實驗過程參照標(biāo)準(zhǔn)化操作規(guī)程手冊。

1.2.3 染色體核型分析

采集假定父外周血3 mL，肝素抗凝，取0.3 mL接種于外周血淋巴細胞培養(yǎng)基中，于37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72 h，加入終質(zhì)量濃度為0.2 mg/mL的秋水仙素繼續(xù)培養(yǎng)3 h后收獲細胞。樣本按照常規(guī)方法制片，鏡下計數(shù)30個細胞，G顯帶分析5個中期分裂象。

1.2.4 Y染色體基因檢測

使用2×Pfu PCR MasterMix（KP201）基因擴增試劑盒［天根生化科技（北京）有限公司］和C1000擴增儀（美國BIO-RAD公司）擴增Y染色體上SRY基因（上海生工合成，片段大小475 bp，SRY正向引物序列：5′-GAGGGCGGAGAAATGCAAGT-3′，反向引物序列：5′-TGTGCCTCCTGGAAGAATGG-3′），擴增后產(chǎn)物用2%瓊脂糖凝膠電泳，Universal Hood II凝膠成像系統(tǒng)觀察并拍照。提取的假定父血樣DNA送廣州金域公司檢測AZF基因（包括sY82、sY84、sY86、sY124、sY127、sY128、sY133、sY134、sY143、sY145、sY152、sY239、sY242、sY254和sY255共15個位點）。

1.3 檢驗結(jié)果

1.3.1 常染色體STR基因座分型結(jié)果

假定父、假定母和女兒的20個常染色體STR基因座（D3S1358、D1S1656、D6S1043、D13S317、Penta E、D16S539、D18S51、D2S1338、CSF1PO、Penta D、TH01、vWA、D21S11、D7S820、D5S818、TPOX、D8S1179、D12S391、D19S433和FGA）和Amelogenin基因座進行分型檢驗，Amelogenin基因座的分型結(jié)果見圖1。檢驗中發(fā)現(xiàn)假定父的Amelogenin基因只有X等位基因，等位基因Y未檢出。

圖1 Amelogenin基因分型結(jié)果

1.3.2 Y染色體和X染色體STR基因座分型結(jié)果

在假定父18個Y-STR基因座（DYS19、DYS385a/b、DYS389Ⅰ/Ⅱ、DYS390、DYS391、DYS392、DYS393、DYS439、DYS438、DYS456、DYS458、DYS437、DYS635、Y GATA H4、DYS447、DYS448）的分型檢測結(jié)果中觀察到僅有4個基因座（DYS456、DYS458、DYS19及DYS393）有基因分型（圖2）。假定父12個X-STR基因座（DXS7133、DXS8378、DXS981、DXS7424、DXS6789、DXS10159、GATA165B12、DXS101、DXS7423、GATA31E08、DXS10164、DXS10162）的分型結(jié)果顯示12個X-STR基因座均有分型值，其中DXS7133和DXS7424基因座為純合子，其他10個基因座為雜合子（圖3）。此外，Amelogenin的分型檢測結(jié)果觀察到假定父的Amelogenin基因座的分型為XX（圖3）。

圖2 假定父Y18試劑盒的分型結(jié)果

圖3 假定父X12試劑盒的分型結(jié)果

1.3.3 核型分析和Y染色體基因檢測結(jié)果

假定父外周血淋巴細胞染色體核型鏡下計數(shù)30個細胞，G顯帶分析5個中期分裂象，染色體核型分析為46，XX，inv（9）（p11q13）（圖4）。在對假定父Y染色體基因檢測時觀察到假定父的SRY基因擴增結(jié)果與健康男性結(jié)果一致，含有475 bp大小的SRY基因擴增片段，而健康女性未擴增出相應(yīng)的SRY條帶，顯示假定父SRY檢測為陽性（圖5）。而在對假定父進行的AZF基因檢測結(jié)果顯示其AZF基因的a、b和c三個區(qū)域均發(fā)生缺失。

圖4 假定父染色體核型

圖5 SRY基因電泳圖

2 討 論

本例在進行親權(quán)鑒定中對一假定父20個常染色體STR基因座和Amelogenin基因進行STR分型檢驗時，發(fā)現(xiàn)其Amelogenin基因只有X等位基因，等位基因Y未檢出，與假定父的社會性別不符。為進一步排除實驗誤差，我們進行了18個Y-STR基因座和12個X-STR基因座的分型檢測。X染色體為人類性染色體，正常男性只有一條，來源于假定母，且每個X-STR基因座應(yīng)只顯示一個等位基因。正常女性有兩條X染色體，每個X-STR基因座表現(xiàn)為雜合子或純合子，來源父母各自一條染色體。本案檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)：假定父18個Y-STR基因座僅檢測到4個STR基因座有分型；而在12個X-STR基因座分型中，DXS7133和DXS7424基因座為純合子，其他10個基因座為雜合子（圖3）。推斷假定父為46，XX男性。采集假定父的外周血進行染色體核型分析，結(jié)果為46，XX，inv（9）（p11q13），因此判定該假定父為46，XX性發(fā)育異常患者。

性發(fā)育異常疾病的臨床分類較多，2006年歐洲兒科內(nèi)分泌協(xié)會和Lawson Wilkins兒科內(nèi)分泌協(xié)會提出將兩性畸形和一些影響性發(fā)育的性染色體病，統(tǒng)稱為性發(fā)育異常[1]（disorder of sex development，DSD）。46，XX DSD是一種非常少見的染色體畸變，且性發(fā)育異常，DELACHAPELLE等[2]于1964年首次報道，該病發(fā)生率在男性中為1/25 000～1/20 000，患者多為男性表型，但染色體核型為46，XX，此類患者社會性別多為男性特征，行為正常[3，4]。男性性別分化是一個由多基因調(diào)控的過程，人類SRY基因位于Yp11.32，該片段存在于Y染色體的男性特異區(qū)（male-specific region of the Y chromosome，MSY）。SRY基因在性腺向睪丸分化途徑中具有起始分化的作用，性別決定是由SRY啟動的多基因參與且相互作用的復(fù)雜過程，任何環(huán)節(jié)的異常均可導(dǎo)致性別的異常分化，SRY基因在性別分化中具有關(guān)鍵作用[5，6]。據(jù)報道[7，8]，90%以上的46，XX男性含有SRY基因，當(dāng)SRY基因易位至X染色體或常染色體時，46，XX個體通常具有男性外生殖器；另外約10%的46，XX男性未檢出SRY，外生殖器模糊，多伴有其他器官畸形，可能是某一參與性別決定、受SRY基因調(diào)控的靶基因發(fā)生突變導(dǎo)致向男性方向分化發(fā)育。我們檢測到假定父SRY基因陽性，同大多數(shù)46，XX男性含有SRY基因一致，具有男性特征，行為正常[7]。但由于性別分化和發(fā)育的復(fù)雜性，該病在遺傳與臨床上仍有很大的異質(zhì)性。

近十年，國內(nèi)關(guān)于46，XX性發(fā)育異常的報道也逐漸增多，匯總情況見表1。大部分患者為SRY基因陽性，AZF檢測正常，部分缺失和全缺失情況亦存在。Y染色體微缺失在男性不育的遺傳因素中占據(jù)第二位，僅次于克氏綜合征[9]。我們同時檢測了Y染色體長臂遠端控制精子發(fā)生的基因，即無精子因子（azoospermia factor，AZF），AZF區(qū)域劃分為AZFa、AZFb和AZFc三個區(qū)。擴增覆蓋AZF基因三個區(qū)域的15個位點，結(jié)果顯示AZF基因的15個位點均未檢測到條帶，即AZF基因為全缺失，與歐陽洪根等[10-12]報道一致，該類患者高促性腺激素性性腺功能不全，睪酮水平較低，精液檢查為無精癥，提示假定父可能為無精子癥患者。在鄧國良等[13]報道的3例SRY陽性的46，XX男性性反轉(zhuǎn)病例中，通過FISH方法檢測到SRY基因是易位到X染色體上，這與國外報道[14-16]一致。此外，國外也有SRY基因易位到常染色體的報道[7]。在本案例中，假定父Y-STR基因分型結(jié)果顯示在DYS456、DYS458、DYS19及DYS393基因座均有基因位點的存在，推測以上位點的DNA序列可能在SRY基因附近，和SRY基因連鎖同時易位至X染色體或常染色體中。但具體的發(fā)病機制目前尚不明確，仍需要更多的分子遺傳學(xué)證據(jù)來驗證。另外，對46，XX性發(fā)育異?；颊哌M行Y染色體微缺失檢測，可對患者的生育能力進行明確的診斷[17]，避免了對患者造成醫(yī)療創(chuàng)傷，該檢測簡單快捷，可以被廣泛應(yīng)用。

表1 國內(nèi)2007—2016年關(guān)于46，XX性發(fā)育異常患者報道的基因檢測

近年來，隨著親權(quán)鑒定的不斷增加，遇到假定父生物學(xué)性別與社會性別不一致的情況時，應(yīng)引起從業(yè)人員的注意。首先確定檢材是否正確，檢查操作過程中人員、儀器和試劑等影響因素造成偏差的可能性；必要時重新取樣，更換試劑盒排除相關(guān)因素，借助細胞學(xué)和分子遺傳學(xué)技術(shù)對其進行進一步的檢測，并提醒其接受一些相關(guān)的臨床醫(yī)學(xué)檢查，以輔助其診斷疾病。在該病例中也反映出常染色體、性染色體STR的檢測結(jié)果可以輔助臨床醫(yī)生進行診斷，具有重要的參考價值。

[1]HUGHES I A，HOUK C，AHMED S F，et al. Consensus statement on management of intersex disorders[J].Arch Dis Child，2006，91（7）：554-563.

[2]DELACHAPELLE A，HORTLING H，NIEMI M，et al.XX sex chromosomes in a human male[J].Acta Med Scand，1964，175：412-425.

[3]HADO H S，HELMY S W，KLEMM K，et al.XX male：a rare cause of short stature，infertility，gynaecomastia and carcinoma of the breast[J].Int J Clin Pract，2003，57（9）：844-845.

[4]VORONA E，ZITZMANN M，GROMOLL J，et al. Clinical，endocrinological，and epigenetic features of the 46，XX male syndrome，compared with 47，XXY Klinefelter patients[J].J Clin Endocrinol Metab，2007，92（9）：3458-3465.

[5]ROLF C，GROMOLL J，SIMONI M，et al.Natural transmission of a partial AZFb deletion of the Y chromosome over three generations：case report[J]. Hum Reprod，2002，17（9）：2267-2271.

[6]YOGEV L，SEGAL S，ZEHARIA E，et al.Sex chromosome alignment at meiosis of azoospermic men with azoospermia factor microdeletion[J].J Androl，2004，25（1）：110-116.

[7]DAUWERSE J G，HANSSON K B，BROUWERS A A，et al.An XX male with the sex-determining region Y gene inserted in the long arm of chromosome 16[J].Fertil Steril，2006，86（2）：461-463.

[8]柳林，逄力男，楊利麗.46，XX男性表型及遺傳學(xué)研究進展[J].國外醫(yī)學(xué)（內(nèi)分泌學(xué)分冊），2005，25（4）：283-285.

[9]阮健，杜衛(wèi)東.男性不育與基因缺陷[J].遺傳，2010，32（5）：411-422.

[10]歐陽洪根，黃源鵬，江雨，等.二例男性性反轉(zhuǎn)綜合征臨床特征及細胞分子遺傳學(xué)檢測分析[J].中國優(yōu)生與遺傳雜志，2016，24（2）：72-73.

[11]李東明.性反轉(zhuǎn)綜合征細胞和分子遺傳學(xué)研究[J].中國優(yōu)生與遺傳雜志，2016，24（7）：37-44.

[12]張穎，朱海燕，吳星，等.2例SRY陽性的46，XX男性綜合征細胞和分子遺傳學(xué)分析[J].中國優(yōu)生與遺傳雜志，2011，19（3）：28-29.

[13]鄧國良，常大黎，朱崢燕，等.SRY基因、SOX-9基因檢測在性反轉(zhuǎn)中的應(yīng)用研究[J].中國醫(yī)藥指南，2010，8（33）：129-131.

[14]CHERNYKH V B，KURILO L F，SHILOVA N V，et al.Hidden X chromosomal mosaicism in a 46，XX male[J].Sex Dev，2009，3（4）：183-187.

[15]BEAULIEU B M，LEMYRE E，LEMIEUX N.Identification of new susceptibility regions for X；Y translocations in patients with testicular disorder of sex development[J].Sex Dev，2011，5（1）：1-6.

[16]DAUWERSE J G，HANSSON K B，BROUWERS A A，et al.An XX male with the sex-determining region Y gene inserted in the long arm of chromosome 16[J].Fertil Steril，2006，86（2）：461-463.

[17]劉麗麗，肖敏敏.Y染色體微缺失與男性不育的研究進展[J].醫(yī)學(xué)理論與實踐，2016，29（18）：3181-3183，3232.

[18]蒙縣宗，梁季鴻，魯國玉，等.SRY基因陰性男性性反轉(zhuǎn)綜合征1例[J].中國現(xiàn)代醫(yī)生，2010，48（16）：106-107.

[19]王濤，楊俊，劉繼紅，等.46，XX男性性反轉(zhuǎn)綜合征1例的基因檢測[J].中國男科學(xué)雜志，2007，21（8）：35-37，40.

[20]張麗瓊，李明.46，XX男性性反轉(zhuǎn)綜合征1例[J].疑難病雜志，2009，8（5）：307-308.

[21]楊興坤，吳維青，郭曉玲，等.46，XX男性綜合征患者的細胞和分子遺傳學(xué)研究[J].中國優(yōu)生與遺傳雜志，2012，20（10）：32-33.

[22]孟衛(wèi)京，賈辰亮，李海艷.46-XX男性性反轉(zhuǎn)綜合征15例分析[J].實用醫(yī)技雜志，2014（8）：878-879.

[23]林允壽，馮唯，李克秋，等.性反轉(zhuǎn)綜合征患者SRY、WT1及SOX9基因檢測[J].中國優(yōu)生與遺傳雜志，2015，23（8）：24-26.

[24]張名揚.男性表型性反轉(zhuǎn)綜合征一例[J].華北國防醫(yī)藥，2009，21（4）：38.

[25]張露，明蕾.SRY基因陽性46，XX男性性反轉(zhuǎn)綜合征1例[J].中國優(yōu)生與遺傳雜志，2013，21（2）：56.

[26]孟衛(wèi)京，李海艷，薛春梅，等.5例SRY陰性的46，XX男性綜合征遺傳學(xué)分析[J].中國優(yōu)生與遺傳雜志，2016，24（7）：42-43.

DF795.2

B

10.3969/j.issn.1004-5619.2017.04.032

1004-5619（2017）04-0442-04

2016-07-11）

（本文編輯：張素華）

海南省自然科學(xué)基金資助項目（817379，20168312）；海口市重點科技計劃資助項目（2011-0148）

張應(yīng)愛（1979—），女，助理研究員，主要從事法醫(yī)物證學(xué)及分子遺傳學(xué)研究；E-mail：zhangyingai@hotmail.com