梅英杰，史新宇，董瑾，朱西雷，張貞理，李德剛

1(山東理工大學 化學工程學院，山東 淄博,255000) 2(淄博市食品藥品檢驗研究院，山東 淄博,255000) 3 (淄博市產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗所，山東 淄博,255000)

超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法同時檢測雞肉中氯霉素、四環(huán)素、金霉素和土霉素

梅英杰1,2，史新宇3，董瑾2，朱西雷2，張貞理2，李德剛1*

1(山東理工大學 化學工程學院，山東 淄博,255000) 2(淄博市食品藥品檢驗研究院，山東 淄博,255000) 3 (淄博市產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗所，山東 淄博,255000)

采用固相萃取法對雞肉中氯霉素、四環(huán)素、金霉素和土霉素殘留同時提取、凈化、富集，并建立了用超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法對4種抗生素定性定量檢測的分析方法。前處理部分采用含0.1%三氯乙酸的乙腈為提取溶劑，飽和了乙腈的正己烷溶液去除脂肪，超聲波萃取2次；采用HLB固相萃取柱凈化；色譜部分采用BEH C18色譜柱(2.1 mm×50 mm,1.7μm)，乙腈-0.2%甲酸水(含5 mmol/L乙酸銨)為流動相進行梯度洗脫。在最優(yōu)條件下氯霉素、四環(huán)素、金霉素和土霉素在相應(yīng)濃度范圍內(nèi)，線性良好，相關(guān)系數(shù)R2均大于0.999，其檢出限分別為0.1、3.2、16.0、9.0μg/kg，日內(nèi)、日間相對標準偏差(n=5)分別小于5.0%和10.0%，平均回收率為80.1%～92.5%。

氯霉素；四環(huán)素；固相萃?。怀咝б合嗌V-串聯(lián)質(zhì)譜

抗生素添加到飼料中，能有效提高飼養(yǎng)物的存活率和生長速度[1]。隨著肉制品的需求不斷加大，以及養(yǎng)殖過程中畜禽疾病頻發(fā)，診斷難度增大，導致養(yǎng)殖業(yè)抗生素藥物濫用、過量使用現(xiàn)象日趨嚴重[2]。人們食用含抗生素殘留的肉制品后，抗生素殘留物會在人體蓄積，會對人體健康造成有害影響[3]。另一方面，這些抗生素殘留會伴隨動物尿液、糞便等轉(zhuǎn)移到外部環(huán)境中，而這些排泄物中有些抗生素成分還未失活，在環(huán)境中積累、富集，進而對土壤的生態(tài)環(huán)境和動植物體造成影響。

目前，動物性食品中氯霉素與四環(huán)素類的檢測方法主要有酶聯(lián)免疫法[3]、微生物學法[4]、氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法[5]、液相色譜法[6]與液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法[7-9]等。酶聯(lián)免疫法操作簡便，特異性強，常用于批量樣品的快速篩選，但定量準確度較差；微生物學法易于操作，成本低，但檢測周期長，特異性差，干擾多；氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法檢測時需進行衍生化，操作繁瑣費時；液相色譜法采用光譜檢測時定性手段較單一，易出現(xiàn)假陽性結(jié)果；液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法(LC-MS)通過液相色譜將目標物分離，以質(zhì)譜儀為定性定量手段，可有效避免假陽性結(jié)果。超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)(UPLC-MS/MS)相比較傳統(tǒng)的LC-MS，顯著提高了檢測的靈敏度、準確度、重復性，能更好地適應(yīng)現(xiàn)代檢測技術(shù)對高通量、高精度的需要，在抗生素殘留分析應(yīng)用中發(fā)展迅速[10-13]。本文以固相萃取為前處理手段，通過UPLC-MS/MS分析，建立一套完整的分析方法，實現(xiàn)對雞肉中氯霉素、四環(huán)素、金霉素、土霉素同時提取、同時檢測。

1 材料與方法

1.1實驗儀器、試劑

1.1.1 實驗儀器

電子天平(MS205DU)，METTLER TOLEDO公司；電子天平(ML204/02)，梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司；氮吹儀(HN200)，海能儀器有限公司;固相萃取儀(JTCQ-24B)，杭州聚同電子有限公司;高速冷凍離心機(TGL-20M)，長沙湘儀離心機儀器有限公司；超聲波清洗儀(SK2200H)，上?？茖С晝x器有限公司;超純水儀(Integral 5)，MILLIPORE公司;超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀(ACQUITY Quattro Premier XE)，美國沃特斯公司。

1.1.2 實驗試劑

氯霉素標準物質(zhì)(≥99.8%)，中國計量科學研究院；四環(huán)素、金霉素、土霉素單標溶液(100 μg/mL)，農(nóng)業(yè)部環(huán)境保護科研監(jiān)測所；乙酸銨(分析純)、三氯乙酸(分析純)，天津市福晨化學試劑廠；無水Na2SO4(分析純)，萊陽市經(jīng)濟技術(shù)開發(fā)區(qū)精細化工廠；正己烷(HPLC級)、甲酸(HPLC級)，天津市科密歐化學試劑有限公司；甲醇(HPLC級)、乙腈(HPLC級)，F(xiàn)isher公司。

1.2標準溶液的配制

1.2.1 標準儲備液的配制

準確稱取氯霉素10 mg于100 mL燒杯中，加入約30 mL甲醇溶解，溶解較慢時可超聲5min加速溶解，待標準物質(zhì)完全溶解后，轉(zhuǎn)入100 mL棕色容量瓶中，并用甲醇定容至100 mL，該標準儲備液濃度為100 mg/L，配制好后，放入4 ℃冰箱中保存。

1.2.2 混合標準使用液的配制

分別準確移取濃度均為100 mg/L的氯霉素、四環(huán)素、金霉素、土霉素各1.0 mL于10 mL棕色容量瓶中，加甲醇至刻度，配制成單標中間液濃度為10 mg/L，配制好后放入4℃冰箱中保存。

用甲醇稀釋分別配制不同濃度系列的混合標準使用液，經(jīng)0.2μm微孔濾膜過濾后待測。

1.3流動相的配制

0.2%甲酸水溶液(含5 mmol/L的乙酸銨)：稱取0.38 g乙酸銨于150 mL燒杯中，加50 mL超純水溶解，加入2 mL甲酸，轉(zhuǎn)移至1 000 mL容量瓶，加水定容至刻度。

乙腈：色譜純。

1.4樣品前處理

1.4.1 樣品的制備

購買市售白條雞，取肌肉部分。用高速組織搗碎機將樣品打碎后，將樣品混勻，放入干凈的樣品盤中，保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4.2 提取液的配制

0.1%的三氯乙酸溶液：稱取三氯乙酸1.0g加水定容至1 L。乙腈：色譜純。乙腈飽和過的正己烷：取100 mL正己烷于分液漏斗中，加入100 mL乙腈混合至分層，取上層溶液備用。

1.4.3 提取過程

稱取5.00 g樣品于50 mL聚四氟乙烯離心管中，加入5 mL的0.1%三氯乙酸溶液，10 mL乙腈，振蕩混勻1 min后，超聲提取10 min，10 000 r/min離心5 min，上清液轉(zhuǎn)移至另一潔凈離心管中，向殘留物中再加入10 mL乙腈，超聲提取10 min，10 000 r/min離心5 min，合并上層清液，加入5.0 g無水Na2SO4，加入5 mL乙腈飽和的正己烷溶液，渦旋混合1 min后，靜置5 min，取乙腈溶液于室溫下氮氣吹干，加入0.1%三氯乙酸溶液2 mL復溶，備用。

1.4.4 樣品凈化

將Oasis HLB固相萃取柱以3 mL甲醇和3 mL超純水分別純化，將提取液注入固相萃取柱(通過固相萃取柱的流速不宜過快，基本控制在1 min/mL)，以6 mL 10%甲醇水溶液淋洗小柱，抽干，加入6 mL V(甲醇)∶V(乙酸乙酯)=15∶85洗脫，抽干5 min，收集洗脫液于室溫下氮氣吹干，用1 mL流動相溶解，過濾備用。

1.5測定條件

1.5.1 液相部分

色譜柱：ACQUITY UPLC BEH C18色譜柱 1.7 μm、2.1mm×50 mm ；進樣量：10μL；柱溫： 40℃；

流動相： A為0.2%甲酸水溶液(含5 mmol/L乙酸銨)，B為乙腈；流速0.20 mL/min；梯度條件：0～5 min：A 90%～60%；5～6 min：A 60%～5%，A 5%保持2 min；8.1 min：A 90%。

1.5.2 質(zhì)譜條件

調(diào)整質(zhì)譜參數(shù)，得到如表1所示最優(yōu)質(zhì)譜條件。

表1 質(zhì)譜條件

2 結(jié)果與討論

2.1前處理條件優(yōu)化

2.1.1 提取溶劑的選擇

從生物樣品中提取氯霉素和四環(huán)素類比較復雜，生物基質(zhì)中存在的蛋白質(zhì)會影響目標物的提取效率，因此在提取時考慮用強酸溶液或酸性溶液對蛋白質(zhì)進行分離。但是，在較強酸性環(huán)境中(pH<2.0)，四環(huán)素類藥物會降解為脫水物，發(fā)生分解。因此，提取時宜選擇弱酸性溶劑。常用的弱酸性溶劑有EDTA-Mcilaine緩沖液(pH 4.0)、酸化乙腈、酸化乙腈-甲醇等。另外，三氯乙酸溶液、檸檬酸鹽緩沖液等也可用于樣品的提取和沉淀蛋白質(zhì)。張鑫等采用EDTA-Mcilaine緩沖液對雞肉中四環(huán)素類抗生素進行了提取，經(jīng)固相萃取凈化后，用UPLC-MS/MS定性定量檢測[14]；洪波等采用酸化乙腈對水產(chǎn)品中四環(huán)素進行了提取，用液相色譜進行了定量檢測[15]；謝寒冰等采用酸化乙腈-甲醇對豬肉中四環(huán)素類等多種抗生素進行提取，并用液相色譜-四極桿飛行時間質(zhì)譜進行了定性定量檢測[16]。氯霉素性質(zhì)穩(wěn)定，較易提取。提取動物組織中氯霉素時，常用到乙酸乙酯和乙腈溶液。馮雷等以乙酸乙酯為提取劑，對禽肉中的氯霉素進行了提取，用液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法進行了定性定量檢測[17]；陳劍剛等以乙腈為提取液對蝦肉中氯霉素提取后，用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法進行了定性定量檢測[18]。本文選用0.1%三氯乙酸-乙腈提取體系，在弱酸性條件下有效提取氯霉素、四環(huán)素類抗生素殘留，并同時沉淀樣品中的蛋白質(zhì)，效果較好。由于動物組織中存在較多的游離脂肪，會進入到萃取液中，影響萃取效果，因此需對提取溶液進行脫脂處理，選用乙腈飽和的正己烷進行脫脂處理。

2.1.2 提取方式的選擇

在提取過程中，提取方式對目標物的提取速度和完全程度存在一定影響。提取時間在一定程度上決定了提取的完全程度，提取時間長，提取的完全程度高，但提取效率低；提取時間縮短，雖然有助于提取效率提高，但可能會造成提取不完全。實驗室常用的提取方式有：靜置提取、振蕩提取和超聲波提取等。實驗中，對靜置提取，振蕩提取和超聲波提取分別作了比較。發(fā)現(xiàn)3種提取方式分別提取時，短時間內(nèi)，超聲波提取的回收率最高，振蕩提取次之，靜置提取最低，這是由于在短時間內(nèi)靜置提取和振蕩提取對樣品的浸潤和滲透能力不足，造成提取效果的降低。而利用超聲波提取時，由于超聲波的“空化”作用，加速了目標物的溶出，提取效率提高。因此，在實驗中選取超聲波提取作為目標物提取方式。

2.1.3 固相萃取條件的選擇與優(yōu)化

固相萃取柱選用Oasis HLB柱，其鍵合相為N-乙烯吡咯烷酮和親脂性的二乙烯基苯聚合物，其回收率好于普通的C18小柱。固相萃取過程中，洗脫液的選擇對目標物回收率有重要影響。由于測試樣品為動物組織，基質(zhì)復雜，為提高目標物的洗脫完全率，本文選用了甲醇/乙酸乙酯混合液作為洗脫劑，分別采用V(甲醇)∶V(乙酸乙酯)=5∶95、10∶90、15∶85、20∶80洗脫液對提取后的基質(zhì)加標樣品進行洗脫并測定，通過比較如圖1所示不同洗脫液對應(yīng)的目標物回收率，最終確定V(甲醇)∶V(乙酸乙酯)=15∶85 作為洗脫液。

圖1 不同洗脫液對4種目標物回收率的影響Fig.1 Effect of differenteluent on recovery

2.2分析條件優(yōu)化

2.2.1 流動相的確定

液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用分析中，流動相一般選擇黏度低，通用性好的溶液。實驗中分別選用乙腈-水、乙腈-0.2%甲酸水、乙腈-0.2%甲酸水溶液(含5 mmol/L乙酸銨)做流動相進行試驗。試驗表明，3種流動相體系對氯霉素的保留與響應(yīng)影響不大，但四環(huán)素、金霉素、土霉素靈敏度很差，無法滿足要求。采用乙腈-0.2%甲酸水體系時，四環(huán)素、金霉素靈敏度滿足要求，但土霉素靈敏度較低。采用乙腈-0.2%甲酸水溶液(含5 mmol/L乙酸銨)體系時，4種抗生素響應(yīng)均能滿足要求，故本次研究采用乙腈-0.2%甲酸水溶液(含5 mmol/L乙酸銨)作為流動相。

2.2.2 電離模式的選擇

分別配制濃度為1μg/mL的氯霉素、四環(huán)素、金霉素、土霉素的標準溶液，以流動注射方式進樣，流速為20 μL/min，分別在正離子模式(ESI+)和負離子模式(ESI-)下進行全掃描，掃描完成后，分別比較正、負離子模式下4種抗生素的響應(yīng)值，結(jié)果表明，氯霉素在負離子模式下響應(yīng)正常，正離子模式下基本無響應(yīng)；四環(huán)素、金霉素、土霉素在正離子模式下響應(yīng)正常，在負離子模式下基本無響應(yīng)，故采集氯離子宜選用負離子模式，四環(huán)素等采用正離子模式采集。本文采用正負離子雙通道同時采集模式實現(xiàn)對這4種抗生素同時檢測。

2.2.3 母離子與子離子的確定

本文采用三重四級桿串聯(lián)質(zhì)譜儀，通過調(diào)整質(zhì)譜參數(shù)，得到化合物的一級質(zhì)譜圖，得到目標物的分子量信息，確定目標物的母離子。氯霉素、四環(huán)素、金霉素、土霉素母離子分別為m/z 320.9、444.97、479.17、461.00，與相關(guān)標準記載及文獻報道一致[7-8，19-20]。

配制氯霉素、四環(huán)素、金霉素、土霉素的標準液，根據(jù)前述確定的色譜、質(zhì)譜條件進行測定，得到如圖2所示4種抗生素的多反應(yīng)監(jiān)測色譜圖。

圖2 氯霉素、四環(huán)素、金霉素、土霉素多反應(yīng)監(jiān)測色譜圖Fig.2 Chromatograms ofChloramphenicol,tetracycline,chlortetracycline,oxytetracycline in multiple reaction monitoring (MRM) mode

從圖2可以看出，在最優(yōu)條件下，4種抗生素分離度較好，能達到基線分離，且峰形能夠滿足實驗要求，四種目標物能在10 min內(nèi)完成分離。在正負離子雙通道同時采集條件下，可實現(xiàn)四種目標物的同時檢測。4種目標物的保留時間、母離子、子離子信息如表2所示。

表2 四種目標物的質(zhì)譜信息

注：*定量離子。

本文還研究了基質(zhì)效應(yīng)對測定結(jié)果的影響，研究發(fā)現(xiàn)，標準溶液和空白基質(zhì)加標溶液的色譜圖在出峰時間、基線噪聲、響應(yīng)值等方面無明顯不同，這說明樣品經(jīng)前期提取凈化后，基質(zhì)效應(yīng)對檢測結(jié)果基本無影響。

2.3線性范圍

在0.2～500 μg/L內(nèi)配制氯霉素、四環(huán)素、金霉素、土霉素的混合標準使用液，按照本研究確定的儀器條件進行測定，以標準溶液濃度為橫坐標(Xμg/L)，峰面積為縱坐標(Y)，擬合一次線性方程，分別得到四種目標物的一次線性回歸方程，見表3。

表3 目標物的線性回歸方程

2.4方法的檢出限和定量限

稱取5.0 g空白基質(zhì)樣品，采用基質(zhì)加標的方法添加4種抗生素，按本文確定的前處理方法和儀器條件進行檢測，按照3倍基線噪聲(S/N=3)計算方法檢出限，按照10倍基線噪聲(S/N=10)計算方法定量限，配制檢出限、定量限等同濃度標準溶液，并經(jīng)儀器檢測驗證。方法檢出限及定量限結(jié)果如表4所示。

表4 目標物的檢出限及定量限

2.5方法回收率與精密度

采用基質(zhì)加標方式，配制混合標準溶液，按照本文確定的儀器條件，考察方法日內(nèi)精密度(同一天內(nèi)連續(xù)進樣5次，n=5)和日間精密度(每天進樣1次，連續(xù)5天，n=5)，得到3種濃度下4種抗生素的日內(nèi)和日間相對標準偏差(RSD)，結(jié)果見表5。結(jié)果表明4種抗生素的日內(nèi)、日間相對標準偏差均小于5.0%和10.0%。3個濃度加標回收率在80.1%～92.5%之間。

表5 回收率與日內(nèi)和日間精密度(n=5)

2.6實際樣品的測定

按照本文上述建立的樣品前處理方法對10份雞肉樣品進行處理，在最優(yōu)儀器條件下，對雞肉樣品進行定性定量分析。其中,1份雞肉樣品中只檢出土霉素，定量結(jié)果為31.2 μg/kg，其多反應(yīng)監(jiān)測色譜圖如圖3所示；1份雞肉樣品中檢出土霉素和氯霉素，定量結(jié)果分別為67.3 μg/kg和6.8 μg/kg，其多反應(yīng)監(jiān)測色譜圖如圖4所示。

圖3 陽性樣品1多反應(yīng)監(jiān)測色譜圖Fig.3 MRM chromatograms of positive sample 1

圖4 陽性樣品2多反應(yīng)監(jiān)測色譜圖Fig.4 MRM chromatograms of positive sample 2

3 結(jié)論

通過優(yōu)化樣品前處理過程、色譜條件中的色譜柱、流動相組成及配比、柱溫以及質(zhì)譜條件中的錐孔電壓、毛細管電壓、離子源溫度、脫溶劑氣溫度等因素，確立了雞肉中氯霉素、四環(huán)素、金霉素、土霉素抗生素殘留的UPLC-MS/MS分析方法。4種目標物在相應(yīng)濃度范圍內(nèi)線性良好，相關(guān)系數(shù)(R2)為0.999 2～0.999 6，檢出限分別為0.1、3.2、16.0、9.0 μg/kg。

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Determinationofchloramphenicol,tetracycline,chlortetracyclineandoxytetracyclineinchickenbyultraperformanceliquidchromatography-tandemmassspectrometry

MEI Ying-jie1,2,SHI Xin-yu3,DONG Jin2,ZHU Xi-lei2,ZHANG Zhen-li2,LI De-gang1*

1 (College of Chemical Engineering,Shandong University of Technology,Zibo 255000,China) 2 (Zibo Institute for Food and Drugcontrol,Zibo 255000,China) 3 (Zibo Institute of Product Quality Supervision & Inspection,Zibo 255000,China)

A solid phase extraction column clean-up and ultra performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry (UPLC-MS/MS) method was developed for simultaneous determination of chloramphenicol,tetracycline,chlortetracycline and oxytetracycline in chicken products.In the pre-treatment process,the sample was extracted with 0.1% trichloroacetic acid-acetonitrile and ultrasonic treatment twice,and fat was removed by acetonitrile saturated n-hexane.HLB solid phase extraction column was used to purify.BEH C18(2.1 mm×50 mm,1.7 μm) column was used and acetonitrile-0.2% formic acid (containing 5mmol/L ammonium acetate) was the gradient eluent.Under the above optimized conditions,chloramphenicol,tetracycline,chlortetracycline and oxytetracycline had a good linear correlation in the corresponding concentration ranges (R2> 0.999).The detection limits of four substances were 0.1,3.2,16.0,9.0 μg/kg,respectively.Intra-day and inter-day relative standard deviations (n= 5) were less than 5.0% and 10.0% respectively.The average recoveries were between 80.1% and 92.5%.

chloramphenicol; tetracycline; solid phase extraction; ultra performance liquid chromatography -tandem mass spectrometry(UPLC-MS/MS)

10.13995/j.cnki.11-1802/ts.011905

學士，工程師(李德剛副教授為通訊作者，E-mail:ldg@sdut.edu.cn)。

2016-05-09，改回日期：2017-02-27