金慶日, 黃小毛, 魏霞麗,PONGTANALERT Piyapong, 楊占英, 張君啟

(1.杭州醫(yī)學(xué)院,浙江 臨安 311399;2.浦城正大生化有限公司,浙江 浦城 353400)

金霉素(Chlortetracycline,CTC)是一種具有廣譜抗菌活性的四環(huán)素,用于治療立克次氏體、支原體、衣原體、螺旋體等細(xì)菌的感染[1-2]。CTC廣泛應(yīng)用于動(dòng)物產(chǎn)品體系中的疾病治療和預(yù)防,曾被用作預(yù)混料,提高肉雞[3]、豬[4]和奶牛[5]等動(dòng)物的生產(chǎn)性能。CTC目前作為治療藥物和預(yù)防藥物,主要以混飲方式給藥[6]。然而,作為BSC(Biopharmaceutics classification system) IV類藥物,金霉素具有溶解度和滲透性低的特性[7-8]。因此,提高CTC的溶解度,將有利于提高其生物利用度和在農(nóng)場(chǎng)中的應(yīng)用[9]。研究表明,通過(guò)制備其鹽型[7,10]或噴霧干燥[9]制備的金霉素固體分散體可顯著提高其溶解度。改變藥物的體內(nèi)行為(如灌服生物利用度、靶向性、透皮/透黏膜/跨血腦屏障特性等),最終可提高藥物療效,減少藥物不良反應(yīng)并提高服藥依從性[11-14]。此外,金霉素在不同地區(qū)肉雞中的藥代動(dòng)力學(xué)試驗(yàn)結(jié)果并不一致[3,15],有必要對(duì)金霉素進(jìn)行進(jìn)一步研究。該試驗(yàn)的目的是探究鹽酸金霉素和超級(jí)鹽酸金霉素在肉雞體內(nèi)的藥代動(dòng)力學(xué)特征以及連續(xù)給藥后的殘留試驗(yàn),以便為金霉素和超級(jí)鹽酸金霉素的臨床合理應(yīng)用和給藥劑量的設(shè)定提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

鹽酸金霉素原粉和超級(jí)鹽酸金霉素由福建浦城正大生化有限公司提供。鹽酸金霉素標(biāo)準(zhǔn)品購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢驗(yàn)研究院。其他溶劑和試劑均為分析級(jí)。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

體重相似的健康300日齡黃羽肉雞40只,用于單次給藥的藥代動(dòng)力學(xué)試驗(yàn)和多次給藥后的殘留試驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物飼養(yǎng)于溫度和濕度恒定的動(dòng)物房中,動(dòng)物室保持12 h的暗/光周期并提供飼料和水。肉雞在給藥前禁食12 h,允許自由飲水。

1.3 給藥和采血方案

將16只健康肉雞隨機(jī)分為鹽酸金霉素組和超級(jí)鹽酸金霉素組,每組8只。給藥前禁食12 h以上。給每只雞灌服鹽酸金霉素原粉和超級(jí)鹽酸金霉素溶液,給藥劑量為20 mg/kg。分別在給藥后0.25、0.5、1、1.5、2、2.5、3、4、6、8、10和24 h,通過(guò)翅靜脈采集血樣,每次采集1 mL。將采集好的全血置于肝素鈉離心管中,以8 000 r/min離心3 min,收集血漿并保存于-80 ℃冰箱,直至UPLC-MS/MS分析。

其余24只也被隨機(jī)分為鹽酸金霉素組和超級(jí)鹽酸金霉素組,以20 mg/kg劑量連續(xù)灌服7 d。第8天,用二氧化碳施行安樂(lè)死,收集腎臟、肝臟和肌肉組織樣品,保存于-80 ℃冰箱,直至UPLC-MS/MS分析。

1.4 分析方法

1.4.1 血漿樣品和組織樣品的預(yù)處理

取100 μL雞血漿樣品,置于1.5 mL離心管中,加400 μL三氯乙酸(1 mol/L),渦旋振蕩10 min,13 000 r/min離心10 min,吸取上清液。取300 μL上清液,置于樣品瓶中,用UPLC-MS/MS測(cè)定血漿中金霉素濃度。

取雞的肝臟或腎臟或肌肉組織樣品5 g,加入3倍體積的生理鹽水,用組織搗碎儀搗碎3 min。用0.45 μm針式過(guò)濾器過(guò)濾后,作為組織樣品液。取100 μL組織樣品液,置于1.5 mL離心管中,加400 μL三氯乙酸(1 mol/L),渦旋振蕩10 min,13 000 r/min離心10 min,吸取300 μL上清液,置于樣品瓶中,用UPLC-MS/MS測(cè)定組織中金霉素濃度。

1.4.2 液質(zhì)聯(lián)用儀的檢測(cè)條件

色譜柱為 Waters ACQUITY UPLCTM BEH C18 Column (2.1×100 mm, 1.7 μm)和CortecsUPLCT3(2.1×100 mm, 1.6 μm),使用電噴霧電離(ESI)模式。在負(fù)ESI模式下進(jìn)行分析。流動(dòng)相為0.1%甲酸(A)和乙腈(B)。梯度洗脫條件為:0～2 min為90%A和10% B,2～4 min為70%A和30% B,4～6 min為5%A和95% B,6～7 min為90%A和10% B。流速0.3 mL/min,進(jìn)樣體積10 μL,分析時(shí)間10 min。金霉素的去簇電壓30 V;金霉素的碰撞電壓20 V。金霉素的母離子和子離子的質(zhì)荷比(m/z)分別為 478.8和444.1。

1.4.3 藥動(dòng)學(xué)參數(shù)的計(jì)算

首先通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線和血漿樣品的峰面積計(jì)算血漿樣品中金霉素的濃度。采用WinNonlin軟件的非房室模型,計(jì)算各種藥動(dòng)學(xué)參數(shù),如生物半衰期(t1/2)、峰濃度(Cmax)、達(dá)峰時(shí)間(Tmax)、濃度-時(shí)間曲線下面積(AUCall)、血漿清除率(CL),表觀分布體積(VZ)和平均滯留時(shí)間(MRTlast)等。

1.5 數(shù)據(jù)分析

采用SPSS軟件進(jìn)行分析,組間差異用t檢驗(yàn)。P<0.05視為具有顯著性差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 金霉素血漿樣品的色譜圖

圖1為血漿樣品的色譜圖。

A:空白血漿色譜圖;B:標(biāo)準(zhǔn)溶液色譜圖;C:血漿樣品色譜圖;D:肝臟樣品色譜圖

圖1A為肉雞空白血漿色譜圖;圖1B為金霉素標(biāo)準(zhǔn)溶液色譜圖;圖1C 為肉雞灌服超級(jí)鹽酸金霉素后6 h血漿樣品的色譜圖;圖1D為肉雞連續(xù)灌服7 d超級(jí)鹽酸金霉素后采集的肝臟樣品的色譜圖。由圖1可知,血漿樣品中金霉素的保留時(shí)間為2.79 min,在組織樣品中的保留時(shí)間為5.76 min。血漿樣品和組織樣品中的保留時(shí)間不同,與使用不同的色譜柱有關(guān)。

2.2 肉雞灌服給藥鹽酸金霉素和超級(jí)鹽酸金霉素后的血藥濃度

單劑量(20 mg/kg)灌服鹽酸金霉素和超級(jí)鹽酸金霉素后血漿藥物濃度和藥時(shí)曲線如表1和圖2所示。試驗(yàn)結(jié)果表明,單劑量(20 mg/kg)灌服超級(jí)鹽酸金霉素后的血漿藥物濃度顯著高于鹽酸金霉素。

表1 單劑量(20 mg/kg)灌服鹽酸金霉素和超級(jí)鹽酸金霉素后血藥濃度

圖2 單劑量(20 mg/kg)灌服鹽酸金霉素和超級(jí)鹽酸金霉素后的藥時(shí)曲線(Mean±SE, n=8)

2.3 藥動(dòng)學(xué)參數(shù)的計(jì)算

用WinNonlin軟件的非房室模型,計(jì)算各種藥動(dòng)學(xué)參數(shù)。單劑量(20 mg/kg)灌服給藥后,鹽酸金霉素和超級(jí)鹽酸金霉素的藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)如表2所示。其中,AUCall為t0到t10 h的藥時(shí)曲線下面積,AUCExtrap為根據(jù)AUClast外推得到的藥時(shí)曲線下面積,MRTlast為平均滯留時(shí)間。

表2 單劑量(20 mg/kg)灌服鹽酸金霉素和超級(jí)鹽酸金霉素后的藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)(n=8)

單劑量(20 mg/kg)灌服超級(jí)鹽酸金霉素后峰濃度為(4.69±0.54) μg/mL,顯著高于鹽酸金霉素(1.91±0.33) μg/mL(圖2,表2)。表明超級(jí)鹽酸金霉素的吸收速度快于鹽酸金霉素原粉,可快速發(fā)揮藥效。超級(jí)鹽酸金霉素單劑量(20 mg/kg)灌服給藥后AUCall為(14.51±1.20) hr·μg·mL-1,顯著高于鹽酸金霉素的AUCall(6.28±0.95) hr·μg·mL-1(圖2,表2),表明超級(jí)鹽酸金霉素到達(dá)全身血液循環(huán)的量也顯著高于鹽酸金霉素,有利于藥物迅速到達(dá)病灶發(fā)揮藥效。

2.4 殘留試驗(yàn)

連續(xù)灌服(20 mg/kg)鹽酸金霉素和超級(jí)鹽酸金霉素7 d后,組織樣品中鹽酸金霉素的殘留量測(cè)定結(jié)果如表3所示。最后1次給藥后24 h,檢測(cè)肌肉和肝臟中鹽酸金霉素和超級(jí)鹽酸金霉素的殘留量接近或低于檢測(cè)限(組織殘留量低于10 μg/kg),遠(yuǎn)低于食用動(dòng)物肌肉中鹽酸金霉素的殘留限量(肌肉殘留限量為100 μg/kg,肝臟中的殘留限量為300 μg/kg),腎組織中鹽酸金霉素和超級(jí)鹽酸金霉素的殘留量分別為(306±58) μg/kg和(857±255) μg/kg。鹽酸金霉素低于超級(jí)鹽酸金霉素在食用動(dòng)物肌肉中的殘留限量(600 μg/kg),超級(jí)鹽酸金霉素接近殘留限量(表3)。

表3 連續(xù)給藥7 d后鹽酸金霉素和超級(jí)鹽酸金霉素在組織中的殘留量

3 討論與結(jié)論

四環(huán)素類抗生素在許多國(guó)家普遍應(yīng)用于人類、家畜和家禽[16]。在該試驗(yàn)中,單劑量(20 mg/kg)灌服鹽酸金霉素和超級(jí)鹽酸金霉素肉雞的藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)如表2所示。從藥時(shí)曲線(圖2)和血藥濃度(表1)可知,鹽酸金霉素和超級(jí)鹽酸金霉素均表現(xiàn)出雙峰現(xiàn)象,表明大多數(shù)藥物通過(guò)膽汁排入腸道,再重新吸收,具有明顯的肝腸循環(huán)現(xiàn)象,與文獻(xiàn)報(bào)道一致。

雖然超級(jí)鹽酸金霉素和鹽酸金霉素的Tmax無(wú)顯著性差異,但是單劑量(20 mg/kg)灌服超級(jí)鹽酸金霉素肉雞的Cmax為(4.69±0.54) μg/mL,鹽酸金霉素的Cmax為(1.91±0.33) μg/mL。此外,超級(jí)鹽酸金霉素的血漿清除率(CL)低于鹽酸金霉素的清除率[(1 362±110) mL·hr-1·kg-1vs (3 277±429) mL·hr-1·kg-1]。由此可見(jiàn),超級(jí)鹽酸金霉素可在肉雞體內(nèi)滯留較長(zhǎng)時(shí)間,有利于長(zhǎng)期發(fā)揮其藥效。造成此差異的原因可能是相比鹽酸金霉素,超級(jí)鹽酸金霉素的溶解度更高,也有可能是超級(jí)鹽酸金霉素的滲透速率快于鹽酸金霉素。

單次灌服(20 mg/kg)超級(jí)鹽酸金霉素后,血藥濃度-時(shí)間曲線下面積(AUCall)顯著高于鹽酸金霉素[(14.51±1.20) hr·μg·mL-1vs (6.28±0.95) hr·μg·mL-1](圖2)。表明超級(jí)鹽酸金霉素在肉雞血液循環(huán)中的量顯著高于鹽酸金霉素,肉雞的吸收速率和吸收程度也顯著高于鹽酸金霉素。這可能與其溶解度和滲透性增加有關(guān),導(dǎo)致其在胃腸道的吸收加快。超級(jí)鹽酸金霉素的表觀分布容積(VZ)小于鹽酸金霉素[(4 125±378) mL/kg vs (11 197±2 592) mL/kg](表2)。表明超級(jí)鹽酸金霉素在血漿中的濃度高于組織中的濃度。而鹽酸金霉素的表觀分布容積為10～20 L/kg,表明藥物主要分布在細(xì)胞外液中。單劑量(20 mg/kg)灌服超級(jí)鹽酸金霉素后的平均滯留時(shí)間(MRTlast)與鹽酸金霉素類似。

此外,超級(jí)鹽酸金霉素的溶解度顯著高于鹽酸金霉素。在灌服藥物配制過(guò)程中,經(jīng)過(guò)5 min的超聲和2次渦旋混合后,鹽酸金霉素仍有一些不溶性沉淀物,需要多次震蕩混勻和超聲才能完全溶解,而超級(jí)鹽酸金霉素的溶解性較好。

據(jù)報(bào)道,鹽酸金霉素的停藥時(shí)間為2.84 d[17],腎臟的殘留量應(yīng)小于95%,因此在實(shí)際應(yīng)用中應(yīng)適當(dāng)延長(zhǎng)停藥期[18]。超級(jí)鹽酸金霉素具有更小、更規(guī)則的球形,增加了比表面積和與介質(zhì)的接觸面積,從而提高了金霉素的溶解度和溶出速率。與晶態(tài)相比,非晶態(tài)的高內(nèi)能和比表面積可加快溶出速率,提高生物利用度[19]。

由于超級(jí)鹽酸金霉素具有較快的吸收速度和較大的吸收程度,呈現(xiàn)為較高的血藥濃度和生物利用度,表明超級(jí)鹽酸金霉素在臨床治療中可替代鹽酸金霉素。這項(xiàng)研究是臨床試驗(yàn)的基礎(chǔ),也為臨床更謹(jǐn)慎地使用鹽酸金霉素提供了依據(jù)。給藥劑量應(yīng)為20 mg/kg,連續(xù)7 d混飲給藥,治療后需設(shè)定合理的停藥期,以確保動(dòng)物性食品的安全。