劉麗莉

李 丹

楊陳柳

孟圓圓

代曉凝

(河南科技大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，河南 洛陽 471023)

牛骨膠原蛋白酶解工藝優(yōu)化及結(jié)構(gòu)特性分析

劉麗莉

李 丹

楊陳柳

孟圓圓

代曉凝

(河南科技大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，河南 洛陽 471023)

牛骨；膠原蛋白；酶解；結(jié)構(gòu)特性

近年來，隨著人們對肉制品需求的增加，其副產(chǎn)物——動物骨骼的加工利用受到研究學(xué)者的廣泛關(guān)注。動物骨骼中含有如蛋白質(zhì)、氨基酸、礦物質(zhì)、軟骨素、骨膠等具有保健作用的功能物質(zhì)[1]，其所含的蛋白質(zhì)中，膠原蛋白占到90%以上，能夠促進人體皮下組織的代謝功能，還可以延緩衰老[2]。但膠原蛋白具有特殊的三股螺旋結(jié)構(gòu)，難以被人體消化吸收。而膠原蛋白肽是膠原的三股螺旋結(jié)構(gòu)中分子鏈被斷開形成的小分子蛋白，是一類具有較強的水溶性、蛋白含量高且黏度較低、極易被人體吸收的產(chǎn)物，具有抗氧化、降血壓、降血脂的功能特性[3-5]。

目前多數(shù)研究學(xué)者將微生物與骨膠原相結(jié)合進行發(fā)酵降解，如張宇等[6]的研究表明采用紅曲菌與米曲菌復(fù)合發(fā)酵豬骨能夠較好地降解骨膠原；彭慧莉[7]采用乳酸菌發(fā)酵豬骨泥，有效提升了其利用價值。有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)，與微生物發(fā)酵法相比，酶解法降解骨骼時間短，效率高，更適合應(yīng)用到實際生產(chǎn)，如蔡麗華等[8]將堿性蛋白酶作用到牛骨來制備降壓肽；趙妍嫣等[9]采用胰蛋白酶作用于骨膠原，結(jié)果表明與膠原蛋白相比，酶解后的蛋白肽有更好的乳化性和溶解性；Zhang Yuhao等[10]將牛骨膠原通過6種常規(guī)蛋白酶處理與未處理的進行對比發(fā)現(xiàn)，處理后的產(chǎn)物膠原蛋白肽可以降低血壓。但這些研究所采用的蛋白酶對骨骼的降解程度仍未達到較佳的工業(yè)利用價值。本課題組前期曾純化出了具有特異性降解牛骨膠原蛋白的膠原蛋白酶(Bone-specific collagenase，BSC)，較其他蛋白酶其對牛骨膠原蛋白有更好的降解效果。本研究擬對膠原蛋白酶酶解牛骨膠原蛋白的工藝進行優(yōu)化，并進行結(jié)構(gòu)特性分析，為今后的工業(yè)化生產(chǎn)提供理論依據(jù)。

1 材料與設(shè)備

1.1 材料與試劑

新鮮牛骨頭：購買于河南省洛陽市大張購物中心；

溴化鉀、乙醇、3-甲氧基-4’-N，N-二甲氨基黃酮、甲醛：分析純，天津市德恩化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

高速冷凍離心機：H1650型，湖南湘儀實驗室儀器開發(fā)有限公司；

pH計：PHS-3C型，上海精科有限公司；

熒光分光光度計：RF-5301PC型，日本島津有限公司；

紫外可見分光光度計：UV2600型，日本島津有限公司；

FT-IR紅外光譜儀：Perten DA7200型，德國Bruker公司；

掃描電鏡：JSM-IT500型，日本Jeol有限公司。

1.3 方法

1.3.1 牛骨膠原蛋白的制備 將新鮮采購的牛骨骼除去表面牛肉纖維，在高溫高壓下蒸煮20 min后將其分成顆粒，采用乙醚回流脫脂(40 ℃)，0.48%鹽酸脫鈣，骨粒徑為5 mm×10 mm，提取膠原的介質(zhì)為1%檸檬酸和1%胃蛋白酶復(fù)合液。經(jīng)真空冷凍干燥獲得牛骨I型膠原蛋白[11]。

1.3.2 BSC酶的制備流程

(1) 菌種發(fā)酵培養(yǎng)基：蔗糖1 g/100 mL，胰蛋白胨2 g/100 mL，氯化鈣 0.05 g/100 mL，磷酸二氫鈉 0.05 g/100 mL，磷酸氫二鉀 0.25 g/100 mL，pH值6.6～6.8。

(2) 將活化好的B.cereusMBL13-U菌株在35 ℃，160 r/min 的條件下連續(xù)發(fā)酵46 h，收集發(fā)酵液12 000 r/min，4 ℃ 離心25 min，收集上清液即為BSC酶的粗酶液，將其依次通過硫酸銨分級沉淀、DEAE-Sepharose Fast Flow離子交換層析、Sephadex G-100凝膠層析，最終得到分子量為52 kDa 的BSC酶。

1.3.3 BSC酶解牛骨膠原蛋白的酶解工藝 向牛骨膠原蛋白中加入適量的BSC酶，調(diào)節(jié)pH值，置于恒溫培養(yǎng)搖床中進行酶解反應(yīng)，反應(yīng)結(jié)束后90 ℃滅酶15 min，12 000 r/min離心15 min，將上清液干燥后得到膠原蛋白肽。

酶解液中水解度的測定：采用甲醛滴定法[12]。

1.3.4 BSC酶解牛骨膠原蛋白的工藝優(yōu)化

(1) 單因素試驗：主要選取影響酶解反應(yīng)的5個因素[13]，反應(yīng)溫度(35，40，45，50，55，65 ℃)、牛骨膠原蛋白添加量(1.5，2.5，3.5，4.5，5.5，6.5，7.5 g/100 mL)、BSC酶添加量(0.1，0.2，0.3，0.4，0.5，0.6，0.7 g/100 mL)、反應(yīng)時間(1，2，3，4，5，6，7，8，9 h)、pH值(4.0，5.0，6.0，7.0，8.0，9.0，10.0)。固定酶解參數(shù)為：反應(yīng)溫度 35 ℃、牛骨膠原蛋白添加量 3.5 g/100 mL、BSC酶添加量 0.4 g/100 mL、反應(yīng)時間 5 h、pH值 7.0，分別改變其中一因素，進行單因素試驗，研究其對水解度的影響，得出最佳反應(yīng)參數(shù)。

(2) 響應(yīng)曲面優(yōu)化試驗：在單因素試驗基礎(chǔ)上，采用五元二次正交旋轉(zhuǎn)試驗組合設(shè)計，以反應(yīng)溫度、牛骨膠原蛋白添加量、BSC酶添加量、反應(yīng)時間、pH值為考察因素，以水解度為響應(yīng)值(Y)，得出酶解最適工藝參數(shù)組合。

1.3.5 牛骨膠原蛋白及膠原蛋白肽的結(jié)構(gòu)特性

(1) 紫外光譜分析：將酶解0，2，4，6 h的膠原蛋白肽液在紫外-可見光分光光度計上進行全波長掃描，波長范圍為215 ～250 nm。

(2) 熒光光譜分析：將3-甲氧基-4′-N，N-二甲氨基黃酮溶于乙醇中作為熒光探針，分別加入酶解0，2，4，6 h的膠原蛋白肽液中，設(shè)置激發(fā)波長380 nm，發(fā)射波長465 nm[14]，分別將其放入熒光分光光度計中進行掃描。

(3) 紅外光譜分析：分別將牛骨膠原蛋白和膠原蛋白肽與適量的溴化鉀充分混合后壓片制樣，將其放入FT-IR紅外光譜儀中在400～4 000 cm-1波長下進行掃描[15]。

(4) 掃描電鏡分析：分別將酶解0，2，4，6 h后的牛骨膠原蛋白真空冷凍干燥后進行噴金處理，再將樣品放入掃描電鏡下觀察表面結(jié)構(gòu)的變化。

1.3.6 數(shù)據(jù)處理 采用Origin 8.5、Design Expert 8.0軟件對本試驗數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗結(jié)果分析

不同酶解條件對水解度的影響見圖1。

由圖1(a)可知，水解度隨反應(yīng)溫度的增加先升高后急速下降，在45 ℃時最大。這是因為隨著溫度的上升，膠原蛋白的三股螺旋結(jié)構(gòu)逐漸展開，BSC酶的催化活性增強，但過高的溫度會逐漸破壞BSC酶的分子結(jié)構(gòu)，活性降低，直到失活，同時也會改變產(chǎn)物的形成方向，導(dǎo)致水解度直線下降。因此，選取最佳反應(yīng)溫度為45 ℃。

由圖1(b)可知，隨著牛骨膠原蛋白添加量的逐漸增加，溶質(zhì)流動性較好，使牛骨膠原蛋白與BSC酶充分結(jié)合，水解度逐漸上升，當(dāng)牛骨膠原蛋白添加量達到4.5 g/100 mL時水解度最高，但隨其添加量的繼續(xù)增加，溶液黏度增大，阻礙了反應(yīng)進行，水解度降低。因此，選取最佳牛骨膠原蛋白添加量為4.5 g/100 mL。

由圖1(c)可知，水解度的變化隨著BSC酶添加量的增加先升高后緩慢降低，當(dāng)BSC酶添加量為0.3 g/100 mL時水解度最大，認(rèn)為在牛骨膠原蛋白含量一定時，BSC酶添加量的增加會加大兩者結(jié)合程度，使水解度不斷上升，但過多BSC酶的加入使牛骨膠原蛋白相對不足，導(dǎo)致反應(yīng)進程減弱，水解度下降[16]。因此，選取最佳BSC酶添加量為0.3 g/100 mL。

由圖1(d)可知，隨反應(yīng)時間的增加，BSC酶與牛骨膠原蛋白的結(jié)合作用不斷加大，在6 h時兩者充分作用，水解度最大，若反應(yīng)時間繼續(xù)延長，牛骨膠原蛋白濃度逐漸降低，BSC酶催化位點不斷減少，水解度下降[17]。因此，選取最佳反應(yīng)時間為6 h。

由圖1(e)可知，隨pH值的升高，水解度也逐漸加大，在pH 7.0時達到最大，但pH值進一步升高水解度快速降低，原因是pH值對BSC酶活性的相關(guān)基團影響較大，環(huán)境過酸或過堿都會破壞其分子構(gòu)象，活性降低，同時還會影響牛骨膠原蛋白與BSC酶在反應(yīng)中的解離狀態(tài)，抑制反應(yīng)的進行。因此，選取最佳pH值為7.0。

2.2 響應(yīng)曲面優(yōu)化試驗結(jié)果分析

在2.1得到最佳單因素條件(見表1)基礎(chǔ)上，采用五元二次正交旋轉(zhuǎn)組合試驗設(shè)計對酶解工藝進行優(yōu)化，設(shè)計方案及結(jié)果和方差分析見表2、3。

圖1 酶解條件對水解度的影響

水平X1反應(yīng)溫度/℃X2牛骨膠原蛋白添加量/(10-2g·mL-1)X3BSC酶添加量/(10-2g·mL-1)X4反應(yīng)時間/hX5pH值-2351.50.22.05.0-1403.00.33.56.00454.50.45.07.01506.00.56.58.02557.50.68.09.0

表2五元二次正交旋轉(zhuǎn)組合試驗設(shè)計方案及結(jié)果

Table 2 Quadratic orthogonal rotary composite experimen-tal design (in coded level of five variables)and experimental result (n=3)

試驗號X1X2X3X4X5Y水解度/%11111125.592111-1-124.93311-11-129.23411-1-1118.3651-111-124.0261-11-1116.7171-1-11122.6181-1-1-1-120.369-1111-128.6110-111-1129.2311-11-11122.6212-11-1-1-120.2813-1-111123.7614-1-11-1-117.9115-1-1-11-121.2816-1-1-1-1117.2517-2000021.68182000024.49190-200018.75200200024.052100-20017.67220020023.5623000-2023.03240002026.99250000-225.56260000223.28270000032.65280000032.51290000030.08300000033.57310000028.33320000028.86330000029.74340000033.68350000032.19360000031.15

采用Design Expert 8.0對優(yōu)化結(jié)果進行多元回歸擬合，得出回歸方程為：

(1)

表3 方差分析表

表3結(jié)果表明，擬合的二次回歸方程極顯著，失擬項P值不顯著(P=0.367 1>0.05)，決定系數(shù)R2為93.07%，模型擬合度較高，證明所建立的模型有效可用。由F值高低得五因素對水解度的影響依次為：牛骨膠原蛋白添加量、反應(yīng)時間、BSC酶添加量、pH值、反應(yīng)溫度。

本試驗構(gòu)建的模型在α=0.05顯著水平下剔除不顯著水平后的方程為：

(2)

2.3 構(gòu)建模型的等高線與響應(yīng)面分析

由圖2可知，在最佳值的范圍外響應(yīng)面比較陡峭，表明當(dāng)其他3因素為定值時，水解度對BSC酶添加量和反應(yīng)溫度的變化敏感，兩者等高線圖為橢圓狀，表明BSC酶添加量和反應(yīng)溫度有較為明顯的交互作用[18]。從等高線圖分析表明，當(dāng)固定牛骨膠原蛋白添加量5.14 g/100 mL、反應(yīng)時間6.06 h、pH 6.57時，BSC酶添加量在0.35～0.50 g/100 mL，反應(yīng)溫度在40.6～49.2 ℃時，兩者交互作用最明顯，水解度達到30%。

圖3中反應(yīng)溫度和pH值的響應(yīng)面圖顯示，在最佳值的范圍外響應(yīng)面陡峭，表明當(dāng)其他3因素不變時，pH值和反應(yīng)溫度的變化對水解度影響較大，等高線圖呈明顯橢圓狀反映出兩者有較為明顯的交互作用。等高線圖分析表明，當(dāng)牛骨膠原蛋白添加量5.14 g/100 mL、反應(yīng)時間6.06 h、BSC酶添加量0.42 g/100 mL時，反應(yīng)溫度在44.0～47.6 ℃，pH在6.3～7.1時交互作用達到最大，水解度在31%以上。

圖3 反應(yīng)溫度和pH值對水解度影響的響應(yīng)面和等高線圖

2.4 BSC酶解牛骨膠原蛋白的工藝優(yōu)化及驗證

經(jīng)五元二次正交旋轉(zhuǎn)試驗及響應(yīng)面優(yōu)化法，采用Design Expert 8.0軟件和回歸方程分析可得BSC酶解牛骨膠原蛋白的最佳工藝為：反應(yīng)溫度46 ℃、牛骨膠原蛋白添加量5.14 g/100 mL、BSC酶添加量0.42 g/100 mL、反應(yīng)時間6 h、pH值為6.5，對此條件進行驗證實驗，重復(fù)6次，得到水解度為34.98%，與預(yù)測值相差1.15%，誤差較小，此條件下試驗可行。

2.5 紫外光譜分析

圖4為不同酶解時間下膠原蛋白肽的紫外光譜掃描圖。

由圖4可知，I、II、Ⅲ、Ⅳ均在220～230 nm內(nèi)出現(xiàn)膠原蛋白及膠原蛋白肽的特征吸收，并且特征吸收峰隨著酶解時間的延長發(fā)生紅移，說明膠原蛋白肽中生色基團的分布有所改變，牛骨膠原蛋白在BSC酶作用下三股螺旋結(jié)構(gòu)逐漸打開，分子表面C═O、CONH2、COOH等具有紫外吸收的生色基團逐步增多[19]，導(dǎo)致紫外吸光度逐漸增大。

Ⅰ～Ⅳ酶解時間分別為0，2，4，6 h

2.6 熒光光譜分析

圖5為不同酶解時間下膠原蛋白肽的熒光光譜掃描圖。

Ⅰ～Ⅳ酶解時間分別為0，2，4，6 h

2.7 紅外光譜分析

圖6為牛骨膠原蛋白和降解物膠原蛋白肽的紅外光譜圖。

圖6 牛骨膠原蛋白和膠原蛋白肽的紅外光譜分析

由圖6可知，牛骨膠原蛋白和膠原蛋白肽分別在3 312.35，3 267.96 cm-1處呈現(xiàn)明顯的吸收峰，這是由N—H伸縮振動引起的，是蛋白的特征吸收，經(jīng)BSC酶降解作用，牛骨膠原蛋白的吸收峰發(fā)生紅移，是酶解后的膠原蛋白肽中N—H伸縮振動與氫鍵形成了締合體[20]所導(dǎo)致的。膠原蛋白肽在2 922.63 cm-1出現(xiàn)強吸收峰，是—CONH—的特征吸收峰，表明酶解產(chǎn)物為膠原多肽。1 360～1 200 cm-1為酰胺Ⅲ帶，二者在此波數(shù)范圍內(nèi)均出現(xiàn)特征吸收，為C—H伸縮振動和N—H彎曲振動所產(chǎn)生的，但是膠原蛋白肽具有較強的吸收峰，表明在BSC酶作用下牛骨膠原蛋白的肽鏈發(fā)生斷裂，酶解后的膠原蛋白肽二級結(jié)構(gòu)居多，由圖6(b)可知，經(jīng)過酶解的膠原蛋白肽在1 275.75 cm-1處出現(xiàn)強吸收峰，是β-轉(zhuǎn)角伸縮振動引起的，表明膠原蛋白肽結(jié)構(gòu)中以β-轉(zhuǎn)角為主，可能是酶解過程中有較多的游離脯氨酸，其分子中的環(huán)狀結(jié)構(gòu)和平面角對β-轉(zhuǎn)角的形成具有催化作用。

2.8 掃描電鏡分析

圖7為不同酶解時間下牛骨膠原蛋白的掃描電鏡圖。

圖7 不同酶解時間下牛骨膠原蛋白的掃描電鏡圖

由圖7可知，BSC酶對牛骨膠原蛋白的表面結(jié)構(gòu)影響較大，其中圖7(a)中牛骨膠原蛋白的表面結(jié)構(gòu)為細絲狀，但圖7(b)、(c)、(d)顯示牛骨膠原蛋白的表面結(jié)構(gòu)隨著酶解時間的延長而逐漸被剝離，這是由于BSC酶將牛骨膠原蛋白中的I型膠原蛋白降解為小分子多肽，破壞了其完整的表面結(jié)構(gòu)，使牛骨膠原蛋白中所含的大分子物質(zhì)I型膠原蛋白越來越多地暴露在表面，加快了BSC酶的作用，水解越來越顯著，導(dǎo)致緊密結(jié)合的細絲狀表面結(jié)構(gòu)變得更加疏松。

3 結(jié)論

(1) 本試驗將前期分離純化得到的BSC酶作用于牛骨膠原蛋白，以水解度為指標(biāo)，在單因素試驗基礎(chǔ)上，采用五元二次正交旋轉(zhuǎn)試驗和響應(yīng)面優(yōu)化法得出酶解的最佳工藝參數(shù)為反應(yīng)溫度46 ℃、牛骨膠原蛋白添加量5.14 g/100 mL、BSC酶添加量0.42 g/100 mL、反應(yīng)時間6 h、pH 6.5，在此條件下進行驗證實驗，得到水解度為34.98%。

[1] 孫蓓, 王龍剛. 畜禽骨的綜合利用現(xiàn)狀及發(fā)展前景[J]. 中國調(diào)味品, 2011, 36(4): 1-4.

[2] 刁靜靜, 孔保華, 陳洪生. 骨蛋白水解物的功能特性及抗氧化性的研究進展[J]. 肉類研究, 2007(6): 26-29.

[3] BANERJEE P, MEHTA A, SHANTHI C. Investigation into the cyto-protective and wound healing properties of cryptic peptides from bovine Achilles tendon collagen[J]. Chemico-Biological Interactions, 2014, 211(229): 1-10.

[5] TOOPCHAM T, MES J J, WICHERS H J, et al. Bioavailabili-ty of angiotensin I-converting enzyme (ACE) inhibitory peptides derived from Virgibacillus halodenitrificans SK1-3-7 proteinases hydrolyzed tilapia muscle proteins[J]. Food Chemistry, 2017, 220: 190-197.

[6] 張宇, 鄔應(yīng)龍, 黃祎萌. 單菌和雙菌固態(tài)發(fā)酵豬骨素的研究[J]. 食品工業(yè)科技, 2013, 34(22): 179-182.

[7] 彭慧莉. 酶解和乳酸菌發(fā)酵豬骨的工藝研究[D]. 成都: 西華大學(xué), 2013: 100-120.

[8] 蔡麗華. 牛骨酶解制備血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制肽的研究[D]. 武漢: 華中農(nóng)業(yè)大學(xué), 2010: 112-135.

[9] 趙妍嫣, 胡林林, 方芳, 等. 骨膠原蛋白的酶解工藝條件[J]. 食品科學(xué), 2010, 31(22): 153-155.

[10] ZHANG Yu-hao, MA Liang, CAI Lu-yun, et al. Effect of combined ultrasonic and alkali pretreatment on enzymatic preparation of angiotensin converting enzyme (ACE) inhibitory peptides from native collagenous materials[J]. Ultrasonics Sonochemistry, 2017, 36: 88-94.

[11] 劉麗莉, 馬美湖, 楊協(xié)力. 牛骨Ⅰ型膠原蛋白提取及結(jié)構(gòu)表征[J]. 食品科學(xué), 2010, 31(2): 87-91.

[12] 肖嵐, 李誠, 付剛, 等. 5種蛋白酶對豬皮膠原蛋白水解效果的比較研究[J]. 食品研究與開發(fā), 2015, 36(17): 10-14.

[13] 李燕, 徐靜, 吳祥庭, 等. 鹵雞腿廢棄液酶解工藝優(yōu)化及其抗氧化活性研究[J]. 食品與機械, 2013, 29(6): 153-157.

[14] 張小燕. 膠原蛋白肽生物功能材料的研究與開發(fā)[D]. 西安: 西北工業(yè)大學(xué), 2006: 80-96.

[15] 吳雷, 鄭娟, 劉文濤, 等. 雞關(guān)節(jié)軟骨II型膠原蛋白結(jié)構(gòu)及性能表征[J]. 食品與發(fā)酵工業(yè), 2016, 42(11): 86-90.

[16] 朱瀛, 趙改名, 柳艷霞, 等. 中性蛋白酶水解雞骨泥制備短肽工藝優(yōu)化[J]. 農(nóng)業(yè)工程學(xué)報, 2016, 32(12): 309-314.

[17] 石嶺, 趙利, 袁美蘭, 等. 響應(yīng)面法優(yōu)化堿性蛋白酶酶解草魚蛋白質(zhì)[J]. 食品科學(xué), 2014, 35(4): 26-29.

[18] 張麗紅, 謝三都, 徐芳, 等. 紫蘇葉多糖活性炭脫色工藝優(yōu)化[J]. 食品與機械, 2015, 31(3): 224-230.

[19] 楊露, 丁利君, 藍德安. 馬面魚骨膠原多肽的理化特性及其抗氧化活性[J]. 食品科學(xué), 2013, 34(11): 109-112.

[20] 琚海燕, 劉新華, 但衛(wèi)華, 等. 牛跟腱Ⅰ型膠原纖維的微觀結(jié)構(gòu)與理化性能分析[J]. 功能材料, 2015(15): 15 031-15 034.

Optimization of Enzymatic hydrolysis process and analysis of structural properties on bovine bone crude collagen

LIULi-li

LIDan

YANGChen-liu

MENGYuan-yuan

DAIXiao-ning

(CollegeofFoodandBioengineering,HenanUniversityofScienceandTechnology,Luoyang,Henan471023,China)

novel collagenase; bovine bone collagen; enzymatic hydrolysis; optimization; structural properties

國家自然科學(xué)基金(編號：31401622)；公益性行業(yè)(農(nóng)業(yè))科研專項(編號：201303084)；河南省重點攻關(guān)項目(編號：152102110080)；河南省教育廳自然科學(xué)研究項目(編號：13A550255)；河南省重大專項(編號：161100110900)

劉麗莉(1974—)，女，河南科技大學(xué)副教授，博士。 E-mail：yangliuyilang@126.com

2017—04—11

10.13652/j.issn.1003-5788.2017.07.009