呂興華，冷玉芳，楊艷妮，蘇玉潔，王朋，鄭貫崢

（蘭州大學(xué)第一醫(yī)院，甘肅蘭州730000）

青藤堿對(duì)腎缺血再灌注大鼠腎組織Fas/FasL蛋白表達(dá)水平影響的探討

呂興華，冷玉芳*，楊艷妮，蘇玉潔，王朋，鄭貫崢

（蘭州大學(xué)第一醫(yī)院，甘肅蘭州730000）

目的探討青藤堿對(duì)腎缺血再灌注大鼠腎組織Fas、FasL蛋白表達(dá)水平的影響。方法選取健康雄性Wistar大鼠72只，體重180～220 g，隨機(jī)分為假手術(shù)組（S組）、空白給藥組（SS組）、腎缺血再灌注損傷模型組（I/R組）、青藤堿組（SIN組），每組18只。I/R組、SIN組游離雙側(cè)腎蒂，用無(wú)創(chuàng)動(dòng)脈夾夾閉左腎腎蒂，使左腎缺血，45分鐘后松開(kāi)動(dòng)脈夾再灌注，并即刻切除右腎，建立腎缺血再灌注損傷模型。S組、SS組僅游離雙側(cè)腎蒂，不夾閉左腎腎蒂。SIN組、SS組于缺血后15分鐘（即再灌注前30分鐘）向腹腔注射青藤堿注射液60mg/kg，I/R組、S組于同一時(shí)間向腹腔注射等量生理鹽水。再灌注后6小時(shí)（T1）、12小時(shí)（T2）、24小時(shí)（T3）穿刺心臟采血，用全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)血清Cr、BUN濃度；摘除左腎，光鏡下觀察腎組織病理學(xué)變化，用免疫組化法檢測(cè)腎組織Fas、FasL蛋白表達(dá)水平，用TUNEL法檢測(cè)并計(jì)算腎小管上皮細(xì)胞凋亡率。結(jié)果S組與SS組大鼠在T1、T2、T3的血清Cr、BUN濃度，F(xiàn)as、FasL蛋白表達(dá)水平，腎小管上皮細(xì)胞凋亡率比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0．05）；與S組比較，I/R組、SIN組T1、T2、T3的血清Cr、BUN濃度升高（P＜0．05），腎組織病理?yè)p傷加重，腎組織Fas、FasL蛋白表達(dá)水平升高（P＜0．05），腎小管上皮細(xì)胞凋亡率升高（P＜0．05）；與I/R組比較，SIN組T1、T2、T3的血清Cr、BUN濃度降低（P＜0．05），腎組織病理?yè)p傷減輕，腎組織Fas、FasL蛋白表達(dá)水平下降（P＜0．05），腎小管上皮細(xì)胞凋亡率下降（P＜0．05）；與T2比較，I/R組和SIN組T3的Fas蛋白表達(dá)水平、細(xì)胞凋亡率升高（P＜0．05）。結(jié)論青藤堿可顯著降低大鼠腎I/R病理過(guò)程中Fas、FasL蛋白的表達(dá)水平，從而減少腎小管上皮細(xì)胞的凋亡，有助于減輕I/R時(shí)腎臟的損傷。

青藤堿；腎臟；缺血再灌注損傷；Fas蛋白；FasL蛋白

腎臟是機(jī)體的高灌注器官，對(duì)缺血缺氧十分敏感，休克、創(chuàng)傷、腎移植等均可導(dǎo)致腎缺血再灌注損傷（I/R）。研究發(fā)現(xiàn)，I/R的發(fā)生發(fā)展與凋亡、炎癥、自由基生成等機(jī)制密切相關(guān)[1－2]。細(xì)胞凋亡受多種基因調(diào)控，是促進(jìn)凋亡和抑制凋亡相互平衡的結(jié)果。而Fas/FasL被認(rèn)為是參與細(xì)胞凋亡的重要因子[3－4]。研究發(fā)現(xiàn)，青藤堿（SIN）對(duì)大鼠I/R具有保護(hù)作用[5－6]，但SIN能否通過(guò)抑制Fas/FasL的表達(dá)從而抑制腎小管上皮細(xì)胞的凋亡尚不清楚。本實(shí)驗(yàn)以大鼠腎I/R模型為基礎(chǔ)，以青藤堿（SIN）作為干預(yù)手段，測(cè)定腎臟組織中Fas、FasL蛋白表達(dá)水平的變化，現(xiàn)介紹如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選擇健康雄性Wistar大鼠72只（由蘭州大學(xué)醫(yī)學(xué)院動(dòng)物中心提供），體重180～220 g，飼養(yǎng)溫度23℃～25℃，相對(duì)濕度55%～60%，自由進(jìn)食水。采用隨機(jī)數(shù)字表法分為假手術(shù)組（S組）、空白給藥組（SS組）、腎缺血再灌注損傷模型組（I/R組）、青藤堿組（SIN組），每組18只。

1.2 方法

本研究參照Basile DP、姚愛(ài)軍等[7－8]的實(shí)驗(yàn)方法制備大鼠腎缺血再灌注損傷模型。向I/R組及SIN組大鼠腹腔注射10%水合氯醛350mg/kg麻醉，俯臥位固定，備皮、消毒，于脊柱旁1．0 cm、肋緣下0．5 cm取約1．5 cm的切口，游離雙側(cè)腎蒂，用無(wú)創(chuàng)動(dòng)脈夾夾閉左腎腎蒂，腎臟由紅色變?yōu)榘岛稚硎救毖晒?，缺?5分鐘后松開(kāi)左腎動(dòng)脈夾并立即切除右腎，左腎由暗褐色轉(zhuǎn)為紅色表示再灌注成功。S組及SS組大鼠僅游離雙側(cè)腎蒂，用生理鹽水紗布覆蓋切口，45分鐘后切除右腎。4組切除右腎后均行碘伏消毒，逐層縫合切口，敷以青霉素粉預(yù)防感染。SIN組、SS組于缺血后15分鐘（即再灌注前30分鐘）向腹腔注射青藤堿注射液（規(guī)格：2 ml：50 mg；批號(hào)：1312417－019；湖南正清制藥集團(tuán)股份有限公司生產(chǎn)）60mg/kg，S組、I/R組于同一時(shí)間向腹腔注射等量生理鹽水。

各組分別于再灌注6小時(shí)（T1）、12小時(shí)（T2）、24小時(shí)（T3）隨機(jī)選取大鼠6只，向腹腔注射10%水合氯醛350mg/kg，麻醉后打開(kāi)腹腔，穿刺心臟采血3～5m l，并摘除左腎。血標(biāo)本3 000r/min離心10分鐘，取上清液，用全自動(dòng)生化分析儀（LX20，Beckman Coulter）測(cè)定血清肌酐（Cr）、尿素氮（BUN）濃度。腎臟標(biāo)本用10%多聚甲醛溶液固定，石蠟包埋、切片（3μm）。隨機(jī)選取每個(gè)腎臟標(biāo)本的切片2張用于HE染色，光鏡（×400，Olympus）下觀察大鼠腎臟病理變化。

采用非生物素二步免疫組織化學(xué)法檢測(cè)大鼠腎臟Fas、FasL蛋白表達(dá)水平。切片脫蠟至水，檸檬酸鈉抗原修復(fù)，3%過(guò)氧化氫封閉內(nèi)源性過(guò)氧化物酶，滴加Fas、FasL兔抗大鼠多克隆抗體（批號(hào)分別為：BA0484、BA0049，濃度分別為1∶400、1∶50，武漢博士德生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)），4℃分別孵育16小時(shí)、18小時(shí)，滴加山羊抗兔二抗。DAB顯色，蘇木素復(fù)染、返藍(lán)，脫水、二甲苯透明、樹(shù)脂封片。光鏡下觀察胞漿出現(xiàn)棕黃色顆?；虬它S染表示陽(yáng)性表達(dá)。每張切片隨機(jī)選取6個(gè)視野，采用Image－Pro Plus 6．0圖像分析處理軟件（Media Cybernetics公司生產(chǎn)）測(cè)定Fas、FasL的積分光密度（IOD），取其平均值。

采用TUNEL檢測(cè)試劑盒（Promega公司生產(chǎn)，美國(guó)）測(cè)定細(xì)胞凋亡情況。石蠟切片脫蠟至水，用蛋白酶K消化，于37℃濕盒中孵育30分鐘，將Equilibration Buffer 98μl、Biotinylated Nucleotide Mix 1μl混合液覆蓋于樣本反應(yīng)區(qū)域，于37℃濕盒中孵育60分鐘。玻片放入20×SSC溶液的染色缸中終止反應(yīng)，室溫放置15分鐘，滴加3%H2O2，30分鐘后加入稀釋的抗生物素蛋白鏈菌素辣根過(guò)氧化物酶溶液，室溫反應(yīng)30分鐘，DAB顯色，封片。在光學(xué)顯微鏡（×400，Olympus公司生產(chǎn)，日本）下觀察、拍照，棕黃色為陽(yáng)性。采用Image－Pro Plus 6．0圖像分析處理軟件計(jì)數(shù)凋亡細(xì)胞數(shù)和總細(xì)胞數(shù)，每個(gè)標(biāo)本隨機(jī)取5張切片，每張切片隨機(jī)選取腎皮質(zhì)部5個(gè)不同視野，取其平均值，計(jì)算細(xì)胞凋亡率（細(xì)胞凋亡率=凋亡細(xì)胞數(shù)÷總細(xì)胞數(shù)× 100%）。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 17．0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件處理數(shù)據(jù)，計(jì)量資料以（x±s）表示，組間比較采用單因素方差分析，組內(nèi)比較采用重復(fù)測(cè)量，P＜0．05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 血清Cr、BUN濃度

S組與SS組大鼠T1、T2、T3的血清Cr、BUN濃度比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0．05）；與S組比較，I/R組、SIN組大鼠T1、T2、T3的血清Cr、BUN濃度升高（P＜0．05）；與I/R組比較，SIN組大鼠T1、T2、T3的血清Cr、BUN濃度降低（P＜0．05），見(jiàn)表1。

表1 各組大鼠不同時(shí)間點(diǎn)血清Cr、BUN濃度比較

表1 各組大鼠不同時(shí)間點(diǎn)血清Cr、BUN濃度比較

注：與S組比較，bP＜0．05；與I/R組比較，cP＜0．05

42．4±5．1 42．4±6．9 187．0±24．5b160．7±33．6bc9．5±1．3 9．2±2．2 36．7±8．6b27．4±4．7bc指標(biāo)Cr（μmol/L）組別T1T2T3BUN（mmol/L）S組SS組I/R組SIN組S組SS組I/R組SIN組43．5±4．8 44．5±4．0 123．3±18．5b106．8±17．0bc9．2±0．8 9．5±0．8 21．5±2．8b17．8±5．8bc43．5±5．2 41．6±4．2 137．6±26．3b113．9±23．3bc9．3±1．1 9．3±0．8 28．6±8．6b22．5±4．0bc

2.2 病理變化

S組、SS組大鼠T1、T2、T3僅見(jiàn)少許腎小管上皮細(xì)胞水腫、小管擴(kuò)張，腎小球毛細(xì)血管輕度擴(kuò)張充血。I/R組大鼠T1、T2、T3部分腎小球囊腔擴(kuò)張，腎小管上皮細(xì)胞壞死脫落至管腔，管腔內(nèi)可見(jiàn)蛋白管型，腎小管上皮細(xì)胞核固縮、濃染、碎裂，凋亡小體形成；胞漿變性，間質(zhì)充血、水腫明顯，并有散在炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。SIN組大鼠T1、T2、T3腎小管上皮細(xì)胞壞死較I/R組輕，少許管腔可見(jiàn)蛋白管型，間質(zhì)充血、水腫減輕，炎性細(xì)胞浸潤(rùn)減少。各組大鼠腎臟組織HE染色圖片見(jiàn)圖1。

圖1 各組大鼠腎臟組織HE染色圖片

2.3 Fas、FasL蛋白表達(dá)水平

S組與SS組大鼠T1、T2、T3的Fas、FasL蛋白表達(dá)水平比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0．05）；與S組比較，I/R組、SIN組大鼠T1、T2、T3的Fas、FasL蛋白表達(dá)水平升高（P＜0．05）；與I/R組比較，SIN組大鼠T1、T2、T3的Fas、FasL蛋白表達(dá)水平降低（P＜0．05）；I/R組和SIN組T3的Fas蛋白表達(dá)水平高于T2（P＜0．05），見(jiàn)表2。各組大鼠腎臟Fas、FasL蛋白表達(dá)免疫組化圖片見(jiàn)圖2～3。

表2 各組大鼠腎臟不同時(shí)間點(diǎn)Fas、FasL蛋白表達(dá)水平比較

表2 各組大鼠腎臟不同時(shí)間點(diǎn)Fas、FasL蛋白表達(dá)水平比較

注：與S組比較，bP＜0．05；與I/R組比較，cP＜0．05；與T2比較，dP＜0．05

61．3±15．1 64．6±13．8 1940．1±727．2bd1369．7±445．8bcd49．2±11．9 48．0±12．2 1186．8±263．2b969．7±220．8bc指標(biāo)Fas T1T2T3FasL組別S組SS組I/R組SIN組S組SS組I/R組SIN組52．7±11．1 61．2±14．6 1 054．8±169．8b877．7±167．7bc44．3±10．7 49．2±10．8 988．1±218．9b811．0±158．9bc62．6±20．9 52．6±14．4 1202．1±299．2b975．6±184．7bc48．6±13．0 44．2±8．4 1018．8±130．2b900．1±88．6bc

圖2 各組大鼠腎臟Fas蛋白表達(dá)免疫組化圖片

圖3 各組大鼠腎臟FasL蛋白表達(dá)免疫組化圖片

2.4 腎小管上皮細(xì)胞凋亡率

S組與SS組腎小管上皮細(xì)胞凋亡率比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0．05）；與S組比較，I/R組和SIN組腎小管上皮細(xì)胞凋亡率升高（P＜0．05）；與I/R組比較，SIN組腎小管上皮細(xì)胞凋亡率降低（P＜0．05）；與T2比較，I/R組和SIN組T3的細(xì)胞凋亡率升高（P＜0．05），見(jiàn)表3。各組大鼠腎小管上皮細(xì)胞凋亡情況見(jiàn)圖4。

表3 各組大鼠不同時(shí)間點(diǎn)腎小管上皮細(xì)胞凋亡率的比較

表3 各組大鼠不同時(shí)間點(diǎn)腎小管上皮細(xì)胞凋亡率的比較

注：與S組比較，bP＜0．05；與I/R組比較，cP＜0．05；與T2比較，dP＜0．05

3．5±0．9 3．9±1．2 27．5±1．7bd15．9±2．1bcd組別S組SS組I/R組SIN組T1T2T33．0±0．5 2．9±0．9 9．8±0．6b7．1±0．4bc3．3±1．2 3．8±1．6 15．7±0．8b9．8±0．6bc

圖4 各組大鼠腎小管上皮細(xì)胞凋亡情況

3 討論

本研究采用左腎缺血期間保留右腎，左腎再灌注時(shí)即刻切除右腎以避免右腎代償?shù)姆椒ㄖ苽浯笫竽I缺血再灌注損傷模型。結(jié)果表明，I/R組大鼠在再灌注6小時(shí)、12小時(shí)、24小時(shí)的血清Cr、BUN濃度升高，病理?yè)p傷明顯，說(shuō)明腎缺血再灌注損傷模型制備成功。本研究參考文獻(xiàn)[9]及預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，選擇腎缺血后15分鐘（即再灌注前30分鐘）向腹腔注射青藤堿60 mg/kg進(jìn)行研究。

腎臟I/R的發(fā)生發(fā)展是一個(gè)極其復(fù)雜的病理生理過(guò)程，其發(fā)病機(jī)制涉及中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)、氧化應(yīng)激損傷、細(xì)胞凋亡、自由基生成等機(jī)制，并有眾多炎性介質(zhì)和免疫因子的參與[1－2]。Fas蛋白是神經(jīng)生長(zhǎng)因子受體（NGFR）和腫瘤壞死因子受體（TNFR）家族成員之一，屬于Ⅰ型跨膜蛋白，膜外是富含絲氨酸的功能域，膜內(nèi)是傳遞凋亡信號(hào)所必需的死亡結(jié)構(gòu)域（DD），因此Fas又被稱為死亡分子；FasL屬于腫瘤壞死因子（TNF）家族，是一種分子量為40 KD的Ⅱ型跨膜蛋白[10]。Fas與其配體FasL結(jié)合形成同源三聚體，并與其他具有死亡結(jié)構(gòu)域（DD）同源區(qū)的周圍蛋白質(zhì)結(jié)合形成死亡起始信號(hào)復(fù)合體（DISC），通過(guò)一系列途徑激活內(nèi)源性核酸內(nèi)切酶，同時(shí)降解DNA損傷修復(fù)酶及細(xì)胞骨架調(diào)節(jié)蛋白[11]，并激活Caspase酶聯(lián)反應(yīng)，使細(xì)胞骨架破壞、DNA斷裂，致使細(xì)胞凋亡[12－14]。

青藤堿是從防己科植物毛青藤的干燥藤莖中提取的異喹啉類生物堿單體，具有免疫抑制、抗炎、鎮(zhèn)痛等多種藥理作用[5，15－16]。本實(shí)驗(yàn)以大鼠腎臟I/R為基礎(chǔ)，以青藤堿為干預(yù)治療措施，觀察到以下情況：（1）用青藤堿處理后，與S組相比，SS組大鼠血清Cr及BUN濃度無(wú)明顯變化（P＞0．05），說(shuō)明該劑量青藤堿對(duì)正常大鼠腎功能無(wú)明顯影響；而SIN組大鼠T1、T2、T3的腎小管上皮細(xì)胞壞死較I/R組輕，少許管腔可見(jiàn)蛋白管型，間質(zhì)充血、水腫減輕，炎性細(xì)胞浸潤(rùn)減少，說(shuō)明青藤堿對(duì)大鼠腎臟具有保護(hù)作用。研究顯示，青藤堿可通過(guò)調(diào)節(jié)腎小管上皮細(xì)胞Caspase－3、Bcl－2、Bax蛋白的表達(dá)，抑制腎小管上皮細(xì)胞凋亡[17]。（2）S組與SS組大鼠Fas、FasL蛋白表達(dá)水平比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0．05），而I/R組大鼠Fas、FasL蛋白表達(dá)水平與S組比較，明顯增多（P＜0．05），且I/R組再灌注24小時(shí)的Fas蛋白表達(dá)水平比再灌注12小時(shí)高（P＜0．05），說(shuō)明當(dāng)腎臟組織發(fā)生缺血再灌注時(shí)，F(xiàn)as、FasL蛋白表達(dá)水平明顯升高，其參與了I/R的發(fā)生。（3）用青藤堿處理后，與I/R組相比，SIN組再灌注6小時(shí)、12小時(shí)、24小時(shí)大鼠Fas、FasL蛋白表達(dá)水平下降（P＜0．05），腎小管上皮細(xì)胞凋亡率下降（P＜0．05），說(shuō)明青藤堿可抑制大鼠腎臟Fas、FasL蛋白的表達(dá)，減少死亡起始信號(hào)復(fù)合體（DISC）的合成，抑制了一系列細(xì)胞凋亡的激活途徑，減輕腎小管上皮細(xì)胞的凋亡，從而對(duì)大鼠腎缺血再灌注損傷產(chǎn)生保護(hù)作用。有關(guān)青藤堿下調(diào)Fas、FasL蛋白表達(dá)水平的具體機(jī)制仍需進(jìn)一步探索。

綜上所述，青藤堿可通過(guò)抑制大鼠腎I/R過(guò)程中Fas、FasL蛋白的表達(dá)，從而降低腎小管上皮細(xì)胞的凋亡，減輕了I/R時(shí)腎臟的損傷。

[1]Rouschop KM，Roelofs JJ，Claessen N．Protection against renal ischemia reperfusion injury by CD44 disruption[J]．JAm Soc Nephrol，2005，16（7）：2034－2043．

[2]SrichaiM B，HaoC，Davis L，etal．Apoptosisof the thick ascending limb results in acute kidney injury[J]．JAm Soc Nephrol，2008，19（8）：1538．

[3]Liu CY，F(xiàn)u R，Wang HQ，et al．Fas/FasL in the immune pathogenesis of severe aplastic anemia[J]．GenetMol Res，2014（13）：4083－4088．

[4]韓麗萍，李鴻珠，姜春明，等．精胺抑制模擬缺血－再灌注心肌細(xì)胞Fas /FasL的表達(dá)[J]．中國(guó)病理生理雜志，2010（4）：630－634．

[5]Zhao Z，Guan R，Song S．Sinomenine protects mice against ischemia reperfusion induced renal injury by attenuating inflammatory response and tubular cell apoptosis[J]．Int JClin Exp Pathol，2013，6（9）：1702－1712．

[6]王博，徐達(dá)，王錫智．青藤堿減輕小鼠腎臟缺血再灌注損傷[J]．中華器官移植雜志，2011，32（2）：73－77．

[7]Basile DP，Donohoe D，Cao X．Resistance to ischemic acute renal failure in the Brown Norway rat：a new model to study cytoprotection[J]．Kidney Int，2004，65（6）：2201－2211．

[8]姚愛(ài)軍，冷玉芳．氯胺酮對(duì)大鼠腎臟缺血再灌注損傷的影響[J]．中華麻醉學(xué)雜志，2009，29（10）：927－931．

[9]彭小龍．青藤堿對(duì)大鼠急性腎缺血再灌注損傷保護(hù)作用的研究[D]．衡陽(yáng)：南華大學(xué)，2010．

[10]Zhao J，Duan S，Zhou J，et al．Mild hypothermia reduces expression of Fas/FasL and MMP－3 after cerebral ischemia－reperfusion in rats[J]．Iran JBasic Med Sci，2014（17）：454－459．

[11]Del Rio M，Imam A．The death domain of kidney ankyrin interacts with Fas and promotes Fas－mediated cell death in renal epithelia[J]．JAm Soc Nephrol，2004，15（1）：41－51．

[12]左耿，陶貴周．Fas/FasL系統(tǒng)與心肌缺血再灌注細(xì)胞凋亡[J]．心血管病學(xué)進(jìn)展，2011，32（2）：282－287．

[13]Li SQ，Liang LJ．Hepatocyte apoptosis induced by hepatic ischemiareperfusion injury in cirrhotic rats[J]．Hepatobiliary Pancreat Dis Int，2003，2（1）：102－105．

[14]Niu FN，Zhang X，Hu XM，et al．Targeted mutation of Fas ligand gene attenuates brain inflammation in experimental stroke[J]．Brain Behav Immun，2012（26）：61－71．

[15]李樂(lè)，張彩玲，宋必衛(wèi)．青藤堿的藥理研究與臨床應(yīng)用[J]．中藥新藥與臨床藥理，2006，17（4）：310－313．

[16]Oh YC，Kang OH，Kim SB．Anti－inflammatory effect of sinomenine by inhibition of pro－inflammatorymediators in PMA plus A23187－stimulated HMC－1 Cells[J]．Eur Rev Med Pharmacol Sci，2012，16（9）：1184－1191．

[17]閆建濤．青藤堿對(duì)大鼠腎缺血再灌注損傷保護(hù)作用及可能機(jī)制探討[D]．衡陽(yáng)：南華大學(xué)，2010．

（*通訊作者：冷玉芳）

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1671－1246（2017）18－0157－03