黃雙雙，冉孟婷，呂艷春

(遵義醫(yī)學(xué)院 公共衛(wèi)生學(xué)院， 貴州 遵義 563099)

基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究

仙鶴草對(duì)糖尿病小鼠血糖的影響研究

黃雙雙，冉孟婷，呂艷春

(遵義醫(yī)學(xué)院 公共衛(wèi)生學(xué)院， 貴州 遵義 563099)

目的觀察仙鶴草對(duì)糖尿病小鼠血糖的影響。方法雄性昆明小鼠腹腔注射鏈脲佐菌素(STZ)建立糖尿病小鼠模型。將建模成功的糖尿病小鼠隨機(jī)分為模型對(duì)照組、仙鶴草高(24 g/kg)、中、(12 g/kg)低(6 g/kg)劑量組、藥物對(duì)照組(鹽酸二甲雙胍(0.75 g/kg)，另設(shè)空白對(duì)照組及正常小鼠+仙鶴草高劑量對(duì)照組。每組8只，每天定點(diǎn)經(jīng)口灌胃，共30 d。觀察小鼠體重、飲食情況、尿量、精神和運(yùn)動(dòng)狀態(tài)、血糖的變化。結(jié)果與小鼠初始血糖(建模后的血糖濃度)相比，模型對(duì)照組小鼠血糖濃度上升了10 mmol/L左右，仙鶴草高劑量組小鼠血糖濃度降低了3 mmol/L左右，藥物對(duì)照組小鼠血糖濃度降低了12.5 mmol/L左右。與模型對(duì)照組相比，仙鶴草高劑量組和藥物對(duì)照組均能降低糖尿病小鼠的血糖(P<0.05)，同時(shí)還發(fā)現(xiàn)仙鶴草低劑量組和中劑量組對(duì)糖尿病小鼠的血糖無明顯降低作用(P>0.05)。仙鶴草對(duì)正常小鼠的血糖無明顯影響(P>0.05)。結(jié)論仙鶴草能降低鏈脲佐菌素誘導(dǎo)的糖尿病小鼠的血糖值。

仙鶴草；糖尿病小鼠；糖尿病；鏈脲佐菌素(STZ)

近年來，隨著我國經(jīng)濟(jì)的快速發(fā)展，人民生活水平日益提高，同時(shí)“富貴病”也在全球流行起來，糖尿病就是其中之一，糖尿病是由于機(jī)體胰島素分泌缺陷或其生物作用受損，或兩者兼有引起，以高血糖為特征的慢性代謝性疾病。糖尿病患者常見血糖值過高、脂質(zhì)代謝紊亂，在臨床上表現(xiàn)出“三高一低”、疲乏無力、肥胖等癥狀。相關(guān)數(shù)據(jù)顯示，我國目前的糖尿病患者已達(dá)到1.4億，并且發(fā)病率也呈上升的趨勢(shì)[1]，而且長期血糖過高和脂質(zhì)代謝紊亂是引起心腦血管并發(fā)癥的一個(gè)重要因素。因此，糖尿病已經(jīng)嚴(yán)重威脅到人類的健康。

仙鶴草(Herba Agrimoniae)作為傳統(tǒng)的中藥，含有黃酮類、三萜類、酚類、脂類、鞣質(zhì)類、揮發(fā)油和脂肪酸醇類等有效成分，具有抗腫瘤、降血糖、抗氧化、抗炎等藥理活性，臨床上主要用于止血、抗腫瘤、糖尿病、婦科病以及消化系統(tǒng)等疾病的治療[2-5]。雖然在臨床上已有少數(shù)案例證實(shí)仙鶴草能夠有效治療糖尿病，但是這樣的案例極少，說服力不強(qiáng)。鏈脲佐菌素(STZ)是較為理想的誘發(fā)動(dòng)物糖尿病的化學(xué)誘導(dǎo)劑[6]，具有毒性低、用藥量少等優(yōu)點(diǎn)。因此本實(shí)驗(yàn)采用STZ建立糖尿病小鼠模型，通過研究仙鶴草對(duì)糖尿病小鼠血糖的影響，初步摸索仙鶴草降血糖的有效劑量，為今后開發(fā)仙鶴草降糖藥物提供參考。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料與儀器 昆明小鼠60只，(23±2)g，由重慶第三軍醫(yī)大學(xué)大坪醫(yī)院野戰(zhàn)外科研究所實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。所用飼料由重慶第三軍醫(yī)大學(xué)大坪醫(yī)院野戰(zhàn)外科研究所實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供的普通鼠料。鏈脲佐菌素(STZ，美國sigma公司)，檸檬酸、檸檬酸三鈉，羅氏卓越精采型血糖儀、血糖試紙(德國)，曬干的仙鶴草(產(chǎn)地：貴州)，鹽酸二甲雙胍(生產(chǎn)商：南昌市飛弘藥業(yè)有限公司 國藥準(zhǔn)字H20051662 )，手持糖度計(jì)，電爐(功率2 000 W)，紫砂鍋，尼龍布等。

1.2 方法

1.2.1 1%STZ檸檬酸鹽緩沖液的配制 稱取檸檬酸2.1 g ，加入重蒸水定容至100 mL，配制成0.1 mol/L的檸檬酸溶液；稱取檸檬酸三鈉2.94 g，加入重蒸水定容至100 mL，配制成0.1 mol/L的檸檬酸三鈉溶液，配制好后放入4～8 ℃的冰箱中冷藏，待用。

1%STZ檸檬酸鹽緩沖液的配制：稱取0.1 gSTZ，分別加入上述所配的0.1 mol/L的檸檬酸溶液2.8 mL和0.1 mol/L的檸檬酸三鈉溶液2.2 mL，用重蒸水定容至10 mL，搖勻混合，放入冰水浴中，現(xiàn)配現(xiàn)用、避光，一次使用時(shí)間不得超過30 min。

1.2.2 仙鶴草湯劑的熬制工藝 稱取曬干的仙鶴草20 g放入紫砂鍋中，加入250 mL水，浸泡15 min左右后，用2 000 w的電爐進(jìn)行熬制，先用4檔大火煮沸18 min，再用1檔小火慢熬30 min左右。關(guān)火，倒出湯劑，去掉藥渣，最后用80目尼龍布進(jìn)行過濾，得到最終的仙鶴草湯劑，然后用烘干法測(cè)定其浸提物含量約為22.4 mg/mL。

1.2.3 糖尿病小鼠的建立與分組 雄性昆明小鼠56只，23±2 g，適應(yīng)性喂養(yǎng)3～4 d后，隨機(jī)分為7組，隨機(jī)選取其中的兩組作為空白對(duì)照和緩沖液對(duì)照組，其余5組為實(shí)驗(yàn)組。開始實(shí)驗(yàn)前，小鼠禁食不禁水12 h后測(cè)血糖，然后進(jìn)行注射，實(shí)驗(yàn)組腹腔注射60 mg/kg1%STZ緩沖溶液，緩沖液組腹腔注射相同體積的檸檬酸鹽緩沖液，空白對(duì)照組不作任何處理，連續(xù)注射5 d，每次注射完恢復(fù)自由采食?？崭寡侵怠?1.1 mmol/L，視為建模成功[7]。將上述建模成功的糖尿病小鼠進(jìn)行隨機(jī)分組：模型對(duì)照組、模型+仙低劑量組、模型+仙中劑量組、模型+仙高劑量組、藥物對(duì)照組(0.75 mg/kg鹽酸二甲雙胍)，仙鶴草的高、中、低劑量分別是24、12、6 g/kg。另設(shè)正常小鼠空白對(duì)照和正常小鼠+仙高劑量組，空白組和模型對(duì)照組給予等體積的蒸餾水，連續(xù)灌胃30 d。仙鶴草的劑量是查閱《中國藥典》[2]所確定的，并通過人與動(dòng)物之間的劑量公式進(jìn)行換算得到的。

1.2.4 實(shí)驗(yàn)指標(biāo)檢測(cè) 建模期間和灌胃期間每隔2 d對(duì)各組小鼠進(jìn)行稱重，每天記錄各組小鼠的攝食量、飲水量。建模期間首先測(cè)定正常小鼠的初始血糖濃度(建模前的正常值)，并分別于注射STZ后的0、7、14、18 d測(cè)定各組小鼠的血糖，小鼠禁食不禁水12 h，采取斷尾采血，測(cè)定小鼠的血糖。灌胃期間分別于10、20、30 d測(cè)量各組小鼠的空腹血糖。

2 結(jié)果

2.1 60 mg/kg1%STZ建模糖尿病小鼠對(duì)其各項(xiàng)指標(biāo)的影響

2.1.1 建模期間小鼠的血糖值 從圖1中可以看出，各組小鼠的初期血糖濃度(建模前)基本相同，注射了STZ的小鼠組末期的血糖濃度比建模前升高了11.0 mmol/L 左右，空白對(duì)照組和緩沖液對(duì)照組兩組小鼠末期的血糖濃度基本相同。注射了STZ的小鼠組末期的血糖濃度為18.0 mmol/L左右，達(dá)到并超過了11.1 mmol/L。因此，注射60 mg/kg1%STZ緩沖液能誘導(dǎo)小鼠成為糖尿病小鼠，緩沖液對(duì)小鼠的血糖無明顯影響。

與空白對(duì)照組相比，*P<0.05，**P>0.05。圖1 建模期間小鼠的血糖值

2.1.2 建模期間小鼠的體重變化

與空白對(duì)照組相比，*P<0.05，**P>0.05。圖2 建模期間小鼠的體重變化

從圖2中可以看出，建模前各組小鼠的體重基本相同，空白對(duì)照組和緩沖液對(duì)照組兩組小鼠的體重一直保持明顯的上升趨勢(shì)，注射了STZ的小鼠組體重一直保持緩慢的上升趨勢(shì)，并隨著糖尿病癥的出現(xiàn)，注射了STZ的小鼠組體重逐漸低于兩對(duì)照組小鼠的體重，空白對(duì)照組和緩沖液組的小鼠體重相差不大。因此，患有糖尿病的小鼠會(huì)出現(xiàn)體重明顯降低，緩沖液對(duì)小鼠的體重?zé)o明顯影響。

2.1.3 建模期間小鼠攝食量的情況 注射STZ后，隨著糖尿病病癥的出現(xiàn)，小鼠的攝食量明顯增加，攝食量明顯超過對(duì)照組?？瞻缀途彌_液對(duì)照組的小鼠攝食量也有所增加，但增加的幅度不大，這可能是隨著小鼠的生長發(fā)育引起的波動(dòng)(見圖3)。

與空白對(duì)照組相比，*P>0.05，**P>0.05。圖3 建模期間小鼠攝食量的情況

2.1.4 建模期間小鼠飲水量的情況 建模前各組小鼠的飲水量無明顯差異，注射STZ后，隨著糖尿病癥的出現(xiàn)，小鼠的飲水量明顯增加，遠(yuǎn)超過對(duì)照組小鼠的飲水量?？瞻缀途彌_液組小鼠的建模前飲水量和建模末期飲水量變化不大，變化量還不到6mL，緩沖液對(duì)照組與空白對(duì)照組小鼠的飲水量相比，兩組小鼠的飲水量幾乎一樣，說明緩沖液對(duì)小鼠的飲水量無影響(見圖4)。

與空白對(duì)照組相比，*P<0.05，**P>0.05。圖4 建模期間小鼠飲水量的情況

2.1.5 建模期間小鼠的基本情況 注射STZ后，每天給予小鼠充足的水和飼料，每天更換一次小鼠的墊料，以保持干燥。在整個(gè)建模期間，通過觀察各組小鼠的形態(tài)發(fā)現(xiàn)，空白對(duì)照組和緩沖液對(duì)照組小鼠的精神狀態(tài)較佳，十分活躍，毛發(fā)柔順、潔白、有光澤，排尿量少，而注射了STZ的小鼠精神狀態(tài)稍差，毛發(fā)疏松、發(fā)黃，不活躍等現(xiàn)象。注射了STZ的小鼠從第1次注射后的第4天起出現(xiàn)多尿現(xiàn)象，小鼠的墊料比空白對(duì)照組和緩沖液對(duì)照墊料的濕度大，出現(xiàn)了明顯的多尿癥。建模期間無小鼠死亡，小鼠的成模率為85%。

2.2 灌胃仙鶴草對(duì)糖尿病小鼠各項(xiàng)指標(biāo)的影響

2.2.1 灌胃仙鶴草對(duì)糖尿病小鼠血糖值的影響 從圖5中可以看出，在30 d內(nèi)，除藥物對(duì)照組外，其他各組糖尿病小鼠的血糖濃度均高于正常對(duì)照組小鼠的血糖濃度，糖尿病小鼠灌胃不同劑量的仙鶴草煎劑后，血糖的變化趨勢(shì)有所不同，灌胃仙鶴草低劑量和中劑量對(duì)糖尿病小鼠的血糖無明顯的降低作用。在第30天模型對(duì)照組小鼠血糖遠(yuǎn)高于模型+仙高組和藥物對(duì)照組并高出建模后的初始血糖濃度約10 mmol/L，模型+仙高劑量組和藥物對(duì)照組小鼠血糖濃度均低于建模后的初始血糖(建模后第0 d)的血糖濃度，并且藥物對(duì)照組的血糖濃度降低程度大于模型+仙高劑量組?？瞻讓?duì)照組與正常+仙高劑量組的血糖濃度無顯著變化，說明仙鶴草煎劑對(duì)正常小鼠血糖的變化無明顯影響。

與模型對(duì)照組相比，*P<0.05，**P>0.05；與空白對(duì)照組相比，#P>0.05。圖5 灌胃仙鶴草對(duì)糖尿病小鼠血糖值的影響

2.2.2 灌胃仙鶴草對(duì)糖尿病小鼠體重的影響 從圖6可以看出，灌胃前和灌胃后，各組小鼠的體重變化不大，模型對(duì)照組、模型+仙低劑量、模型+仙中劑量、模型+仙高劑量組小鼠的體重均在28 g左右，藥物對(duì)照組，小鼠的體重在32 g左右，均低于正常對(duì)照組小鼠的體重，空白對(duì)照組和正常+仙高劑量組小鼠的體重均在43 g左右。仙鶴草湯劑對(duì)正常小鼠的體重?zé)o明顯影響。

與模型對(duì)照組相比，*P<0.05，**P>0.05；與空白對(duì)照組相比，#P>0.05。圖6 灌胃仙鶴草對(duì)糖尿病小鼠體重的影響

2.2.3 灌胃仙鶴草對(duì)糖尿病小鼠攝食量的影響 從表1可以看出，除模型對(duì)照組外，其他幾組小鼠建模末期的攝食量都比建模初期低，均高于空白對(duì)照組，灌胃糖尿病小鼠高劑量的仙鶴草湯劑，其攝食量變化比灌胃低、中兩個(gè)劑量降低的多，降低了13 g左右，模型對(duì)照組小鼠的末期攝食量比初期攝食量增加了15 g左右，而藥物對(duì)照組末期攝食量比初期攝食量降低了20 g左右?？瞻讓?duì)照組和正常+仙高劑量組末期攝食量比初期攝食量均降低了20 g左右。

組別初期末期空白對(duì)照72.0±6.149.0±1.7*正常+仙高58.8±11.637.8±4.9#模型對(duì)照70.4±15.385.4±9.9模型+仙低80.4±7.776.7±4.9*模型+仙中90.3±7.386.0±7.4**模型+仙高83.5±4.770.6±4.5*藥物對(duì)照92.4±1.369.8±3.0*

與模型對(duì)照組相比，*P<0.05，**P>0.05。與空白對(duì)照組相比，#P<0.05。

2.2.4 灌胃仙鶴草對(duì)糖尿病小鼠飲水量的影響 從表2可以看出，與建模初期飲水量相比，模型對(duì)照組、模型+仙低劑量組、模型+仙中劑量組小鼠建模末期的飲水量明顯增加，模型+仙高劑量組和藥物對(duì)照組小鼠建模末期的飲水量與建模初期的飲水量相差不大。空白對(duì)照組與正常+仙高劑量組小鼠的建模末期飲水量相差不大，仙鶴草對(duì)正常小鼠的飲水量無明顯影響。

組別初期末期空白對(duì)照59.2±5.739.8±1.6**正常+仙高61.2±6.945.3±8.1# 模型對(duì)照149.0±15.7227.5±34.9 模型+仙低158.0±17.3216.6±51.9*模型+仙中197.4±14.9297.4±12.4*模型+仙高213.9±16.3191.2±52.1*藥物對(duì)照212.1±10.2226.8±21.7*

與模型對(duì)照組相比，*P>0.05，**P<0.05；與空白對(duì)照組相比，#P>0.05。

3 討論

目前，市場上調(diào)節(jié)糖尿病的藥物多以西藥為主，其降糖效果也比較明顯，但也存在一些不良反應(yīng)，如低血糖癥、乳酸性酸中毒、胃腸道反應(yīng)等。已有研究發(fā)現(xiàn)[9]，中藥降糖作用具有多途徑、多靶點(diǎn)、多向性的藥理特點(diǎn)，作用溫和持久、對(duì)機(jī)體的副作用小并能有效緩解糖尿病并發(fā)癥發(fā)生等優(yōu)點(diǎn)，仙鶴草作為一種傳統(tǒng)的中藥，已有研究證明其具有顯著的降血糖作用，將其作為一種降糖藥物具有現(xiàn)實(shí)意義。

本實(shí)驗(yàn)的結(jié)果顯示，對(duì)昆明小鼠連續(xù)5d腹腔注射60mg/kg 1%STZ緩沖液，能夠成功誘導(dǎo)糖尿病，患有糖尿病的小鼠出現(xiàn)明顯的“三高一低”癥狀，即多飲、多食、多尿和體重減輕，這與鄭國亞等[11]多次注射小劑量STZ得到的實(shí)驗(yàn)結(jié)果相符，鄭國亞等[10]的研究發(fā)現(xiàn)單次大劑量腹腔注射150mg/kg STZ和多次小劑量腹腔注射50mg/kg STZ均能成功誘導(dǎo)糖尿病，并且四周后的成模率分別為60%和80%，死亡率分別為33.3%和20%，多次小劑量腹腔注射50mg/kg STZ是較為理想的糖尿病建模方案。

高劑量(24g/kg)的仙鶴草能有效降低糖尿病小鼠的血糖，該結(jié)果支持了范尚坦等[11-12]的研究，驗(yàn)證了仙鶴草具有降血糖作用。低劑量(6g/kg)和中劑量(12g/kg)的仙鶴草對(duì)糖尿病小鼠無明顯的降血糖作用，這可能是與選取的藥物劑量偏低有關(guān)，以致未能呈現(xiàn)較好的劑量-效應(yīng)關(guān)系，在下次試驗(yàn)中應(yīng)在此基礎(chǔ)之上加大藥物劑量。與鹽酸二甲雙胍相比，仙鶴草對(duì)糖尿病小鼠血糖的降低效果稍差，這可能與本實(shí)驗(yàn)未對(duì)仙鶴草的降血糖活性成分進(jìn)行分離提取，導(dǎo)致降血糖的效果不如鹽酸二甲雙胍明顯。所以在下一步試驗(yàn)中會(huì)對(duì)仙鶴草的降血糖活性成分進(jìn)行分離提取。

本實(shí)驗(yàn)初步研究得到仙鶴草具有降血糖作用，但對(duì)其降血糖的作用機(jī)制還不清楚，目前對(duì)于仙鶴草的降血糖機(jī)制研究較少，一方面是通過提高抗氧化酶活性，清除自由基減少自由基對(duì)胰島細(xì)胞損傷，或通過促進(jìn)胰島β細(xì)胞再生，修復(fù)和保護(hù)胰島β細(xì)胞功能，從而促進(jìn)胰島素分泌，發(fā)揮降糖作用；另一方面是通過改善胰島素的抵抗?fàn)顟B(tài)，從而降糖調(diào)脂[13-16]。所以可以在本研究結(jié)果的基礎(chǔ)之上，進(jìn)一步對(duì)仙鶴草的降血糖機(jī)制進(jìn)行深入的研究，能夠更好地闡釋仙鶴草的降血糖作用，為今后開發(fā)仙鶴草降糖藥物提供合理的科學(xué)依據(jù)。另外，本實(shí)驗(yàn)只是對(duì)仙鶴草進(jìn)行粗提，對(duì)于其起降糖作用的活性物質(zhì)并未研究，所以篩選出具有降糖作用的活性物質(zhì)是今后的研究重點(diǎn)。

本實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的不足之處，首先在于糖尿病模型的建立上，本實(shí)驗(yàn)采取建立糖尿病模型的方法，雖然成模率高、建模穩(wěn)定，但小鼠的血糖濃度也是相當(dāng)?shù)母?，有的小鼠血糖濃度甚至超過了25mmol/L，不利于觀察降血糖實(shí)驗(yàn)效果，需要改進(jìn)降低STZ的建模濃度。其次是對(duì)于仙鶴草的處理，需要再精準(zhǔn)地控制其熬煮時(shí)間、料液比、溫度等問題。

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(編輯：譚秀榮)

The effects of Herba Agrimoniae on hyperglycemia in mice

Huang Shuangshuang, Ran Mengting, Lyu Yanchun

(School of Public Health, Zunyi Medical University, Zunyi Guizhou 563099, China)

ObjectiveTo observe the effects of Herba Agrimoniae on blood glucose in hyperglycemia mice.MethodsA mouse model of hyperglycemia was established by intraperitoneal injection of streptozotocin (STZ) in male Kunming mice. The hyperglycemia mice were randomly divided into model group, high (24 g/kg), medium (12 g/kg) and low dose (6 g/kg) of Herba Agrimoniae group, and drug control group (metformin hydrochloride, 0.75 g/kg). In addition, blank control group and normal + high dose of Herba Agrimoniae control group were controlled. Eight mice in each group were given intragastric administration every day for 30 days. The changes of weight, volume diet, urine output, mental and motor status, blood glucose of mice were observed.ResultsCompared with the initial blood glucose value, the blood glucose concentration of model control group was increased by about 10 mmol/L, the blood glucose concentration of high dose group was decreased by about 3 mmol/L, and the blood glucose concentration of drug control group was decreased by about 12.5 mmol/L. Compared with the model control group, the blood glucose levels could be reduced in the high dose group and the drug control group (P<0.05). At the same time, the effects of low dose and medium dose of Herba Agrimoniae on the hyperglycemic mice were not observed (P>0.05). And Herba Agrimoniae had no significant effect on blood glucose in normal mice (P>0.05).ConclusionHerba Agrimoniae can reduce the blood glucose levels in streptozotocin-induced hyperglycemia mice.

Herba Agrimoniae; hyperglycemia mice; hyperglycemia; streptozotocin (STZ)

貴州省科技廳基金資助項(xiàng)目(NO：黔科合LH字[2015]7561)。

呂艷春，女，博士，副教授，研究方向：藥食同源植物開發(fā)與利用，E-mail:yanchunlv1234@sina.com。

R285

A

1000-2715(2017)04-0378-05

[收稿2017-05-12;修回2017-06-27]