羅 熠，肖建輝

(遵義醫(yī)學院附屬醫(yī)院 醫(yī)藥生物技術研究所，貴州 遵義 563099)

綜述

干細胞向胰島素分泌細胞的定向分化及臨床應用研究進展

羅 熠，肖建輝

(遵義醫(yī)學院附屬醫(yī)院 醫(yī)藥生物技術研究所，貴州 遵義 563099)

糖尿病是危害人類健康的重大疾病之一，并呈高發(fā)態(tài)勢。胰島β細胞功能衰竭和胰島素抵抗是糖尿病的主要病因，至今尚無根治良策。隨著干細胞與再生醫(yī)學技術的發(fā)展，利用干細胞的多向分化特性，誘導其分化為胰島素分泌細胞，從而具備修復、替代受損胰腺組織的功能，這為糖尿病的徹底治愈帶來了希望?，F對近年來干細胞向胰島素分泌細胞定向分化的研究及臨床應用的最新研究進展進行綜述，為干細胞移植治療糖尿病的臨床應用研究提供參考。

糖尿??；干細胞；胰島素產生細胞；胰島素

糖尿病是世界范圍內最常見的代謝性疾病之一，近20年來，患病率呈高發(fā)趨勢。糖尿病分為1型糖尿病(type 1 diabetes,T1D)和2型糖尿病(type 2 diabetes,T2D)，T1D是自身免疫性疾病，異常的自身抗體攻擊，破壞了正常胰島組織中β細胞，而導致胰島素分泌絕對缺乏所致。T2D是因胰島β細胞胰島素分泌不足，或自身組織細胞產生胰島素抵抗所致[1]。目前，糖尿病患者主要靠生活方式干預、口服藥物(磺脲類、雙胍類等)和注射外源胰島素來控制血糖。這些治療方法僅能緩解血糖代謝紊亂，無法治愈。而且，患者需要終身用藥，副作用大，尤其是無法避免中晚期糖尿病并發(fā)癥的發(fā)生[2]。

隨著器官移植技術的發(fā)展，人們試圖通過胰腺或胰島細胞移植，為糖尿病患者提供新的胰島素分泌細胞(insulin producing cells,IPCs)，達到控制血糖，乃至治愈糖尿病。但是，供體的稀缺、異種移植的免疫排斥反應和受體長期服用免疫抑制藥物等諸多不利因素，限制了其臨床應用。令人欣喜的是，近年來干細胞移植治療心血管疾病、骨損傷、神經系統(tǒng)及惡性腫瘤等疾病的研究取得了明顯進展[3-6]，這為糖尿病的治療提供了新思路。

干細胞是一類具有自我更新和多向分化潛能的細胞，具有再生各種組織器官，乃至發(fā)育成個體的潛能，在醫(yī)學界被譽為“萬能細胞”。干細胞根據來源不同分為胚胎干細胞(embryonic stem cells,ESCs)、誘導性多能干細胞(induced pluripotent stem cells,iPSCs)和成體干細胞(adult stem cells,ASCs)。在特定條件下，干細胞能分化為IPCs，而具備修復或替代受損胰腺組織的潛力，開辟了糖尿病治療的新途徑。為此，本文就不同類型干細胞，包括ESCs、iPSCs、ASCs等誘導分化為IPCs的基礎與臨床應用研究進展進行綜述。

1 體外誘導干細胞分化為胰島素分泌細胞

ESCs、iPSCs、ASCs等不同類型干細胞，其細胞來源、生物學特性、增殖分化條件有較大差異。近20年來，人們對誘導不同類型干細胞分化為類似內源性胰島β細胞做了大量的研究，取得了明顯的進展，為糖尿病的干細胞移植治療研究奠定了基礎。

1.1 胚胎干細胞分化為胰島素分泌細胞 ESCs是來自哺乳動物囊胚的內細胞團，具有端粒酶活性，能自我更新和分化為所有細胞類型(Evans & Kaufman,1981)。研究表明，ESCs向胰腺β細胞的發(fā)育涉及到內胚層的誘導、PDX1祖細胞的生成、以及第一和第二階段內分泌系的形成[7]。即激活素(轉化生長因子β家族的成員)、丁酸鈉(組蛋白去乙酰化酶抑制劑)、Wnt3a和GSK3β誘導ESCs分化為內胚層，50%～90%的細胞表達內胚層標志物Sox17和Foxa2[8]；隨后，內胚層細胞可在noggin、維甲酸、EGF、bFGF、dorsomorphin和 SB431542等單個或多個因子作用下生成胰腺祖細胞，可表達內分泌細胞標志物PDX1 、NGN3和NEUROD1[9-11]；最后，胰腺祖細胞在尼克酰胺、胰島樣生長因子、唾液素4等小分子物質作用下生成能分泌胰島素的胰島樣細胞團。

早在2001年，Lumelsky等[12]采用五步誘導法，誘導小鼠ESCs分化為IPCs。在此基礎上，多個研究組改良了Lumelsky 五步法誘導方案，更準確的模擬胰腺細胞發(fā)育過程，使之能更有效地誘導鼠[13]或人[14]ESCs分化為IPCs。但在這些誘導體系中，所獲得的IPCs均呈不成熟的胰島特征，能分泌胰高血糖素和生長抑素，但不能分泌胰島素，即便葡萄糖刺激下亦如此，其移植入糖尿病小鼠體內不能有效行使胰島β細胞的功能。因此，研究者又致力于胰高血糖素和胰島素共表達細胞向β細胞轉化的研究。Riedel等[15]發(fā)現人胚胎組織中共表達胰島素和胰高血糖素的細胞能產生α細胞轉錄因子ARX，但缺乏β細胞轉錄因子PDX1、NKX6.1和MAFA，從而證明了共表達胰高血糖素和胰島素細胞是胰腺正常發(fā)育的一個階段。另有研究表明，β細胞轉錄因子Pax4缺陷小鼠因缺乏成熟胰腺β細胞，產后幾天內死于高血糖癥，并觀察到α細胞系過表達Pax4能誘導α細胞向β細胞的轉化[16-17]?；谶@些研究結果，Pagliuca 課題組發(fā)明了一種連續(xù)分步誘導法[18]，涉及多個信號的序列調節(jié)，誘導人ESCs生成功能性β細胞，而且這些細胞在體內外均能行使成熟胰島β細胞的功能。

ESCs向IPCs的定向分化過程，除了一些可溶性分化因子和轉錄因子以外，細胞外基質成分在其中也起了重要作用。Taylor-Weiner 等[19]發(fā)現，纖維胞外基質粘連蛋白(FN)能使維持小鼠胚狀體多能性的標志缺失，并可聯合層粘連蛋白促進定型內胚層(definitive endoderm)的分化。最近，Rasmussen等[11]對約500種胞外基質蛋白組合物，誘導人ESCs分化成定型內胚層細胞進行了篩選，發(fā)現I型膠原和纖連蛋白誘導分化成定型內胚層細胞的效率分別大于85%和65%。

因此，ESCs具有定向分化為胰島β細胞的能力，是治療糖尿病的良好細胞資源。但是ESCs用于糖尿病的臨床治療，亟需解決免疫排斥反應、畸胎瘤形成、來源限制及倫理學爭議等瓶頸問題。

1.2 誘導性多能干細胞分化為胰島素分泌細胞 iPSCs是通過導入特定轉錄因子到成體細胞，觸發(fā)細胞重編程而獲得[20-21]。人iPSCs在細胞形態(tài)、細胞表面標志、自我更新能力、表觀遺傳狀態(tài)及端粒酶活性等特性上與人ESCs類似，并具有分化成三個不同胚層細胞的能力。

有研究表明，應用ESCs的IPCs誘導方案，來源于人成纖維細胞的iPSCs可誘導分化為IPCs[22]。Maehr等[23]將Oct4,Sox2和Klf4等基因轉入成纖維細胞中，成功編程為1型糖尿病特異性iPS細胞(T1D-specific iPS cells，DiPSCs)，進而借助ESCs的誘導分化體系，DiPSCs被誘導分化成IPCs，這為DiPSCs治療T1D提供了理論依據。近來，Kunisada等[8]建立了一個簡單有效的小分子化合物組合誘導方案，使人iPSCs誘導分化成IPCs，且分化效率高達10%以上。該方案先用激活素和GSK3β抑制劑CHIR99021促人iPSCs向定型內胚層細胞分化，然后骨形態(tài)蛋白抑制劑視黃酸和TGF-β抑制劑聯用促定型內胚層細胞向胰腺祖細胞分化，最后利用毛喉素、地塞米松和TGF-β抑制劑使胰腺祖細胞分化成IPCs。新近，Zhu 等[24]發(fā)現添加一些表觀遺傳阻斷劑，如丁酸鈉(組蛋白去乙?；敢种苿?、Par(組蛋白去甲基化酶抑制劑)和RG108(DNA甲基化酶抑制劑)使iPSCs向內胚層細胞分化的效率提高2.5倍。另外，通過去除傳統(tǒng)誘導方案中的BMP抑制劑來阻止內分泌細胞早熟，維甲酸與EGF/KGF聯用能有效促成PDX1陽性細胞或PDX1/NKX6.1陽性細胞的生成[25]。

借助ESCs向IPCs分化的誘導策略，iPSCs可在體外分化為胰島樣細胞團。不過，ESCs來源的IPCs移植治療糖尿病會有免疫排斥反應，而來源于糖尿病患者自體組織的iPSCs所誘導的IPCs，可避免移植排斥反應。因此，iPSCs具有ESCs相似的分化能力，同時避免了倫理及免疫排斥問題，是ESCs的良好替代材料。但是，iPSCs存在誘導方案不成熟、基因組不穩(wěn)定、畸胎瘤風險及成本高等諸多不利因素，需進一步完善其重編程方案。不過，利用患者自體組織細胞，借助安全的細胞重編程與誘導分化策略，獲得遺傳背景匹配的胰腺β細胞，在治愈患者自身糖尿病方面有先天優(yōu)勢和巨大潛力。

1.3 成體干細胞分化為胰島素分泌細胞 ASCs是存在于已分化組織中的未分化細胞，具有自我更新潛能，同時在特定條件下也能分化為各種特定類型的細胞。與ESCs和iPSCs相比，ASCs的獲取相對容易。而且，來源于患者自身ASCs，不存在倫理問題與同種異體免疫排斥反應，且致瘤風險低。因此，近年來，不斷有研究團隊將來源于骨髓[26]、脂肪與臍帶等組織[27-28]的間充質干細胞誘導分化為IPCs。

Gabr等[29]報道了來源于2型糖尿病患者骨髓間充質干細胞(bone marrow-derived mesenchymal stem cells,BM-MSCs)在bFGF、EGF、B27等生長因子和小分子化合物作用下，通過3步誘導法，能生成5%-10%胰島素和C肽共表達細胞。有趣的是，該研究組把來源于BM-MSCs的IPCs移植到STZ誘導的糖尿病裸鼠體內，其血糖水平恢復正常[30]。而且，有研究表明，將未分化的BM-MSCs通過尾靜脈多次移植入高脂高糖飲食聯合STZ誘導的2型糖尿病大鼠體內，能逆轉糖尿病[31]。除分化替代作用外，近年來的研究表明，BM-MSCs還具有炎癥和免疫調節(jié)能力，這也有利于包括糖尿病等自身免疫性疾病的治療[32]。

脂肪間充質干細胞(adipose-derived mesenchymal stem cells,AD-MSCs)是采用貼壁法從脂肪組織中分離獲得的間充質干細胞，具有來源豐富、易分離、易擴增和無倫理學爭議等優(yōu)點，成為誘導分化成β細胞的重要種子細胞資源。通過三步誘導法，AD-MSCs能分化為功能性胰島樣細胞團，將分化后的細胞包裝在免疫隔離的生物相容性膠囊中，移植到STZ誘導的糖尿病小鼠體內能維持正常血糖3～4周[33]。而且，與其他間充質干細胞相比，AD-MSCs中含有瘦素、脂肪細胞因子、內脂素等[34]具有調節(jié)血糖平衡作用的生物活性物質。因此，AD-MSCs作為治療糖尿病的種子細胞來源更具有優(yōu)勢。

胰腺間充質干細胞(pancreatic mesenchymal stem cells,PMSCs)具有間充質干細胞的一般特性，如向成骨、軟骨及神經元細胞分化的潛能。在特定培養(yǎng)條件下，PMSCs能分化為IPCs[35]。而且，胰腺組織的特定微環(huán)境更有利于PMSCs向IPCs分化。不過，對于PMSCs的起源及其分化 成IPCs的能力，尚存爭議。

人胚外組織(胎盤、羊膜)在孕婦分娩后通常作為廢棄物處理。實際上，它是干細胞再生醫(yī)學領域最有應用潛力的圍產期干細胞來源。譬如，人胎盤來源的間充質干細胞(placenta-derived mesenchymal stem cells,PD-MSCs)來源廣，不存在倫理學爭議問題，且有良好的多向分化潛能與免疫調節(jié)特性。PD-MSCs除能表達MSCs典型表面抗原外，還表達Sox2、REX-1和Oct4等ESCs標志。Kadam等[36]用含有特定生長因子和分化誘導劑的無血清培養(yǎng)基，誘導人PD-MSCs生成胰島樣細胞團，且將PD-MSCs或分化后的細胞移植入STZ誘導的糖尿病小鼠體內后能明顯改善高血糖。人羊膜細胞亦是極具臨床應用潛力的圍產期干細胞資源，它含有兩種類型的干細胞，來源于胚胎外胚層的人羊膜上皮細胞(human amnion epithelial cells,hAECs)和來源于胚胎中胚層的人羊膜間充質干細胞(human amnion mesenchymal stromal cells,hAMSCs)[4]。人羊膜細胞具有多向分化潛能，無致瘤性，且免疫原性低，異體移植后不會引起免疫排斥反應[4]。Kim等[37]利用尼克酰胺、激活素和GLP-1誘導hAMSCs生成IPCs后，IPCs被裝入PE50導管，并通過腎包膜下移植到STZ誘導的糖尿病小鼠體內，能維持正常血糖210 d。新近，Zou等[38]報道IncRNA通過與miR-145競爭性結合來維持Sox2的表達，維持人羊膜上皮細胞多能性并且能有效調節(jié)hAECs向胰島樣細胞分化。

雖然ASCs在特定條件下有向IPCs分化的潛能，并顯示出良好的免疫調節(jié)特性，但是ASCs來源的IPCs，在體內外的長期穩(wěn)定性尚未見報道。而且，生成的IPCs與內源性胰島相比，尚有較大差距，僅能行使部分β細胞功能。因此，如何實現 ASCs分化成具有胰腺β細胞功能的IPCs，仍然是亟待解決的科學難題。

1.4 其他類型細胞分化為胰島素分泌細胞 胰腺成體細胞，包括導管細胞(pancreatic ductal cells,PDCs)、腺泡細胞[39]和α細胞，能在體外誘導生成IPCs。導管上皮細胞除了分泌水和碳酸氫鹽外，還是胰腺多能干細胞的儲存部位。Corritore等[40]發(fā)現過表達胰腺轉錄因子(MAFA)能有效誘導人PDCs向β細胞分化。7d后，MAFA重編程的PDCs細胞團含有37%胰島素陽性細胞和一定比例表達生長抑素和胰多肽的內分泌細胞。而且，PDCs來源的IPCs在體外能響應葡萄糖、KCl、3-異丁基-1-甲基黃嘌呤和甲苯磺丁脲的刺激，分泌胰島素和C肽。研究表明，胰島素的絕對和相對缺乏以及胰高血糖素信號通路的過度活化是導致糖尿病的兩個主要原因，當β細胞極度缺失時，α細胞能夠替代胰島素產生細胞。新近，美國科學家有了重大發(fā)現，青蒿素能使α細胞向β細胞轉化[41]，這為青蒿素用于1型糖尿病的治療提供了新途徑。

綜上所述，干細胞和胰腺成體細胞能分化為IPCs，在用于治療糖尿病方面展示了巨大潛力。但是，現有的IPCs誘導分化體系分化效率低，移植入體內后存活率也較低。而且，生成的IPCs與正常的胰島β細胞相比，其功能上還有很大差距，移植入體內所分泌的胰島素水平不足以達到治療目的。因此，亟需研制新的誘導分化策略來解決IPCs功能不足問題。

2 干細胞治療糖尿病的臨床研究

截止到2016年12月，以"stem cell" AND "diabetes"為檢索詞在"http://clinicaltrials.gov"網站上檢索到臨床試驗178項，其中包括干細胞治療1型糖尿病研究26項，治療2型糖尿病研究10項。近年來，不斷有臨床小樣本試驗探索干細胞移植治療1型糖尿病[42-46](見表1)和2型糖尿病[47-52](見表2)療效與安全性的研究。其研究結果均顯示，干細胞移植治療后，患者的胰島素依賴性降低，糖化血紅蛋白值降低，且改善了胰高血糖素刺激C肽水平。而且，均未發(fā)生嚴重副作用。

表1干細胞移植治療1型糖尿病的臨床試驗

序號患者數干細胞平均移植細胞劑量(個/kg)移植方式隨訪時間NCT號參考文獻120骨髓間充質干細胞2.75×106靜脈注射12月NCT01068951[42]242臍帶間充質干細胞和自體骨髓單核細胞1.1×106(UC-MSC)和106.8×106(aBM-MNC)胰腺動脈注射12月NCT01374854[43]39自體非清髓造血干細胞11.85×106靜脈注射12月NCT00807651[44]420脂肪間充質干細胞和骨髓造血干細胞2.07±0.67×104胰腺內注射33月———[45]513自體造血干細胞2×106靜脈注射31～54月NCT01341899[46]

表2干細胞移植治療2型糖尿病的臨床試驗

序號患者數干細胞平均移植細胞劑量(個/kg)移植方式隨訪時間NCT號參考文獻122臍帶膠質間充質干細胞1.0×106靜脈與胰腺內注射12月未知[47]280自體骨髓單核細胞與高壓氧結合治療———胰腺內注射12月NCT00767260[48]318臍帶間充質干細胞1.0×106靜脈滴注12月NCT01413035[49]412臍帶間充質干細胞1.0×106胰腺動脈與外周靜脈輸注6月NCT01954147[50]536臍帶血間充質干細胞———靜脈注射14月NCT01415726[51]621自體骨髓干細胞5.8×106靜脈注射12月NCT01065298[52]

2.1 干細胞治療1型糖尿病的臨床研究 在2015年，Carlsson等[42]將符合受試者納入標準的20位T1D患者隨機分為MSCs治療組和胰島素單獨治療對照組，經靜脈單次移植BM-MSCs，隨訪1年。在1年的觀察中，其中對照組受試者，8例C肽峰值降低，7例在混合餐耐量試驗(mixed-meal tolerance test,MMTT)中C肽曲線下面積(area under the curve,AUC)值降低，MSCs治療組中僅3例C肽峰值和在MMTT中C肽AUC值有所降低。新近， Cai等[43]納入42例T1D患者，隨機分為干細胞移植治療(stem cell transplantation,SCT)組和胰島素單獨治療對照組。SCT組通過胰腺動脈注射1.1×106個/kg臍帶間充質基質細胞(umbilical cord mesenchymal stromal cells,UC-MSC)和106.8×106個/kg 自體骨髓單核細胞 (autologous bone marrow mononuclear cell,aBM-MNC)，間隔3月，隨訪1年。隨訪期間，SCT組受試者HbA1c(糖化血紅蛋白值)降低了12.6%，對照組HbA1c增加了1.2%，SCT組空腹血糖值降低了24.4%，對照組僅降低了4.3%。在觀察末期，SCT組中受試者所需胰島素劑量減少了29.2%，且20例空腹C肽值改善；在對照組中，受試者所需胰島素劑量無明顯改變，僅9例C肽值有所改善。更重要的是，上述兩項研究，均沒有受試者發(fā)生腫瘤或慢性感染，且沒有出現高血糖酮癥酸中毒或輔助性低血糖。

2.2 干細胞治療2型糖尿病的臨床研究 在2014年，Liu等[47]報道了臍帶Wharton’s Jelly間充質干細胞(Wharton’s Jelly mesenchymal stem cell,WJ-MSC)移植聯合藥物治療2型糖尿病。將22例患者納入試驗研究，均接受WJ-MSC移植治療，其中17例同時接受外源胰島素注射治療，其余5例接受口服降血糖藥物治療。經1次靜脈和1次胰腺血管內注射WJ-MSC，移植后隨訪1年。WJ-MSC移植治療后，17例接受胰島素治療的受試者中，5例胰島素用量減少了50%以上。在5例服用降血糖藥物的受試者中，1例在細胞移植治療3月后能完全停藥，通過生活方式干預與合理鍛煉能有效控制血糖，停藥時間為9個月，直到最后一次隨訪；4例藥物用量減少了50%以上。WJ-MSC移植治療6個月后，血清中炎癥因子IL-6和IL-1β降低。同年，Wu等[48]報道了一項骨髓單核細胞與高壓氧結合治療2型糖尿病的研究，證明骨髓單核細胞移植治療2型糖尿病能改善胰島功能和代謝調控，且僅出現能自動恢復的輕微、短暫性副反應。

總之，現有干細胞移植治療糖尿病的臨床試驗報道提示，干細胞移植是治療糖尿病的有效手段。但是，目前這種治療方式臨床病例十分有限，在臨床適應癥、移植供體細胞類型、移植方式、移植劑量以及安全性方面尚需更深入的研究。就干細胞移植治療糖尿病的作用機制，可能涉及到以下幾方面： 一是干細胞通過分化促進胰島β細胞再生；二是干細胞能分泌多種細胞因子，改善胰島素靶組織的胰島素抵抗，提高分化細胞的存活率，保存剩余β細胞和改善胰島素分泌功能；三是干細胞能通過調節(jié)T細胞來控制炎癥和自身免疫反應，減輕對胰島組織細胞的損傷。

3 展望

干細胞在體外具有向IPCs分化的能力，其移植入體內能修復或替代受損胰腺組織，從而達到可能治愈糖尿病的目的。但是，干細胞定向分化為IPCs治療糖尿病方面仍然存在一些亟待解決的關鍵問題：一是干細胞來源多，其增殖、分化與免疫調節(jié)能力存在較大差異；二是現有誘導分化體系復雜，分化周期長，不可控因素多，導致分化IPCs的效率低，且多數IPCs不具備胰島β細胞特征，僅能有限行使胰島的部分功能；三是糖尿病患者行細胞移植術的指征不明，細胞移植的劑量、途徑、次數等技術規(guī)范尚無標準，移植至體內細胞存活率低；四是細胞移植入體內的安全性尚待研究；五是當前臨床研究多為小樣本、開放性研究，且隨訪時間有限，尚未建立規(guī)范的療效評價標準。因此，在基礎研究方面，亟待在種子干細胞的生物學特性、胰腺組織發(fā)育等方面深入研究，構建可以獲得足夠數量、終末分化的功能性胰島細胞的良好的誘導策略。在臨床研究方面，必須開展大樣本、隨機和雙盲的臨床試驗，建立安全、有效、可控的細胞移植技術規(guī)范和療效評價標準，真正為廣大糖尿病患者帶來福音。

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(編輯：譚秀榮)

Directional differentiation of stem cells into insulin producing cells and its clinical application

Luo Yi,Xiao Jianhui

(Institute of Medicinal Biotechnology,Affiliated Hospital of Zunyi Medical University,Zunyi Guizhou 563099,China)

Diabetes mellitus is now a major disease that seriously endangers human health worldwide,and presents a high prevalence.Both the function failure of pancreatic β cells and insulin resistance are recognized as the primary mechanisms in the development of diabetes.Currently,there is no good strategy for cure.In recent years,considerable progress has been achieved in the fields of stem cell research and regenerative medicine.Stem cells with characteristic of multi-directional differentiation have been found to differentiate into insulin producing cells under a specific condition.It suggests that stem cells have the potential to restore and/or replace the lost cells in pancreatic tissue damaged,which bring hope of a cure for diabetics.The article precisely reviews the recent advances on differentiation of stem cells and its clinical application to provide support for the further clinical application of stem cell transplantation in the treatment of diabetes.

Diabetes mellitus; stem cells; insulin producing cells; insulin

國家自然科學基金資助項目(NO：81460156，81660363)；貴州省高層次創(chuàng)新型人才培養(yǎng)計劃(黔科合人才[2015]4028)。

肖建輝，男，博士，教授，碩士生導師，研究方向：干細胞化學生物學與微生物天然藥物發(fā)現，E-mail:jianhuixiao@126.com。

R587.2

A

1000-2715(2017)04-0446-07

[收稿2017-03-20;修回2017-05-20]