李葉麗，岳 云，吳雨婷，付 舒，楊丹莉

(遵義醫(yī)學院 基礎藥理教育部重點實驗室暨特色民族藥教育部國際合作聯(lián)合實驗室，貴州 遵義 563099)

基礎醫(yī)學研究

蛇床子素通過下調TGF-β1信號通路抗野百合堿所致大鼠右心室重構

李葉麗，岳 云，吳雨婷，付 舒，楊丹莉

(遵義醫(yī)學院 基礎藥理教育部重點實驗室暨特色民族藥教育部國際合作聯(lián)合實驗室，貴州 遵義 563099)

目的研究蛇床子素(Ost)對野百合堿(MCT)所致大鼠右心室重構的作用，并探討其可能的機制。方法200～220 g SD大鼠隨機分為正常對照組(Control組，n=8)，模型組(Model組，n=8)，Ost低、高劑量組(Ost10、Ost20組，10、20 mg/kg，n=8)。除正常對照組外的其余大鼠均經(jīng)頸背部一次性皮下注射MCT 50 mg/kg復制右心室重構模型，造模后第1天開始給藥(ig，qd)。給藥28 d后稱大鼠體重(BW)，右室自由壁重量(RV)，計算右室相對質量(RV/BW)；通過HE染色觀察右心室顯微結構；透射電鏡觀察右心室超微結構；Western blot 檢測右心室轉化生長因子(TGF-β1)蛋白的表達；real time RT-PCR檢測右心室結締組織生長因子(CTGF)和纖維連接蛋白(Fn)mRNA的表達。結果與Control組相比，Model組大鼠右室相對質量明顯升高(P<0.05)；右心室心肌細胞肥大畸形且排列紊亂，胞漿腫脹明顯；心肌細胞線粒體腫脹，肌漿網(wǎng)擴張；TGF-β1蛋白的表達明顯上調(P<0.05)；CTGF和Fn mRNA的表達均明顯上調(P<0.05)。與Model組相比，Ost10、Ost20組大鼠右室相對質量明顯降低(P<0.05)；右心室心肌細胞排列較為整齊；心肌細胞線粒體腫脹及肌漿網(wǎng)擴張情況均有所減輕；TGF-β1蛋白的表達明顯下調(P<0.05)；CTGF和Fn mRNA的表達均明顯下調(P<0.05)。結論Ost具有抗MCT所致大鼠右心室重構的作用，其機制至少部分與其下調TGF-β1信號通路有關。

蛇床子素；野百合堿；右心室重構；轉化生長因子β1；結締組織生長因子；纖維連接蛋白

心室重構主要表現(xiàn)為心肌細胞肥大、細胞核肥大畸形、纖維組織增生、炎性細胞浸潤及轉化生長因子(transforming growth factor，TGF)-β的過度表達等[1-2]。故抑制或逆轉右心肥厚、下調TGF-β的表達等均可在一定程度上減輕右心室重構的發(fā)生。野百合堿(monocrotaline，MCT)誘導的肺動脈高壓繼發(fā)的右心室重構模型是公認的制備右心室重構的模型之一[3]。右心室重構及衰竭也是導致肺動脈高壓患者預后差及死亡的主要原因[4-5]。故抑制右心室重構，尋找有效的防治藥物具有重要意義。

蛇床子素(Osthole，Ost)又名甲氧基歐芩酚，是從傘形科蛇床屬植物蛇床Cnidiummonnier(L.)Cusson的果實中提取的一種香豆素類化合物，具有抗炎、抗氧化、擴張血管、抗腫瘤、調血脂等藥理作用[6-9]。已有研究表明，Ost對腎性高血壓誘導的大鼠心肌肥厚具有治療作用[10]。也有研究表明，Ost可通過下調TGF-β1的表達抗野百合堿所致大鼠肺動脈高壓[11]。因此，本課題組推測Ost可能通過抑制右心肥厚、下調TGF-β1的表達發(fā)揮抗右心室重構的作用。故本研究采用MCT誘導右心室重構模型，觀察Ost對該模型的影響，并分析其可能的機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 SD大鼠購自第三軍醫(yī)大學大坪醫(yī)院實驗動物中心，雄性，SPF級， 200～220 g，許可證號：SCXK(渝)2012-0005。

1.2 主要試劑 Ost(純度≥98%，南京澤朗醫(yī)藥科技有限公司)；MCT(美國Sigma公司)；BCA蛋白濃度測定試劑盒、ECL+發(fā)光劑(江蘇碧云天生物技術研究所)；HRP標記的GAPDH抗體(上?？党缮锛夹g有限公司)；TGF-β1抗體(美國Abcam公司)；HRP標記的二抗(英國CST公司)；RNA 逆轉錄試劑盒，熒光混合物，GAPDH、結締組織生長因子(connective tissue growth factor，CTGF)、纖維連接蛋白(fibronectin，F(xiàn)n)引物(TaKaRa 生物工程公司)。

1.3 主要儀器 Olympus BX43光學顯微鏡及照相系統(tǒng)(日本Olympus)；Mini-PROTEAN3電泳儀、Trans-Blot Turbo轉印系統(tǒng)、CCD成像系統(tǒng)、real time RT-PCR 擴增儀、通用酶標儀(美國BIO-RAD公司)；RNA 逆轉錄儀(德國Eppendorf 公司)；透射電子顯微鏡(TECNAI10; Philips,Eindhoven,The Netherlands)。

1.4 分組、造模及給藥 隨機抽取8只大鼠經(jīng)頸背部一次性皮下注射生理鹽水5mL/kg作為Control組(n=8)，其余大鼠經(jīng)頸背部一次性皮下注射MCT 50 mg/kg復制右心室重構模型，造模后將大鼠隨機分為Model組(n=8)，Ost10組(10 mg/kg，n=8)和Ost20組(20 mg/kg，n=8)。其中，Ost10、Ost20組于造模后第1天開始給藥(ig，qd)，Control組和Model組給予等量溶媒(ig，qd)。溶媒為含有0.5%吐溫80的雙蒸水。

1.5 右室相對質量的測定 給藥28 d后稱重(body weight，BW)，7%水合氯醛5mL/kg麻醉成功后分離心臟，于生理鹽水中清洗干凈，游離右心室壁并稱取右室質量(right ventricle，RV)，計算右室相對質量(RV/ BW)。

1.6 蘇木精-伊紅(HE)染色 取2～3 mm右心室組織塊于4%甲醛溶液中固定48h，脫水、包埋、切片，常規(guī)蘇木精-伊紅染色，光鏡下觀察并拍照記錄。

1.7 右心室超微結構的觀察 取右心室心尖處約1 mm3標本置于2.5%戊二醛中固定24 h后洗滌，再放入1%餓酸-磷酸緩沖液固定1.5～2.0 h(4 ℃)，脫水、包埋、染色后于透射電鏡下觀察并拍照記錄。

1.8 Western blot 檢測右心室TGF-β1蛋白的表達 取各組大鼠右心組織提取總蛋白，BCA法定量后經(jīng)10%SDS-PAGE凝膠電泳分離，用電轉移半干轉30 min，將TGF-β1、GAPDH蛋白轉至PVDF膜上，室溫封閉2 h，一抗孵育16 h(4 ℃，TGF-β1按1∶400稀釋，GAPDH按1：5 000稀釋)，二抗室溫孵育1 h，暗室曝光，采用Quantity One定量分析軟件進行灰度分析。

1.9 real time RT-PCR 檢測右心室CTGF和Fn mRNA 的表達 取各組大鼠右心組織， Trizol法提取總RNA，參照GenBank 中大鼠GAPDH、CTGF和Fn mRNA 的序列設計引物。各引物序列如下：GAPDH：上游5′-GGGGCTCTCTGCTCCTCCCT-3′，下游5′- AGTTCGCTGCACCCTCAAA-3′；CTGF：上游5′- CATGGTCAGGCCCTGTGAA -3′，下游5′- CACAGAACTTAGCCCGGTAGGTC-3′；Fn：上游5′-CATCAGCCCGGATGTCAGAA -3′，下游5′- GGCATTGTCGTTGAGCGTGTA-3′。根據(jù)逆轉錄試劑盒說明書操作合成cDNA，real time RT-PCR 擴增儀按如下條件進行檢測：95℃ 3 min；95℃ 15 s，60℃ 45 s，循環(huán)40次。以GAPDH為內參基因，熒光強度達到閾值所需的循環(huán)數(shù)(Ct值)為統(tǒng)計參數(shù)，基因的表達用2-△△Ct表示，相對定量法分析結果。

0.05認為有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 Ost對大鼠右室相對質量的影響 如圖1所示，與Control組比較，Model組右室相對質量明顯升高(P<0.05)。而與Model組相比，Ost10、Ost20組大鼠右室相對質量均降低(P<0.05)。

#P<0.05 vs control；*P<0.05 vs model。圖1 Ost對大鼠右室相對質量的影響(n=8)

2.2 Ost對大鼠右心室顯微結構的影響 與Control組比較，Model組大鼠右心室心肌細胞肥大，結構紊亂，部分胞核寬大畸形，胞漿腫脹明顯。與Model組比較，Ost10、Ost20組大鼠心肌細胞肥大、核畸形及胞漿腫脹情況均明顯改善，結果(見圖2)。

A：Control；B：Model；C：Ost10；D：Ost20。黑色箭頭所指的是胞漿腫脹的心肌細胞，紅色箭頭指的是寬大畸形的胞核。圖2 Ost對大鼠右心室心肌細胞顯微結構的影響(心肌細胞橫切面，HE×400)

2.3 Ost對大鼠右心室超微結構的影響 與Control組相比，Model組大鼠右心室心肌細胞線粒體腫脹，部分呈髓鞘樣退變。與Model組相比，Ost10、Ost20組心肌細胞線粒體腫脹情況均明顯減輕。結果(見圖3)。

2.4 Ost對大鼠右心室TGF-β1蛋白表達的影響 與Control組比較，Model組右心室TGF-β1蛋白的表達明顯升高(P<0.05)。而Ost10和Ost20組右心室TGF-β1蛋白的表達均較Model組明顯下調(P<0.05)，結果(見圖4)。

#P<0.05 vs control；*P<0.05 vs model。圖4 Ost對右心室TGF-β1蛋白表達的影響(n=4)

2.5 Ost對大鼠右心室CTGF和Fn mRNA表達的影響 與Control組相比，Model組大鼠右心室CTGF和Fn mRNA的表達明顯上調(P<0.05)。與Model組相比，Ost10、Ost20組大鼠右心室CTGF和Fn mRNA的表達均明顯下調(P<0.05),結果(見圖5)。

#P<0.05 vs control；*P<0.05 vs model。圖5 Ost對右心室CTGF和Fn mRNA表達的影響(n=8)

3 討論

野百合堿(MCT)是從野百合種子中提取的一種吡咯烷生物堿，經(jīng)肝代謝后生成野百合堿吡咯，可誘發(fā)右心室重構。該模型是目前公認的制備右心室重構的模型之一[3]。本研究結果顯示，與Control組相比，Model組大鼠右室相對質量明顯升高；心肌細胞肥大且結構紊亂，部分胞核寬大畸形，胞漿腫脹明顯；心肌細胞線粒體腫脹，部分呈髓鞘樣退變，提示Model組大鼠出現(xiàn)了明顯的右心室重構。與Model組相比，Ost10、Ost20組大鼠右室相對質量均降低；心肌細胞肥大、線粒體腫脹情況均明顯減輕，提示Ost具有抗MCT誘導的右心室重構的作用。

在哺乳動物中TGF-β有四種亞型，分別為TGF-β1、TGF-β2、TGF-β3、TGF-β1β2。其中TGF-β1以其活性最強且在體細胞系中所占比例最高的特性成為目前研究的熱點。研究表明，TGF-β1是促心肌纖維化的重要細胞因子之一，參與調節(jié)胚層發(fā)育、器官形成、細胞的增殖、分化、遷移和凋亡等，可刺激成纖維細胞的增生、促進膠原合成、使心肌纖維化，心室順應性降低，影響心肌舒縮功能等，在心室重構中發(fā)揮重要作用[12-14]。CTGF是即刻早期基因CCN 家族成員，生理狀態(tài)下在人類的多種組織器官中廣泛表達，病理狀態(tài)下CTGF 的過度表達與疾病的發(fā)生、發(fā)展緊密相關[15]。Fn是一種非膠原性的a2糖蛋白，在人體的發(fā)育、細胞分化、遷移、信號轉導等生理過程及炎癥損傷修復、免疫應答、腫瘤轉移等病理過程中發(fā)揮重要作用[16]。CTGF作為TGF-β1的下游因子，可促使TGF-β1發(fā)揮促增生和細胞外基質合成等作用[17]，也可在TGF-β1的誘導下參與成纖維細胞合成Fn，使細胞外基質沉積，心室重構加重。

已有研究表明，TGF-β1蛋白的表達在MCT誘導的右心室重構模型中明顯升高[18]。而Ost可通過下調TGF-β1的表達抑制異丙腎上腺素所致心肌纖維化的發(fā)生[19]。本研究結果顯示，與Control組相比，Model組大鼠右心室TGF-β1蛋白的表達明顯升高，CTGF和Fn mRNA的表達也明顯上調，提示在該模型中TGF-β1信號通路被激活。與Model組相比，Ost10、Ost20組大鼠右心室TGF-β1蛋白的表達及CTGF、Fn mRNA的表達均明顯下調，提示Ost可能通過抑制TGF-β1信號通路抗右心室重構的發(fā)生。

[1] Choudhary G,Troneales F,Martin D,et al.Bosentan attenuates right ventrieular hypertrophy and fibrosis in normoharie hypoxia model of pulmonary hypertension[J].J Heart Lung Transplant,2011,30(7):827-833.

[2] 魏大闖，肖學鈞.肺動脈高壓與右心室重構的關系[J].心血管病學進展,2013,34(5):648-651.

[3] Campian M E,Hardziyenka M,Michel M C,et al.How valid are animal models to evaluate treatments for pulmonary hypertension[J].Naunyn Schmiedebergs Arch Pharmacol,2006,373(6):391-400.

[4] Prins K W,Thenappan T.World Health Organization Group I Pulmonary Hypertension:Epidemiology and Pathophysiology [J].Cardiol Clin,2016,34(3):363-374.

[5] Barnett C F,Alvarez P,Park M H.Pulmonary Arterial Hypertension:Diagnosis and Treatment[J].Cardiol Clin,2016,34(3):375-389.

[6] 孔亮，姚瓔珈，教亞男，等.蛇床子素對機械性腦損傷小鼠的抗炎抗凋亡作用研究[J].中國藥理學通報,2015,31(7):999-1004.

[7] Zhang Z R,Leung W N,Cheung H Y,et al.Osthole:A Review on Its Bioactivities,Pharmacological Properties,and Potential as Alternative Medicine[J].Evid Based Complement Alternat Med,2015,2015:919616.

[8] Liu Y W,Chiu Y T,Fu S L,et al.Osthole ameliorates hepatic fibrosis and inhibits hepatic stellate cell activation[J].J Biomed Sci,2015,22(1):63.

[9] 張曉平，陳新梅，崔清華，等.蛇床子素藥理作用及其相關機制研究進展[J].中國執(zhí)業(yè)藥師,2013,11(10):28-32.

[10]周峰，鐘文，薛潔，等.蛇床子素對腎性高血壓大鼠心肌肥厚的治療作用[J].蘇州大學學報,2012,32(3):349-353.

[11]李葉麗，王穎婉，錢志強，等.蛇床子素通過下調TGF-β1/Smad2信號通路抗野百合堿所致大鼠肺動脈高壓[J].遵義醫(yī)學院學報,2015,38(6):13-16.

[12]李博，朱平先，劉強，等.NF-κB和TGF-β1與左心室舒張功能衰竭心室重構的相關性研究[J].中華臨床醫(yī)師雜志,2013,7(19):8573-8576.

[13]Mascareno E,Galatioto J,Rozenberg I,et al.Cardiac lineage protein-1 (CLP-1) regulates cardiac remodeling via transcriptional modulation of diverse hypertrophic and fibrotic responses and angiotensin Ⅱtransforming growth factor β (TGF-β1) signaling axis[J].J Biol Chem,2012,287(16):13084-13093.

[14]Xiao X,Chang G,Liu J,et al.Simvastatin ameliorates ventricular remodeling via the TGF?β1 signaling pathway in rats following myocardial infarction[J].Mol Med Rep,2016,13(6):5093-5101.

[15]包晶晶，達林泰，烏蘭其其格.結締組織生長因子的研究進展[J].內蒙古醫(yī)科大學學報,2013,35(2):164-168.

[16]程紅新，楊曉萍，蔣雅紅，等.纖維連接蛋白在腎間質纖維化大鼠腎組織中的表達[J].中國組織工程研究,2012,16(31):5837-5842.

[17]李葉麗，王穎婉，李意奇，等.淫羊藿苷通過降低醛固酮水平減輕自發(fā)性高血壓大鼠腎間質纖維化[J].中國藥理學通報,2014,30(4):519-522.

[18]郭雯，馬涵英，趙鐵夫，等.肺動脈高壓對右心重構及右心室AT1R、TGF-β1、ERK1/2蛋白表達的實驗研究[J].心肺血管病雜志,2014,33(2):296-299.

[19]Chen R,Xue J,Xie M L.Reduction of isoprenaline-induced myocardial TGF-β1 expression and fibrosis in osthole-treated mice[J].Toxicology and Applied Pharmacology,2011,256(2):168-173.

(編輯：譚秀榮)

Osthole reverses the right ventricle remodeling in monocrotaline-treated rats by decreasing the TGF-β1 pathways

Li Yeli,Yue Yun,Wu Yuting,Fu Shu,Yang Danli

(Key Laboratory of Basic Pharmacology of Ministry of Education and Joint International Research Laboratory of Ethnomedicine of Ministry of Education,Zunyi Medical University,Zunyi Guizhou 563099,China)

ObjectiveTo investigate the effect of osthole (Ost) on the right ventricle(RV)remodeling in monocrotaline (MCT)-treated rats,and to explore the mechanisms.Methods200～220 g Sprague-Dawley rats were randomly divided into four groups,which were control group (n=8),model group (n=8),low-dose (10 mg/kg,n=8) and high-dose (20 mg/kg,n=8) of Ost treatment group.Except the control group,the other rats were given a single injection of MCT (50 mg/kg) subcutaneously to establish the RV remodeling.Then the rats in the Ost10and Ost20treatment group were administrated orally once daily from the first day after the injection to the 28th day.The rats in the control group and the model group were given the same amount of menstruum.After 28 days of administration,the body and the RV were weighed separately.RV relative weight was measured by the relative weight ratio of RV to BW.The morphological change of the RV was observed by light microscope and transmission electron microscope.The protein level of transforming growth factor (TGF-β1) was examined by western blot.The mRNA expression of connective tissue growth factor (CTGF) and fibronectin (Fn) were detected by real time RT-PCR.ResultsCompared with the control group,the RV relative weight were increased obviously (P<0.05),myocardial hypertrophy,structure disorders and mitochondrial swelling were observed in the model group.The protein level of TGF-β1 and the mRNA expression of CTGF and Fn were remarkably up-regulated (P<0.05) in the model group.However,in comparison with the model group,the RV relative weight were decreased (P<0.05),myocardial hypertrophy,structure disorders and mitochondrial swelling were improved significantly in the Ost treatment groups.The protein level of TGF-β1 and the mRNA expression of CTGF and Fn were down-regulated in the Ost treatment groups (P<0.05).ConclusionOst can resist the RV remodeling induced by MCT in rats,which may be related to decrease the TGF-β1 pathways.

osthole; monocrotaline; RV remodeling; TGF-β1; CTGF; Fn

國家自然科學基金資助項目(NO:81360498)；遵義醫(yī)學院碩士啟動基金項目(NO：F-773)。

楊丹莉，女，博士，教授，碩士生導師，研究方向：心血管藥理學，抗炎免疫藥理學，E-mail:zmuyangdanli@foxmail.com。

R961

A

1000-2715(2017)04-0383-06

[收稿2017-05-16;修回2017-07-10]