姚 瑞，謝斐昂，嚴安琪，陳永久,

（1.浙江海洋大學國家海洋設施養(yǎng)殖工程技術研究中心，浙江舟山 316022；2.浙江海洋大學海洋科學與技術學院，浙江舟山 316022）

浙江沿海潮間帶多毛類環(huán)節(jié)動物DNA條形碼數(shù)據(jù)庫初建

姚 瑞1，謝斐昂2，嚴安琪2，陳永久1,2

（1.浙江海洋大學國家海洋設施養(yǎng)殖工程技術研究中心，浙江舟山 316022；2.浙江海洋大學海洋科學與技術學院，浙江舟山 316022）

多毛綱環(huán)節(jié)動物是形態(tài)學分類鑒定極為困難的一類海洋生物。本研究旨在構建浙江沿海常見多毛類的DNA條形碼數(shù)據(jù)庫。2015年1-10月期間，針對多毛類環(huán)節(jié)動物在浙江沿海潮間帶進行了多次定性采樣，并對樣本進行了形態(tài)學鑒定以及線粒體COⅠDNA序列分析。從形態(tài)學上共鑒定了8個多毛類物種，隸屬于4個科，即雙齒圍沙蠶Perinereis aibuhitensis、威氏圍沙蠶 P.wilsoni、獨齒圍沙蠶P.cultrifera、雜色偽沙蠶Pseudonereis variegata、雙管闊沙蠶Platynereis bicanaliculata、短毛海鱗蟲Halosydna brevisetosa、巖蟲Marphysa sanguinea、四索沙蠶Lumbrineris tetraura。共得到長度為680～930 bp的13條DNA序列，其中2條屬于P.wilsoni、2條屬于M.sanguinea的片段，這兩個物種的序列還未在BOLD中收錄；1條H.brevisetosa的COⅠ基因序列與GenBank上的同名序列差異較大。計算得到樣本的種內平均遺傳距離為2.8%，科內種間平均遺傳距離為23.9%，科內種間距離遠遠大于種內距離；從而印證了COⅠ可作為多毛類動物分類的條形碼。此外，本研究還設計了一對多毛類動物COⅠ片段的特異性引物，而且適用于擴增A+T含量較高的多毛類物種。

DNA條形碼；線粒體COⅠ序列；形態(tài)學；多毛類；浙江沿海

多毛類是環(huán)節(jié)動物門最大的一個綱。包括80余科，1 600多個屬，10 000多個已描述的種類[1]。多毛類動物大多生活在海洋生境中，是魚類及其他動物的重要餌料，以及海洋資源調查的重要組成部分，也是海洋生物中尚待開發(fā)、利用和保護的潛在對象。然而，相比其他常見類群，如甲殼動物、軟體動物、棘皮動物，多毛類分類學研究的進展最為緩慢[2]。目前，分類學家們已經(jīng)意識到單以形態(tài)學方法來進行多毛類物種的分類鑒定顯得極為繁瑣和耗時[3]。國內外已經(jīng)發(fā)表了許多關于海洋底棲生物多樣性的文章，其中有關多毛類的鑒定也大多數(shù)使用科或屬水平[4]。這是因為目前多毛綱動物還存在著許多不能確定的物種分化，許多類群缺少相關的分類學家；同時，由于受現(xiàn)階段的采樣方法和采樣工具的限制，很難獲得較為完整的多毛類樣本，大多數(shù)樣本都不完整且個體眾多[5]。此外，多毛類動物具有復雜的生活史，不同生長發(fā)育階段形態(tài)各異，加之隱生種的存在，給形態(tài)學分類帶來了極大的挑戰(zhàn)[6]。

對多毛類資源進行開發(fā)、利用和保護，都要求對形態(tài)相似的物種進行確切的劃分。然而，僅依賴形態(tài)學分類顯然難以滿足這些要求，因此建立一套基于遺傳信息的快速、高效、精確并且國際化的多毛類物種鑒定標準，這對提高海洋生物資源調查和海洋生態(tài)系統(tǒng)評估的效率和科學性具有深遠的意義。2003年加拿大分類學家HEBERT等[7]提出以線粒體COI DNA序列作為普遍的動物DNA條形碼。與形態(tài)學鑒定參考標準不同，DNA條形碼是直接將采樣個體與全球化的DNA條形碼數(shù)據(jù)庫中的序列信息進行比較[8]，從而較為客觀、準確地鑒定物種；由于條形碼檢測對樣本的完整程度和形態(tài)特征沒有限制，故可用于鑒別多毛類碎片樣本，以及不同生長生活階段的個體。但是這一方法的真正推行，有賴于全球范圍內的相關研究人員，以統(tǒng)一的標準、同一形式對盡可能多的多毛類物種進行條形碼提取和數(shù)據(jù)庫構建，以降低人為因素造成的誤差[9]。

至今，以COⅠ基因為基礎的條形碼數(shù)據(jù)庫BOLD（http://www.barcodinglife.org）已經(jīng)覆蓋了4 827 188個物種，但是關于多毛類的條形碼只有10 430條，而其中鑒定到種這一分類階元的僅有6 555個。從物種范圍上看，大多數(shù)僅停留在特定屬和種[10-12]，大量多毛類物種的條形碼信息仍尚未報道。而從地理分布來講，大多數(shù)研究的主要集中于美國—加拿大—阿拉斯加沿海，以及中國黃渤海沿海以及葡萄牙、挪威等地沿海[13]，其他海域和近海的研究十分匱乏。根據(jù)BOLD數(shù)據(jù)庫（2014）的統(tǒng)計顯示，雖然已描述的多毛類環(huán)節(jié)動物已有一萬多種，但是僅793個物種的DNA條形碼在BOLD上收錄。

本研究為了構建浙江沿海多毛類環(huán)節(jié)動物的DNA條形碼數(shù)據(jù)庫，在浙江沿岸潮間帶進行定性采樣。結合形態(tài)學鑒定，通過對線粒體COⅠDNA序列測序和分析，探索一套較為系統(tǒng)、完整的條形碼數(shù)據(jù)庫構建的基本思路及關鍵技術，初步建立浙江沿海多毛類DNA條形碼數(shù)據(jù)庫，也為使我國多毛類物種鑒定早日擺脫繁瑣、耗時的手工操作局面創(chuàng)造技術和數(shù)據(jù)條件。

1 材料與方法

1.1 樣本采集與保存

本研究于2015年1月至10月期間，在浙江沿海潮間帶進行了多次多毛類動物定性采樣。采樣地最北至舟山東極青浜島，最南至蒼南；涉及到泥沙相、沙相、巖相以及礫石相等多種潮間帶底質環(huán)境。采樣點包括舟山東極島、朱家尖島和六橫島，以及象山，溫州洞頭島，平陽南麂列島和蒼南（圖1）。采集采樣深度不超過10 m。采樣點的溶解氧（DO 值）在 0.768～0.938 mg/L，鹽度在 28～33范圍內。

采集到的活體樣本帶回實驗室后，置于孔徑0.5 mm的鋼篩上，先用海水沖洗，再用蒸餾水浸泡活體30 s進行麻醉使其剛毛、疣足、觸須等結構完全舒展，以便于觀察，最后在解剖鏡下進行形態(tài)學鑒定。對需要進行分子生物學鑒定的個體（每個采樣點同一個物種選2～3個個體）在近尾部剪取2 mm3大小的肌肉組織樣本置于95%的乙醇溶液中，以備提取總DNA。其余部分和其他個體也置于相同濃度的乙醇中，并放入硫酸紙標簽密封保存，置于4℃標本陳列柜中長期保存。樣本編號、采集地等信息見表1。

圖1 采樣點分布圖Fig.1 Map shows sampling sites

1.2 形態(tài)學觀察樣本

本研究使用Optec光學解剖鏡，對所有樣本進行觀察、解剖、對比，并參考《中國動物志·無脊椎動物門·多毛綱·沙蠶目》和《中國近海多毛環(huán)節(jié)動物》中各物種的分類特征[14-15]，對標本進行特征記錄和繪圖。對于剛毛和疣足上其他微小結構制作了臨時裝片，用Olympus-CX31光學顯微鏡對顯微結構的觀察，拍照和繪圖。用數(shù)碼顯微鏡對每一個物種進行整體拍照，輔以詳細的形態(tài)描述，以達到準確鑒定的目的。

1.3 DNA提取和儲存

在形態(tài)學鑒定的基礎上，選取一部分具有物種和地理代表性的樣本提取基因組總DNA。提取方法采用高鹽法[16]。提取的總DNA溶于DEPC水或TE溶液，然后通過Thermo公司的Nanodrop 2000/2000C分光光度計檢測DNA產(chǎn)品的OD260 nm、OD280 nm值，以及濃度和純度，并用1%的瓊脂糖凝膠電泳（160 V、80 A）檢測DNA產(chǎn)品的質量。符合實驗要求的DNA樣本保存于-20℃冰箱中備用。

1.4 COⅠ基因PCR擴增

線粒體COⅠ基因的PCR擴增使用了2對引物，其中第一對參考FOLMER等[17]設計的引物；第二對是針對多毛綱環(huán)節(jié)動物自行設計的特異性引物PolyCoⅠF2（5‘-TCCACTAATCAYAAAGAYATTGG-3’）和PolyCoⅠR4（5‘-GCGAGTCATCTAAATACTTTAAT-3’）。兩對引物使用前都經(jīng)梯度PCR驗證，引物設計使用Primer 3軟件（http://primer3.ut.ee/）。根據(jù)引物的在已知COⅠDNA序列的位置，我們推算第一對引物可以擴增出750 bp，第二對可擴增出約900 bp的DNA片段，所有引物均由上海生工生物有限公司合成。

PCR 總體積為 25 μL 體系，反應體系為 1×Taq MasterMix(Dye)12.5 μL，模板 DNA 1 μL（＜10 ng），正、反向引物各1 μL（0.4 μM），滅菌的雙蒸水9.5 μL。TaqMix為康維世紀有限公司的產(chǎn)品。擴增反應在PTC-100型PCR儀上進行，反應程序為先94℃預變性4 min；之后運行35個循環(huán)，即94℃變性45 s，46～48℃退火30 s，72℃延伸 1 min。循環(huán)結束后在72℃ 再延伸7 min使PCR產(chǎn)物穩(wěn)定。擴增產(chǎn)物用Loading Buffer染色后，經(jīng)混有綠如藍熒光染料的1%的瓊脂糖凝膠電泳分離，并用凝膠成像系統(tǒng)觀察、拍照，檢測擴增產(chǎn)物的質量。

1.5 DNA測序及序列分析

選取擴增質量良好的PCR產(chǎn)物寄往上海生工生物有限公司測序。每個樣本都采用了雙向引物測序，以確保所得序列的準確性。

所得到的雙向序列采用Sequencher v5.4軟件 (Gene Codes)進行核對、校正。校正好的序列采用BioEdit 7.0軟件比對，剪去引物和首尾測序質量較差的部分，然后通過與GenBank（https://www.ncbi.nlm.nih.gov）和BOLD數(shù)據(jù)庫中收錄的序列比對來確定物種。最后用MEGA 5.0軟件[18]對排列好的全部序列進行Kimura雙參數(shù)（K-2-P）遺傳距離分析，并采用鄰接法（Neighbor-joining，NJ）聚類。聚類樹的置信度采用10 000次Bootstrap重采樣檢驗。

2 結果

2.1 形態(tài)學鑒定結果

通過對采集獲得的樣本進行形態(tài)學觀察、記錄，參考多毛類形態(tài)學分類著作，依據(jù)口前葉結構、顎齒形狀和排列方式、疣足和剛毛結構等主要形態(tài)學分類學標志。本研究收集到的樣本共鑒定得到了8個多毛類物種，即雙齒圍沙蠶Perinereis aibuhitensis、威氏圍沙蠶P.wilsoni、獨齒圍沙蠶P.cultrifera、雜色偽沙蠶Pseudonereis variegata、雙管闊沙蠶Platynereis Bicanaliculata、短毛海鱗蟲Halosydna brevisetosa、巖蟲Marphysa sanguinea、四索沙蠶 Lumbrineris tetraura。其中 P.aibuhitensis、P.wilsoni、P.cultrifera三個物種隸屬于圍沙蠶屬 Perinereis；P.variegata屬于偽沙蠶屬 Pseudonereis；P.bicanaliculata屬于闊沙蠶屬Platynereis；Perinereis、Pseudonereis、Platynereis這三個屬都歸于沙蠶目沙蠶科。H.brevisetosa屬于葉須蟲目背鱗蟲科的海鱗蟲屬Halosydna；而M.sanguinea和L.tetraura則都是屬于磯沙蠶目的物種，前者屬于磯沙蠶科巖蟲屬Marphysa，后者是索沙蠶科索沙蠶屬Lumbrineris的物種，具體分類學信息見表1。

2.2 線粒體COⅠDNA序列分析

本研究獲得了13個樣本的線粒體COⅠDNA序列，其中12條是由第一對引物擴增獲得，長度約為680 bp；只有樣本KY129886是第二對引物擴增獲得，長度約為930 bp。所得的序列都編輯成長度為590 bp的片段進行變異指數(shù)、單倍型、遺傳距離以及聚類分析。分析表明，COⅠ片段中T，C，A，G的平均含量分別為31.4%，24.9%，26.7%，17.0%；A+T含量（58.1%）顯著高于G+C含量（41.9%）。具體見表1。

所有13條DNA都提交至GenBank。每一條序列都給予唯一的GenBank登錄號，對應于樣本編號，以便后續(xù)的工作。BLAST搜索發(fā)現(xiàn)，只有部分序列樣本在GenBank中可找到相似度高于99%的同源序列（表1）。BOLD數(shù)據(jù)庫查找表明，除了KY129888、KY129889這兩個樣本所屬物種與KY129890所對應物種沒有被BOLD確認外，給出的其余物種與本研究得到的形態(tài)學鑒定結果一致。

一個來自于舟山東極島的樣本KY129886與GenBank參考序列（HM473396.1）相似度僅為88%。該參考序列的物種為Halosydna brevisetosa，2010年7月上傳至BOLD，標本采集地為加拿大不列顛哥倫比亞省沿海。本研究中采自東極的一個樣本（GenBank登錄號KY129886）在BOLD數(shù)據(jù)庫中較早發(fā)布的H.brevisetosa序列相似度達100%。根據(jù)本實驗形態(tài)學鑒定的結果，KY129886可以認定為H.brevisetosa。KY129888和KY129889這兩個樣本與GenBank參考序列（KC800623）相似度為94%；根據(jù)形態(tài)學鑒定結果，它們應屬于Perinereis wilsoni。但是BOLD數(shù)據(jù)庫中缺少該序列相應的形態(tài)學和圖片信息，故本研究將其序列和形態(tài)學和圖片數(shù)據(jù)共同上傳于BOLD數(shù)據(jù)庫作為條形碼。此外，KY129890這個樣本與GenBank參考序列，KF733802的相似度達99%。在BOLD數(shù)據(jù)庫中缺乏這些序列的參考物種信息，結合本研究的形態(tài)學和分子學兩方面鑒定結果，我們認為KY129890屬于Marphysa sanguinea。并將其序列和形態(tài)學和圖片數(shù)據(jù)共同上傳于BOLD數(shù)據(jù)庫作為條形碼。

2.3 聚類關系與遺傳距離

從圖2 NJ聚類樹上可以看出，13個樣本可清晰地分為8個物種，即雙齒圍沙蠶、威氏圍沙蠶、獨齒圍沙蠶、雜色偽沙蠶、雙管闊沙蠶、短毛海鱗蟲、巖蟲Marphysa sanguinea、及四索沙蠶。在NJ聚類關系中，圍沙蠶屬Perinereis的三個物種沒有形成單系群。在聚類樹上，采用形態(tài)學鑒定的八個物種與來自GenBank的八條參考物種序列相吻合，即 Pseudonereis variegata，Platynereis bicanaliculata，Perinereis wilsoni，P.cultrifera，P.aibuhitensis，Marphysa sanguinea，Lumbrineris tetraura，Halosydna brevisetosa. 與 JX503027、GU362685、KC800623、KC80062、KF611806、KF733802、EU352318、及 HM473400 分別聚成置信度極高（Bootstrapping值均為100%）的單系群。

表1 采集樣本的信息包括拉丁名、采集地、CO I DNA GenBank登陸號、A+T 含量、形態(tài)學鑒別的特征（觸角、觸手、觸須、眼、頜、顎齒）；以及來自GenBank參考物種序列的登陸號、BLAST 比對的相似度Tab.1 Sample information including scientific name, collection site, GenBank accession code for CO I DNA, A+T content, and characters used in morphological identification (palp, tentacle, tentacular cirri, eye, jaws), as well as accession code for reference sequence

本研究中的13條序列樣本屬于4個科，即沙蠶科Nereidae、磯沙蠶科Eunicidae、索沙蠶科Lumbrineridae和背鱗蟲（亞）科Lepidonotinae。沙蠶科Nereidae 包括3個屬Pseudonereis、Perinereis、Platynereis；磯沙蠶科Eunicidae有1個屬Marphysa；索沙蠶科有1個屬Lumbrineris，背鱗蟲亞科Lepidonotinae有1個屬Halosydna。故按各個科物種計算種內遺傳距離，由于沙蠶科Nereidae有3個屬Pseudonereis、Perinereis、Platynereis，故以此計算科內種間遺傳距離。不同分類水平上，種內、科內種間及科間的Kimura雙參數(shù)距離數(shù)據(jù)匯總于表2。種內平均遺傳距離為2.8%，在0.2%～14.3%的范圍內波動，而科內種間平均遺傳距離為23.9%，在20.6%～26.9%的范圍內波動；科間平均遺傳距離為31.3%，在28.1%～35.5%范圍內波動。顯然，科內種間平均遺傳距離遠大于種內平均遺傳距離，且前者最小值也大于后者最大值，兩者已形成了遺傳距離上的溝壑。

表2 基于13個多毛類樣本及8個參考物種CO I DNA序列計算得到的種內、科間種內及科間的K-2-P遺傳距離，包括平均值、最小值、及最大值Tab.2 The mean,minimum,and maximum values of K-2-P distances within species,between species within family and between families

圖2 基于COⅠDNA序列的多毛類NJ聚類樹Fig.2 NJ tree of polychaetes based on COⅠDNA sequences

3 討論

3.1 多毛類線粒體COⅠPCR的引物

與其他無脊椎動物相同，多毛綱動物COⅠDNA序列A+T含量較高。本研究所有樣本A+T的平均含量高達58.1%，其中Marphysa sanguinea的A+T含量最低為56.5%，而Halosydna brevisetosa則高達60.4%。A+T含量高一方面使得多毛類COⅠ基因序列PCR擴增時必須要使用較其他類群更低的退火溫度，一般是48℃左右，H.brevisetosa等物種需要46℃。較低的退火溫度造成了PCR產(chǎn)物純度下降，增加了該物種COⅠDNA片段擴增及測序的難度。另一方面，大量重復的A、T核苷酸，往往導致引物很難結合到模板DNA上，從而使PCR反應終止。在本次研究中，特別是H.brevisetosa等幾個物種未能用FOLMER等[17]的引物擴增出COⅠDNA片段。針對這一問題我們專門設計了適用于高A+T含量的多毛類物種COⅠDNA的一對特異性引物，即PolyCoⅠF2和PolyCoⅠR4。經(jīng)過測試，發(fā)現(xiàn)PolyCoⅠF2和PolyCoⅠR4這對引物組合擴增效果比較穩(wěn)定，并成功測定了長度為930bp的COⅠDNA序列，其中一條在此研究中報道。

對于A+T含量高的多毛類物種COⅠDNA序列來說，與FOLMER等的引物相比，新設計的引物跨過了A、T核苷酸大量重復的區(qū)域，特別是反向引物PolyCoⅠR4與FOLMER等的COⅠ2198相比，不但與正向引物相距更遠，而且?guī)缀跬耆挥诙嗝怌OⅠ基因的序列保守區(qū)上，因此對于高A+T含量的多毛類物種，采用本研究設計的引物可以擴增片段更長、特異性更高的COⅠDNA片段，在多毛類環(huán)節(jié)動物DNA條形碼研究中具有明顯的優(yōu)勢。

3.2 多毛類分類與DNA條形碼數(shù)據(jù)庫

根據(jù)形態(tài)學，本研究共鑒定了8個物種，均得到了GenBank中DNA數(shù)據(jù)的有力支持，形態(tài)學與DNA鑒定結果一致。獲得的長度為930 bp的一個樣本序列，以及長度為680 bp的12個樣本序列都已上傳至GenBank。同時，條形碼圖片和形態(tài)學信息已上傳至BOLD數(shù)據(jù)庫。目前，BOLD數(shù)據(jù)庫中，關于多毛類的信息共有10 430條，其中鑒定到種分類階元的僅6 555條。相比其他類群，多毛類數(shù)據(jù)庫規(guī)模還極為有限，本研究在一定程度上使多毛類動物條形數(shù)據(jù)庫得到有效擴充，但仍需補充更多的樣本。

GenBank中僅有一個來自山東青島的威氏圍沙蠶COⅠDNA序列，尚缺少相關文獻支持，而且BOLD數(shù)據(jù)庫也沒有相應的形態(tài)學和圖片信息。本實驗經(jīng)過反復地形態(tài)學觀察，以及COⅠDNA序列比對認為KY129888等兩個樣本屬于威氏圍沙蠶。得到的630 bp DNA序列及相關的圖片信息已上傳至BOLD數(shù)據(jù)庫暫作為該物種條形碼。由于劉瑞玉[19]編著的《中國海洋生物名錄》一書中，東海區(qū)并不是該物種的分布區(qū)，而且該3個COⅠ序列與青島報道的該物種相似度僅為94%，因此采自浙江沿海的P.wilsoni個體是否為隱生種還需要通過核DNA信息對比進行驗證。但是根據(jù)CHRISTOPHER等[20]在2006年的文章，可以推知P.wilsoni其實是屬于多齒圍沙蠶的一個類群。臺灣地區(qū)是多齒圍沙蠶主要分布區(qū)域，本研究采集到的該物種樣本均來自于浙江南部海域，該海區(qū)與臺灣海域相連，而且夏季黑潮的次表層水和臺灣海峽暖水團混合形成臺灣暖流，沿著閩浙槽狀凹地北上，一直達到長江口[21]。加上東南季風影響勢力很大，多毛類幼蟲期的擔輪幼蟲營浮游生活，因此多齒圍沙蠶幼體很有可能隨洋流到達浙南、閩北一帶海域。此外，由于其翻吻Ⅲ區(qū)兩側各有一排圓錐形顎齒，而本地種多齒圍沙蠶并無這一特征。故我們認為這幾個樣本屬于威氏圍沙蠶，而且很有可能與臺灣的威氏圍沙蠶屬于同一類群。但若要驗證這一假設還需要臺灣的樣本作比較，從而進一步說明其分布特點。

經(jīng)過COⅠDNA序列比對，采自蒼南的KY129876和象山的KY129877樣本屬于四索沙蠶L.tetraura。由于長葉索沙蠶L.longiforlia和四索沙蠶在形態(tài)上極為相近，因此僅形態(tài)學鑒定很可能導致誤判，這也進一步說明了DNA條形碼在海洋多毛類動物分類學上有著巨大的優(yōu)勢和應用前景。

從Kimura雙參數(shù)的遺傳距離看，種內平均遺傳距離為2.8%，而沙蠶科內種間平均遺傳距離為23.9%，科內種間距離遠遠大于種內距離。而且種內和科內種間遺傳距離之間存在明顯的分歧，說明COⅠ序列完全可以作為多毛類環(huán)節(jié)動物分類鑒定的分子條形碼。

雖然多毛類多數(shù)類群的成體遷移能力較低，但幼體可浮游，因而分布范圍十分廣泛。這類海洋生物適應能力極強，在多種生境下均可生存，因而又形成了適應各地相應生態(tài)環(huán)境的類群。來自于舟山東極貽貝養(yǎng)殖場的短毛海鱗蟲樣本經(jīng)形態(tài)學和分子生物學（BOLD數(shù)據(jù)庫相似度為100%）共同驗證屬于短毛海鱗蟲。但是BLAST的結果顯示，該樣本與GenBank中的參考序列HM473396相似度僅為88%。由于本研究缺少該物種足夠的DNA序列樣本，因此下載了GenBank中的HM473396一起進行分析和遺傳距離計算，由此造成該物種種內遺傳距離高達13.48%。多毛綱屬于高級無脊椎動物，起源于距今大約6億年的寒武紀時期，進化歷史相當漫長[14]。加拿大不列顛哥倫比亞省和浙江省舟山東極島有太平洋的阻隔，且在漫長的地質時代里，這兩個地區(qū)沒有匯合過，反而隨著太平洋板塊的擴大而不斷遠離，地理隔離顯著[2]，因而來自于這兩個采樣點的短毛海鱗蟲群體長期缺少基因交流，兩者的COⅠDNA序列可變位點的低頻突變也就分別被保留了下來。同時，由于該類群多附著于其他生物群落或者棲息于大的龍介蟲棲管中，其棲息地生態(tài)環(huán)境相對穩(wěn)定，受自然選擇壓力較小，因此在外形上并未發(fā)生明顯的分化，一些主要形態(tài)學鑒別特征仍然一致[1]。但是鑒于本研究的實驗數(shù)據(jù)，我們推測我國東海的短毛海鱗蟲群體和加拿大地區(qū)的群體已經(jīng)發(fā)生了分化。由于本研究分析的樣本數(shù)較少，因此未能充分驗證東海的短毛海鱗蟲是否屬于隱生種，準確鑒定還需要進一步的數(shù)據(jù)支持。

此外，聚類結果顯示，圍沙蠶屬的三個物種不是一個單系群。由于圍沙蠶屬的物種都屬于全球范圍內的廣布種，生物多樣性極高，因此不斷有隱生種被報道，且該屬所包含的物種也時常被調整，故該類群也是目前多毛類研究的一個熱門。隨著雙齒圍沙蠶的人工養(yǎng)殖的不斷規(guī)模化，對該類群其他物種的研究也必將不斷深入。

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Development of DNA Barcode Reference Library for Polychaetous Annelids Identified from the Coastal Intertidal Zone of Zhejiang Coastal Sea

YAO Rui1,XIE Fei-ang2,YAN An-qi,et al
(1.National Engineering Research Center for Mariculture,Zhejiang Ocean University,Zhoushan 316022;2.Marine Science and Technology School of Zhejiang Ocean University,Zhoushan 316022,China)

It remains a big challenge for accurate identification of marine polychaetous annelids solely depending on morphology.This study aimed to develop a DNA barcode reference library for polychaetes collected from intertidal zones of Zhejiang coastal sea during the period from January to October,2015.Samples were selected for mitochondrial COⅠDNA sequence analysis after morphological examination.Eight species from fourfamilies,i.e.Perinereis aibuhitensis,P.wilsoni,P.cultrifera,Pseudonereis variegata,Platynereis bicanaliculata,Halosydna brevisetosa,Marphysa sanguinea and Lumbrineris tetraura were identified from 13 COⅠ DNA sequences at the length of 680-930 bp;two sequences of P.wilsoni and two sequences of M.sanguinea are unavailable in BOLD’s collection;one sequence shares 88%similarity with a sequence of H.brevisetos on Gen－Bank;The average K-2-P distance within species is 2.8%and between species within family is 23.9%.The significant gap in K-2-P distance between-species and within-species suggests that COⅠsequence is suitable for DNA barcoding in Polychaeta.In addition,we designed a pair of primers for amplifying CO I DNA fragment of polychaete species,especially of species that have high A+T composition in the gene.

DNA barcoding;mitochondrial COⅠsequence;morphology;polychaete;Zhejiang coastal sea

Q959.192

A

1008－830X(2017)02－095－08

2016-11-02

科技部基礎性工作專項（2014FY110500）

姚瑞（1992-），男，河南平頂山人，碩士研究生，研究方向：海洋生物學.

陳永久（1969-），男，浙江舟山人，博士，副教授，研究方向：海洋生物學.E-mail:yongjiu.chen@gmail.com