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(1.昆明理工大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院,云南昆明 650500; 2.云南省第一人民醫(yī)院胸外科,云南昆明 650228)

胺鮮酯提高雨生紅球藻(HaematococcuspluvialisLUGU)蝦青素含量的作用

丁巍1,余旭亞1,彭俊2,*

(1.昆明理工大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院,云南昆明 650500; 2.云南省第一人民醫(yī)院胸外科,云南昆明 650228)

探究添加不同濃度的胺鮮酯(diethyl aminoethyl hexanoate,DA-6)在雨生紅球藻HaematococcuspluvialisLUGU培養(yǎng)過程中對(duì)生物量、蝦青素含量、活性氧(ROS)水平以及葉綠素濃度的作用。結(jié)果表明,0.1 mmol/L DA-6可以略微增加生物量(0.52 g/L),但相對(duì)于同一天對(duì)照組,可以顯著(p<0.05)提高蝦青素含量,最大含量可達(dá)24.94 mg/g,是對(duì)照組(16.43 mg/g)的1.52倍,此時(shí)藻細(xì)胞內(nèi)ROS水平以及葉綠素濃度相比于對(duì)照組均出現(xiàn)了降低。研究表明,DA-6誘導(dǎo)可以促進(jìn)蝦青素含量的提高,這為蝦青素產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)提供了一種有效的策略。

胺鮮酯,雨生紅球藻,蝦青素,活性氧,葉綠素

蝦青素(astaxanthin)是一種具有高附加值的酮式類胡蘿卜素,由于其具有極強(qiáng)的抗氧化性,在食品、保健品、醫(yī)藥行業(yè)得到了廣泛的應(yīng)用[1-3]。目前天然蝦青素主要來源有微藻、植物、細(xì)菌、水產(chǎn)品下腳料、紅發(fā)夫酵母[4],綠藻門單細(xì)胞綠藻雨生紅球藻由于能積累比其他來源高的蝦青素(達(dá)藻細(xì)胞干重的5%)而備受關(guān)注[5]。

誘導(dǎo)條件下,促進(jìn)雨生紅球藻大量積累蝦青素已成為當(dāng)前研究的熱點(diǎn)。研究發(fā)現(xiàn)雨生紅球藻在加入誘導(dǎo)子的條件下,如茉莉酸、赤霉素、乙烯利等能促使雨生紅球藻大量積累蝦青素[6-7]。胺鮮酯(diethyl aminoethyl hexanoate,DA-6)是一種合成的植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑,能刺激植物合成葉綠素、蛋白、核酸,增強(qiáng)干物質(zhì)的積累,提高碳、氧的代謝,延長(zhǎng)植物的生長(zhǎng)期[8]。Jiang等[9]發(fā)現(xiàn),添加適宜濃度的DA-6可以促進(jìn)微藻次級(jí)代謝產(chǎn)物的積累。由此推測(cè),DA-6對(duì)雨生紅球藻中蝦青素的積累可能具有一定的影響。

本文采用DA-6作為誘導(dǎo)劑,測(cè)定了雨生紅球藻生長(zhǎng)、葉綠素含量、ROS以及蝦青素含量等指標(biāo),以便為在生產(chǎn)上利用活性氧誘生劑提高蝦青素含量提供技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1材料與儀器

雨生紅球藻(HaematococcuspluvialisLUGU) 本實(shí)驗(yàn)室篩選、保存;胺鮮酯(DA-6) ≥99.8%，(江蘇)金壇茂盛精細(xì)化工;DMSO ≥99.5%,北京鼎國(guó)昌盛生物技術(shù)有限公司;KOH ≥99.5%,北京鼎國(guó)昌盛生物技術(shù)有限公司;甲醇 分析純,北京鼎國(guó)昌盛生物技術(shù)有限公司;2′,7′-二氯熒光黃雙乙酸鹽(DCFH-DA) (上海)碧云天。

XS-212-202顯微鏡 JNOEC;VS-840-1超凈工作臺(tái) 上海博訊;FD5-12冷凍干燥機(jī) SIM International Group;Ultrospec 2100pro紫外可見分光光度計(jì) Amersham Biosciences;LDZX-50KBS滅菌鍋 上海申安;FA2004N分析天平 上海箐海;HHW-D6水浴鍋 金壇雙捷;5804R離心機(jī) Eppendorf;1730R高速冷凍離心機(jī) Labogene Scanspeed;DS-8510DTH超聲波微波組合體系 上海生析;RF-540熒光分光光度計(jì) 日本島津。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 雨生紅球藻的培養(yǎng) 以BBM培養(yǎng)基(Bold’s Basal Medium)為基礎(chǔ)培養(yǎng)基[15],取保藏于試管中的藻種,接種到3 L(內(nèi)置2 L培養(yǎng)基)光生物反應(yīng)器中,室內(nèi)恒溫(25±1) ℃,光照強(qiáng)度2800 Lx,通入0.1 vvm的無菌空氣進(jìn)行培養(yǎng),直至培養(yǎng)到指數(shù)中期(12 d,約6.5×105cells/mL)。

1.2.2 胺鮮酯處理 將培養(yǎng)至指數(shù)中期的種子液3800×g離心5 min,用無菌水洗去營(yíng)養(yǎng)鹽,然后把藻液沉淀重新懸浮到0.25 g/L NaNO3BBM(MBBM)[16]培養(yǎng)基中(接種量約為2×105cells/mL,培養(yǎng)基總體積為400 mL)。用去離子水溶解DA-6作為母液,將不同體積的DA-6母液添加到MBBM培養(yǎng)基誘導(dǎo)培養(yǎng),使誘導(dǎo)培養(yǎng)基中添加DA-6濃度分別為0(Control)、0.05、0.1、0.2 mmol/L(保持液位相等),每組設(shè)3個(gè)平行樣。持續(xù)鼓入0.4 vvm的含1.5%二氧化碳的無菌空氣,24 h 8000 Lx光照,置于(27±1) ℃室內(nèi)培養(yǎng)15 d,以誘導(dǎo)藻細(xì)胞積累蝦青素。每隔一天取樣一次,測(cè)定H.pluvialisLUGU蝦青素含量和生物量。

1.2.3 蝦青素含量和生物量濃度的測(cè)定 為了測(cè)定基礎(chǔ)培養(yǎng)基中培養(yǎng)的H.pluvialisLUGU蝦青素的含量,采用Boussiba等[17]的方法稍加改進(jìn)測(cè)定其蝦青素含量。每隔一天定期取出5 mL處于誘導(dǎo)階段的藻液,5000 r/min離心5 min,棄上清液。于收集的藻細(xì)胞沉淀中加入5% KOH和30%甲醇混合液置于65 ℃水浴鍋內(nèi)5 min,5000 r/min離心收集沉淀,加入3 mL二甲亞砜(DMSO),利用超聲波破壁(20 s/5 s,輸出功率40 W),反復(fù)抽提直至藻體發(fā)白后,高速離心機(jī)10000 r/min離心10 min,取上清液于490 nm下測(cè)定OD值,按公式(1)計(jì)算蝦青素濃度。另外,每隔一天定期取出5 mL處于誘導(dǎo)階段的藻液5000 r/min離心10 min、-20 ℃冷凍、干燥、稱重,按公式(2)計(jì)算藻細(xì)胞生物量濃度,按公式(3)得蝦青素含量。

c=(4.5×A490×Va)/Vb

式(1)

式中:c為蝦青素濃度(mg/L),4.5為固定常數(shù),A為OD490值,Va為DMSO的體積(mL),Vb為藻液體積(mL)。

DBW=WA/V

式(2)

式中,DBW為細(xì)胞生物量濃度(g/L),WA:藻粉干重(g);V:藻液體積(L)。

P=c/DBW

式(3)

式中,P為蝦青素含量(mg/g),c為蝦青素濃度(mg/L),DBW為細(xì)胞生物量濃度(g/L)。

1.2.4 微藻葉綠素和活性氧的測(cè)定 取微藻培養(yǎng)液5 mL,5000×g離心10 min,棄上清得藻細(xì)胞,加5 mL 90%丙酮,振蕩混勻,在40 ℃恒溫振蕩2 h,5000×g離心10 min,重復(fù)上述操作直至藻體發(fā)白,取上清液,分別在663、645 nm測(cè)定光密度值,提取液中葉綠素含量按Becker的方法計(jì)算[18]。葉綠素濃度(mg/L)=20.21×OD645+8.02×OD663。

取微藻培養(yǎng)液5 mL,調(diào)節(jié)細(xì)胞濃度1×105cells/mL,5000×g離心10 min,棄上清得藻細(xì)胞,去離子水洗滌兩遍去除殘留培養(yǎng)基,加10 mmol/L 2′,7′-二氯熒光黃雙乙酸鹽(DCFH-DA)1 mL,避光37 ℃恒溫振蕩孵育30 min,5000×g離心10 min,棄上清,PBS緩沖液(0.05 mmol/L,pH=7)洗滌兩次去除未反應(yīng)的DCFH-DA,5000×g離心10 min,棄上清,加3 mL PBS緩沖液(0.1 mmol/L,pH=7)重新懸浮。DCFH-DA作為熒光探針,本身不具有熒光,進(jìn)入細(xì)胞后被酯酶水解為二氯熒光黃(DCFH),在活性氧存在時(shí)DCFH被氧化為不能透過細(xì)胞膜的強(qiáng)綠色熒光物質(zhì)DCF,強(qiáng)度與細(xì)胞內(nèi)活性氧水平成正比,通過熒光分光光度計(jì),488 nm激發(fā)波長(zhǎng),500～600 nm吸收波長(zhǎng)檢測(cè)細(xì)胞熒光強(qiáng)度,對(duì)細(xì)胞內(nèi)ROS產(chǎn)生水平進(jìn)行測(cè)定。

1.2.5 數(shù)據(jù)處理 本文全部實(shí)驗(yàn)均設(shè)置三組平行,利用ANOVA(SPSS19.0)一步法分析實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。最小顯著性差異進(jìn)行多重比較檢驗(yàn)調(diào)查不同實(shí)驗(yàn)的組間差異,且當(dāng)p<0.05具有顯著性意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 DA-6對(duì)誘導(dǎo)培養(yǎng)微藻細(xì)胞生長(zhǎng)的影響

在誘導(dǎo)條件下,雨生紅球藻細(xì)胞的生長(zhǎng)發(fā)生明顯的變化。圖1顯示,添加不同濃度的DA-6對(duì)藻細(xì)胞的生長(zhǎng)產(chǎn)生了顯著地影響,剛接種后各組生物量增加緩慢,可能是由于剛轉(zhuǎn)入新環(huán)境,其代謝系統(tǒng)需要適應(yīng)新的環(huán)境,同時(shí)要合成酶、輔酶、其他代謝產(chǎn)物等,所以此時(shí)期生物量濃度增加較低。3 d后,各組開始表現(xiàn)出不同速率的生長(zhǎng),代謝、酶系逐漸變得活躍,在誘導(dǎo)培養(yǎng)的第15 d達(dá)到最大值。對(duì)照組最高生物量達(dá)到0.67 g/L,實(shí)驗(yàn)組的DA-6濃度從0.05 mmol/L增加到0.2 mmol/L,對(duì)應(yīng)的生物量最大值分別為0.46、0.52、0.56 g/L,相比之下,雖然在接種后生物量濃度均出現(xiàn)了增加但都低于對(duì)照組生物量。由此可見藻細(xì)胞在誘導(dǎo)階段,添加誘導(dǎo)劑DA-6對(duì)藻細(xì)胞的生長(zhǎng)并沒有起到積極作用。這種現(xiàn)象與之前文獻(xiàn)中發(fā)現(xiàn)低濃度2,4-D不能促進(jìn)藻細(xì)胞生長(zhǎng)相同[19]。這可能是由于DA-6對(duì)生長(zhǎng)的調(diào)節(jié)作用還依賴于藻種以及培養(yǎng)條件。

圖1 不同質(zhì)量濃度DA-6對(duì)雨生紅球藻生長(zhǎng)的影響Fig.1 Effect of DA-6 on biomass of H. pluvialis during induction days注：*：同一時(shí)間與對(duì)照組比較差異顯著(p<0.05)； **：同一時(shí)間與對(duì)照組比較差異極顯著(p<0.01)，圖2、圖4同。

2.2 DA-6對(duì)微藻含量的影響

從蝦青素積累結(jié)果來看(圖2),在誘導(dǎo)培養(yǎng)條件下,雨生紅球藻的細(xì)胞分裂雖然受到了抑制,但能加速蝦青素的積累并提高累積量。接種后3 d開始,各組蝦青素開始快速增加,藻細(xì)胞逐漸從綠色游動(dòng)細(xì)胞轉(zhuǎn)變?yōu)榧t色包囊細(xì)胞,但蝦青素積累的高峰時(shí)間卻不相同。對(duì)照組蝦青素含量在誘導(dǎo)培養(yǎng)階段持續(xù)增加,在9 d達(dá)到了最大值16.43 mg/g。實(shí)驗(yàn)組中,在0.1 mmol/L胺鮮酯處理下,蝦青素含量在13 d時(shí)達(dá)到了最大值24.94 mg/g,是對(duì)照組的1.52倍。11 d時(shí),與對(duì)照組相比,雖然0.05 mmol/L DA-6處理組蝦青素含量表現(xiàn)出了促進(jìn)作用(18.75 mg/g),但與0.1 mmol/L處理組最高值相比還是相對(duì)較低,沒有對(duì)蝦青素含量提高起到明顯的促進(jìn)作用。0.2 mmol/L DA-6處理組蝦青素含量一直處于較低水平,在11 d含量達(dá)到最大值16.47 mg/g,說明只有合適濃度的DA-6 才能促進(jìn)H.pluvialisLUGU蝦青素含量的增加。

圖2 不同質(zhì)量濃度DA-6對(duì)雨生紅球藻蝦青素含量的影響Fig.2 Effect of DA-6 on astaxanthin content of H. pluvialis during induction days

相對(duì)0.05、0.1 mmol/L處理組,0.2 mmol/L處理組雖然能增加生物量濃度,但卻不利于蝦青素含量的增加,此結(jié)論與添加不同濃度鹽誘導(dǎo)積累蝦青素結(jié)果相同[20],也沒有表現(xiàn)出良好的劑量效應(yīng)。推測(cè)可能是由于低劑量的誘導(dǎo)物未能激活蝦青素合成相關(guān)位點(diǎn)活性,相反,高劑量的誘導(dǎo)物則是抑制了蝦青素合成相關(guān)位點(diǎn)活性。隨后對(duì)0.1 mmol/L處理組培養(yǎng)基DA-6濃度進(jìn)行檢測(cè),結(jié)果如圖3所示,在微藻的培養(yǎng)過程中培養(yǎng)基中DA-6濃度隨培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)快速下降,經(jīng)15 d培養(yǎng)僅剩余0.05 mmol/L,因此推斷DA-6雖然沒有對(duì)H.pluvialisLUGU的生長(zhǎng)起到積極地作用,但蝦青素含量的增加可能與DA-6的消耗有關(guān)。可能是由于外源DA-6的添加只干擾了細(xì)胞的分裂,但并沒有影響H.pluvialis對(duì)碳源的同化能力[21]。

圖3 培養(yǎng)期間培養(yǎng)基DA-6濃度變化Fig.3 Changes of DA-6 concentration in the medium during induction days

2.3 DA-6對(duì)微藻活性氧的影響

2′,7′-二氯熒光黃雙乙酸鹽(DCFH-DA)是非標(biāo)記性的氧化敏感的熒光探針,本身不具有熒光,進(jìn)入細(xì)胞后被酯酶水解為二氯熒光黃(DCFH),在活性氧存在時(shí)DCFH被氧化為不能透過細(xì)胞膜的強(qiáng)綠色熒光物質(zhì)DCF,強(qiáng)度與細(xì)胞內(nèi)活性氧水平成正比[22]。因此可通過檢測(cè)DCF熒光強(qiáng)度反映細(xì)胞內(nèi)ROS變化。從圖2可以看出,0.1 mmol/L DA-6處理組在培養(yǎng)第13 d相比其他濃度DA-6處理組蝦青素最大含量要高,因此對(duì)0.1 mmol/L DA-6 處理組和對(duì)照組細(xì)胞內(nèi)ROS水平進(jìn)行檢測(cè),結(jié)果見圖4。從圖4中看出,對(duì)照組在接種后的1 d開始,細(xì)胞內(nèi)ROS水平開始增加,在3 d達(dá)到了最大值,然后開始逐漸降低,0.1 mmol/L DA-6處理組相比對(duì)照組,在誘導(dǎo)培養(yǎng)的1 d內(nèi)增加更劇烈,可能是由于DA-6的加入提高了碳、氧的代謝,使藻細(xì)胞提前進(jìn)入穩(wěn)定期,從而誘發(fā)了ROS的大量產(chǎn)生,隨即隨著培養(yǎng)時(shí)間增加蝦青素開始逐漸積累,并有效淬滅細(xì)胞體內(nèi)過多的ROS,使細(xì)胞內(nèi)ROS水平出現(xiàn)了降低,由圖2看出,此段時(shí)間蝦青素大量積累。由此推測(cè),ROS作為一種次級(jí)信號(hào)分子[23],可能是誘導(dǎo)條件下,其水平的快速增加激活了蝦青素合成相關(guān)元件的活性,從而促進(jìn)了蝦青素的積累,降低了細(xì)胞內(nèi)ROS水平,這與之前的研究,活性氧脅迫能夠促進(jìn)單細(xì)胞蝦青素含量的增加相同[24]。由此可見,適宜濃度的DA-6既可以產(chǎn)生活性氧脅迫促進(jìn)蝦青素的合成,又對(duì)細(xì)胞的傷害較小,細(xì)胞密度下降幅度小,因此其總蝦青素含量相對(duì)較高。

圖4 DA-6對(duì)雨生紅球藻細(xì)胞活性氧水平的影響Fig.4 Effect of DA-6 on ROS of H. pluvialis during induction days

2.4 DA-6對(duì)微藻葉綠素的影響

DA-6對(duì)微藻細(xì)胞葉綠素濃度的影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖5,可見在培養(yǎng)的前3 d,對(duì)照組和0.1 mmol/L DA-6處理組葉綠素濃度均出現(xiàn)了增加,并都在第3 d達(dá)到了峰值,接著隨著培養(yǎng)時(shí)間的延續(xù)緩慢地降低。雖然對(duì)照組和0.1 mmol/L DA-6 處理組在誘導(dǎo)培養(yǎng)的過程中都出現(xiàn)了增加與減少,但在此過程中0.1 mmol/L DA-6處理組葉綠素濃度基本都低于對(duì)照組,可能是由于ROS的增加影響了葉綠素的合成。這與之前研究,使用活性氧誘生劑增加蝦青素積累的結(jié)果,活性氧誘生劑處理可大幅降低葉綠素含量[25]相同。另一方面,對(duì)照組和0.1 mmol/L DA-6處理組分別在誘導(dǎo)培養(yǎng)的第5、7 d,葉綠素濃度出現(xiàn)了略微的增加。根據(jù)以上變化規(guī)律推斷:在活性氧產(chǎn)生的前期,細(xì)胞蝦青素合成相對(duì)滯后,不能及時(shí)清除氧自由基,活性氧的毒害作用損傷細(xì)胞,葉綠素濃度在ROS產(chǎn)生后開始降低。隨著蝦青素逐漸積累,活性氧對(duì)微藻細(xì)胞的毒害作用逐漸被抵消,從而葉綠素濃度不再急劇下降或略微增加。另外,蝦青素合成是利用細(xì)胞中已經(jīng)存在的無色前體或碳水化合物合成而來[21],蝦青素的大量合成消耗了細(xì)胞內(nèi)的無色前體或碳水化合物,從未降低細(xì)胞內(nèi)葉綠素含量。然而,這些推斷還需進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)證明。

圖5 DA-6對(duì)雨生紅球藻細(xì)胞葉綠素的影響Fig.5 Effect of DA-6 on chlorophyll of H. pluvialis during induction days

3 結(jié)論

適宜濃度的DA-6有利于促進(jìn)雨生紅球藻H.pluvialisLUGU細(xì)胞蝦青素含量的提高。添加濃度為0.1 mmol/L DA-6,微藻細(xì)胞蝦青素含量達(dá)到最大24.94 mg/g,是對(duì)照組的1.52倍;通過對(duì)細(xì)胞內(nèi)ROS、葉綠素分析,結(jié)果表明誘導(dǎo)條件下誘導(dǎo)培養(yǎng)前期細(xì)胞內(nèi)活性氧水平上升,可以作為信號(hào)分子激活H.pluvialisLUGU利用細(xì)胞內(nèi)的無色前體或碳水化合物合成蝦青素進(jìn)行防御。本文就DA-6與蝦青素合成的關(guān)系進(jìn)行了初步的分析,幫助人們了解植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑與蝦青素合成啟動(dòng)之間的聯(lián)系。

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EffectofdiethylaminoethylhexanoateonastaxanthincontentinHaematococcuspluvialisLUGU

DINGWei1,YUXu-ya1,PENGJun2,*

(1.Faculty of Life Sciences and Technology,Kunming University of Science and Technology,Kunming 650500,China; 2.Department of Thoracic Surgery,the First People’s Hospital of Yunnan Province,Kunming 650228,China)

It was studied the effects of different concentrations of DA-6 inHaematococcuspluvialisLUGU cultivation process on biomass,astaxanthin content,reactive oxygen species(ROS)level and chlorophyll concentration. The results demonstated that the 0.1 mmol/L DA-6 might slightly increase the biomass(0.52 g/L),but optimal for astaxanthin production with 24.94 mg/g,which was 1.52 times than that of the control(16.43 mg/g).Meanwhile,intracellular ROS level and chlorophyll concentration compared with the control group in the lower. The research showed that DA-6 induction could promote astaxanthin accumulation inHaematococcuspluvialisLUGU,which provided an effective strategy for the industrialization of astaxanthin.

diethyl aminoethyl hexanoate(DA-6);HaematococcuspluvialisLUGU;astaxanthin;reactive oxygen species(ROS);chlorophyll

2017-01-09

丁巍(1993-)，男，碩士研究生，研究方向：微藻資源開發(fā)，E-mail:dingweikmust@163.com。

*通訊作者:彭俊(1972-)，男，碩士，主任醫(yī)師，研究方向：胸外科診療，E-mail:389647518@qq.com。

云南省健康科技計(jì)劃項(xiàng)目(2014 NS227)。

TS201.2

:A

:1002-0306(2017)16-0150-05

10.13386/j.issn1002-0306.2017.16.028