,·,, , , ,*

(1.新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與藥學(xué)學(xué)院,新疆烏魯木齊 830052;2.新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品貯藏加工研究所,新疆烏魯木齊 830091)

外源NO對伽師瓜AOX基因克隆表達(dá)及抗氰呼吸的影響

敬媛媛1,阿塔吾拉·鐵木爾2,+,胡江偉2,魏佳2,張平2,吳斌2,*

(1.新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與藥學(xué)學(xué)院,新疆烏魯木齊 830052;2.新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品貯藏加工研究所,新疆烏魯木齊 830091)

為了探究外源一氧化氮(nitric oxide,NO)熏蒸處理對伽師瓜(CucumismeloL.)采后貯藏過程中AOX基因表達(dá)及抗氰呼吸途徑的影響,以伽師瓜為試材,采用外源60 μL/L NO熏蒸3 h,以不充入NO氣體作為對照,在(5±0.5) ℃條件下貯藏49 d。根據(jù)甜瓜基因組數(shù)據(jù)庫,通過EST設(shè)計引物,克隆獲得伽師瓜AOX基因全長序列。得到的基因片段同其他物種的AOX基因具有高度的同源性,命名為CmAOX。通過拼接獲得AOX基因的cDNA全長序列,基因cDNA全長為1300 bp,開放閱讀框架為1042 bp,擬編碼346個氨基酸,預(yù)測分子量為39606.6 Da,等電點為9.00。該基因已在GeneBank登錄,登錄號為:KM273124。通過熒光定量分析及抗氰呼吸速率的測定表明,經(jīng)60 μL/L NO處理果實的CmAOX的表達(dá)量和抗氰呼吸速率明顯高于對照果實。說明NO處理對伽師瓜采后貯藏過程中抗氰呼吸途徑的影響可能與其調(diào)控AOX基因的表達(dá)密切相關(guān)。

伽師瓜,一氧化氮,抗氰呼吸,克隆,基因表達(dá)

高等植物線粒體電子傳遞鏈[1]主要有兩條途徑,一條是對氰化物敏感的細(xì)胞色素途徑,另一條是抗氰呼吸途徑(或稱交替途徑),對氰化物不敏感,是由線粒體內(nèi)膜上的末端氧化酶AOX(交替氧化酶)所催化的。細(xì)胞色素呼吸途徑產(chǎn)生的能量同ATP的合成偶聯(lián),而抗氰呼吸途徑中電子由泛醌分支處直接傳遞給AOX,氧化生成水,不生成ATP,能量以熱的形式釋放[2]。在正常情況下植物以細(xì)胞色素呼吸途徑為主,在植物受到多種化學(xué)因子、低溫脅迫、傷誘導(dǎo)、病原體侵染和缺磷等環(huán)境或生理條件影響時,會誘導(dǎo)抗氰呼吸作用的增強(qiáng)[3]?？骨韬粑緩侥┒说慕惶嫜趸?AOX)在植物生長發(fā)育的各個生理過程及植物對環(huán)境的適應(yīng)過程中起到重要作用。AOX在果蔬中是由核基因編碼的雙核鐵羧基蛋白質(zhì)多基因家族,分為兩個亞家族,AOX1和AOX2,編碼蛋白分子質(zhì)量在32～39 kDa之間,一般都具有4個外顯子和3個內(nèi)含子,單子葉和雙子葉植物中都有AOX1家族,但AOX2家族僅存在于雙子葉植物[4]。AOX的表達(dá)受到多種生物和非生物脅迫所誘導(dǎo),關(guān)于AOX的生物學(xué)功能和抗氰呼吸途徑的關(guān)系一直是植物生理學(xué)領(lǐng)域中研究的熱門課題。

一氧化氮(nitric oxide,NO)是一種普遍存在于動植物體內(nèi)的信號分子,參與調(diào)控植物的生長發(fā)育、光合作用、呼吸作用等過程[5]。Zottini等[6]利用硝普鈉(SNP)作為NO供體處理胡蘿卜懸浮細(xì)胞的研究表明,SNP處理會引起細(xì)胞總呼吸速率的下降,這主要源于其對細(xì)胞色素呼吸途徑的抑制,而抗氰呼吸途徑不僅沒有下降,反而升高,并且AOX表達(dá)加強(qiáng)。湯紅官等[7]在NO對玉米幼苗根系呼吸作用的影響的研究中也發(fā)現(xiàn),NO能夠有效促進(jìn)玉米幼苗根系抗氰呼吸容量。目前,關(guān)于NO處理對伽師瓜采后AOX基因表達(dá)的影響與抗氰呼吸關(guān)系的研究未見報道。本研究以伽師瓜為試材,提取果肉總RNA,采用RT-PCR結(jié)合RACE技術(shù)擴(kuò)增AOX基因全長序列,進(jìn)一步探究NO處理對伽師瓜采后AOX基因表達(dá)和抗氰呼吸途徑的影響,從分子水平揭示以AOX為中心的抗氰呼吸調(diào)控網(wǎng)絡(luò)對于果實采后貯藏保鮮的研究具有十分重要的意義。

1 材料與方法

1.1材料與儀器

伽師瓜 采自庫車縣商品瓜基地,選擇個體一致,帶T型蔓的果柄、無機(jī)械損傷、無病蟲害的果實,外套發(fā)泡網(wǎng)裝箱,防止運輸過程中碰撞損傷,采后立即運回新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品貯藏與加工研究所;大腸桿菌 DH5α、克隆載體pMD18-T easy TakaRa公司;M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶、dNTPs、Taq酶、Olig(dT)18、DL2000 DNA Marker、質(zhì)粒提取試劑盒、膠回收試劑盒 TianGen公司;氯化鈉、乙二胺四乙酸、Tris、十二烷基硫酸鈉、焦碳酸二乙酯、瓊脂糖、酵母粉、胰蛋白胨、瓊脂粉 Sigma公司。

5417R型臺式低溫高速離心機(jī)、5331型PCR儀 德國Eppendorf公司;ES-315立式全自動高壓滅菌鍋 日本TOMY公司;DYY-11、DYY-2D電泳儀 北京六一儀器廠;FireReader系列紫外透射/凝膠成像系統(tǒng) 英國UVI 公司;IM-F124制冰機(jī) 日本SANYO公司。

1.2實驗方法

1.2.1 伽師瓜的處理方法 采用60 μL/L NO密封熏蒸伽師瓜3 h,以密封不充入NO氣體為對照,置于(5±0.5) ℃貯藏49 d。將果實直徑最大部位的果肉切成大小均勻的小塊,用液氮進(jìn)行速凍,置于超低溫冰箱中備用。

1.2.2 伽師瓜果實總RNA的提取 采用酚氯仿法[8]提取果實RNA。取1.5 g左右的樣品,在研缽中加液氮,快速研磨,置于2 mL 無RNA酶的離心管中,加入650 μL酚氯仿和650 μL RNA提取液,再加入200 μL預(yù)冷處理的無水乙醇,進(jìn)行旋渦振蕩10 s,4 ℃離心(12000 r/min,10 min),取上清液650 μL,加入650 μL 4 mol/L LiCl(4 ℃),放置于1.5 mL無RNA酶的尖頭離心管中,靜置于-80 ℃超低溫冰箱中沉淀3 h,4 ℃離心(12000 r/min,10 min),倒上清液,沉淀用70%乙醇清洗1～2次,置于-20 ℃冰箱中靜置,4 ℃離心(12000 r/min,10 min),倒上清液,沉淀用無水乙醇清洗,自然干燥后,加30 μL ddH2O,置于-80 ℃保存。用Eppendorf Biophotometer紫外分光光度計和1%瓊脂糖凝膠電泳檢測所提取RNA的純度和完整性。

1.2.3AOX基因片段的克隆 以總RNA為模板,采用一步法按照M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶標(biāo)準(zhǔn)體系合成cDNA第一鏈作為PCR模板,通過GenBank查找已登錄的植物AOX的氨基酸序列,用DNAstar軟件比對分析,根據(jù)相近種屬的保守區(qū)域設(shè)計簡并引物:AOX-F:5′-CACCTTAATGTGCGAGTC-3′;AOX-R:5′-CACCTTAATGTGCGAGTC-3′。PCR反應(yīng)程序為:94 ℃預(yù)變性3 min,1個循環(huán);94 ℃變性1 min、52 ℃退火45 s、72 ℃延伸60 s,32個循環(huán);72 ℃延伸10 min,1個循環(huán)。PCR產(chǎn)物用1.2%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測,并參照Tiangen DNA回收試劑盒說明書進(jìn)行回收純化送往上海生工生物技術(shù)有限公司測序。

1.2.4 伽師瓜果實AOXcDNA全長序列的克隆與分析 按照1.2.3片段測序結(jié)果設(shè)計目的基因的RACE特異性引物:GSP1:GATCACAGTGCAGGGAGTCTTT,GSP2:CATGACCATGATTGAGCTTGTG。按照TAKARA公司的RACE試劑盒進(jìn)行巢式PCR擴(kuò)增3′末端和5′末端,擴(kuò)增體系及擴(kuò)增條件均按照說明書進(jìn)行操作。巢式PCR產(chǎn)物經(jīng)檢測、純化回收后連接到pMD18-T載體,轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞中,在涂有IPTG/X-gal的含AMP的LB平板上、37 ℃倒置培養(yǎng)過夜,隨機(jī)挑取白色陽性克隆通過1.0%瓊脂糖電泳觀察鑒定菌落PCR結(jié)果,由上海生工生物技術(shù)有限公司測序。

利用DNAstar軟件對測序得到的AOX基因中間片段和3′末端、5′末端進(jìn)行拼接,然后提交 NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)進(jìn)行Blast X及Blast N分析。根據(jù)甜瓜基因組(https://melonomics.net)中篩選出AOX基因,利用Primer Premier 5.0軟件在讀碼框兩側(cè)設(shè)計引物,分別為:UP-P:TGGACAAT CCGAGAGTAAT；DN-P:TGCTAGTAAACTTATG AGGC。PCR擴(kuò)增,反應(yīng)體系同片段的擴(kuò)增,克隆得到包含完整ORF的全長序列;與PMD18-T 載體連接,轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5(,篩選陽性克隆保存菌液并送樣測序。利用DNAstar軟件ORF分析;BLAST(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST)進(jìn)行序列相似性分析;利用ClustalW(http://www.ebi.ac.uk/clustalw/index.html)、MEGA和DNAstar軟件進(jìn)行序列比對和進(jìn)化樹構(gòu)建。

1.2.5 實時熒光定量PCR分析 使用羅氏LightCycler? 96 SW 1.1進(jìn)行qRT-PCR檢測,反應(yīng)體系(25.0 μL)包括2.0 μL cDNA,9.5 μL dd H2O,上下游引物各0.5 μL(濃度為10 μmol·L-1)和12.5 μL Master(Roche)。qRT-PCR程序為:95 ℃ 3 min;95 ℃ 10 s,60 ℃ 30 s,72 ℃ 20 s,經(jīng)40個循環(huán)。每個樣品反復(fù)3次。以伽師瓜Actin基因(GenBank登錄號:FJ763186.1)作為內(nèi)參,設(shè)計內(nèi)參引物:上游引物序列(Forward):5′-CTGGTGTGATGGTTGGAATGG-3′,下游引物序列(Reverse):5′-GGTTGAGTGG TGCTTCAGTAAG-3′。參照獲得的AOX基因序列,按照qRT-PCR引物設(shè)計的原則設(shè)計特異性引物:AOX基因上游引物序列(Forward):5′-GCC TTCTTTGTGCTCTACTTGAT-3′,AOX基因下游引物序列(Reverse):3′-CCGAATGACTGTGATAACA TCCTT-5′。對上述特異性引物經(jīng)RT-PCR反應(yīng),得到PCR產(chǎn)物,測序后與目的基因比對,確定為目的基因上的片段。利用2-ΔΔCT法計算AOX基因的相對表達(dá)量。以采收后未處理的樣本為參照,將其AOX的表達(dá)量值轉(zhuǎn)化成1,其他各時間點樣品的基因表達(dá)量與其進(jìn)行比較,即獲得相對表達(dá)值。

1.2.6 伽師瓜果實抗氰呼吸速率的測定 參照徐飛[9]方法并稍作修改。取0.2 g 1 mm2的伽師瓜果肉小片,加入終濃度2 mL 1 mmol/L NaN3用OXYTHERM氧電極進(jìn)行AP途徑呼吸強(qiáng)度的測定。

2 結(jié)果與分析

2.1伽師瓜總RNA電泳圖

從果肉組織中提取高質(zhì)量RNA是進(jìn)行基因表達(dá)水平分析的首要步驟,而RNA質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)需從純度和完整性兩個方面判斷。如圖1所示,伽師瓜果實總RNA的條帶清晰,28S條帶的亮度是18S的兩倍,無明顯拖尾現(xiàn)象,表明RNA沒有降解;經(jīng)紫外分光光度計檢測,A260/A280分別為1.92、1.87、1.89、1.97,說明RNA的質(zhì)量和純度符合反轉(zhuǎn)錄和PCR的要求。

圖1 伽師瓜總RNA電泳圖Fig.1 Total RNA electrophoregram of Jiashi muskmelon注：1，2：對照組；3，4：NO處理組。

2.2 RT-PCR擴(kuò)增伽師瓜果實AOX基因片段

如圖2所示,以對照組和60 μL/L NO處理組伽師瓜果實總RNA反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為模版,用設(shè)計的特異性引物通過改變退火溫度擴(kuò)增中間片段,都擴(kuò)增得到308 bp的片段。

圖2 伽師瓜果實AOX基因的中間片段電泳圖Fig.2 Electrophoregram of AOX gene fragments of Jiashi muskmelon 注:M:Marker;1,2:對照組;3,4:NO處理組。

2.3伽師瓜果實AOX基因cDNA全長擴(kuò)增

如圖3所示,按照測序得到的伽師瓜果實AOX基因片段、3′末端、5′末端,最終獲得1300 bp全長序列,命名為CmAOX。用引物UP-P和DN-P,以伽師瓜果實總RNA反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為模版,擴(kuò)增得到包括完整ORF的全長序列(1300 bp)。對開放式閱讀框(ORF)進(jìn)行預(yù)測,發(fā)現(xiàn)其編碼一個1042 bp的完整開放閱讀框?；蜻M(jìn)行分析,擬編碼346個氨基酸,預(yù)測分子量為39606.6 Da,等電點9.00。穩(wěn)定參數(shù)為38.00,為穩(wěn)定蛋白。CmAOX蛋白富含丙氨酸(8.1%)、精氨酸(7.5%)、谷氨酰胺(7.8%)、亮氨酸(8.7%)、纈氨酸(8.1%)等,這可能是所有AOX蛋白都具有的特征。目前該基因已在GeneBank登錄,登錄號為:KM273124。

圖3 伽師瓜果實AOX基因全長電泳圖Fig.3 Electrophoregram of full-length AOX gene of Jiashi muskmelon注:M:Marker;1:NO處理組伽師瓜果實總RNA反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物。

2.4序列分析

圖4 伽師瓜果實AOX基因氨基酸序列比對Fig.4 Alignment of AOX gene amino acid sequence in Jiashi muskmelon注：陰影部分為相同堿基。

2.4.1CmAOX基因的氨基酸序列比對分析 如圖4所示,用DNAMAN將伽師瓜交替氧化酶CmAOX基因編碼的氨基酸序列與其他物種AOX2基因的氨基酸序列進(jìn)行同源性比較。結(jié)果發(fā)現(xiàn)伽師瓜CmAOX基因所推導(dǎo)的氨基酸序列同黃瓜AOX2(Cucumis sativus,AAP33163.2),西瓜AOX2(Citrullus lanatus,AEN99850.1),大豆AOX2基因(Glycine max,AAP68984.1),擬南芥AOX2基因(Arabidopsis thaliana,BAB09852.1),葡萄AOX2基因(Vitis vinifera,NP_001268001.1)均達(dá)到70%以上的同源性。AOX編碼的核苷酸序列與其他物種的核苷酸序列在GenBank中BLASTn同源比對發(fā)現(xiàn),CmAOX和很多核糖核苷酸序列高度同源,如和西瓜AOX2(91%)、黃瓜AOX2(98%)、西葫蘆AOX(89%)、煙草AOX2(79%)以及歐李(78%)等。盡管AOX蛋白序列的組成和大小各異,但是結(jié)果表明在氨基酸序列中存在高等植物AOX蛋白質(zhì)的主要功能域,分別是:保守的鐵離子結(jié)合區(qū)域(EXXH,FXHR 和 EEE-Y);可能同二硫鍵的聚合相關(guān)的絲氨酸殘基(C126和C176);可能參與金屬離子結(jié)合的組氨酸殘基(H144,H197,H224,H265,H326和H331),這些結(jié)構(gòu)特點可能與其功能特性有一定聯(lián)系。這些結(jié)果表明CmAOX屬于伽師瓜的AOX基因家族。

圖5 伽師瓜果實AOX基因與其它果實氨基酸序列同源性進(jìn)化分析Fig.5 Phylogenetic tree analysis of the deduced amino acid sequences homolog of Jiashi muskmelon AOX gene with related fruit species

2.4.2 伽師瓜交替氧化酶基因CmAOX的進(jìn)化樹分析 如圖5所示,用MEGA軟件將甜瓜CmAOX基因推導(dǎo)的氨基酸序列與西瓜、黃瓜、擬南芥等27個物種在GenBank數(shù)據(jù)庫中登錄的具有完整編碼區(qū)的AOX氨基酸序列進(jìn)行比對分析,構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。研究發(fā)現(xiàn)本文的甜瓜交替氧化酶基因CDS區(qū)與同為葫蘆科的黃瓜AOX2基因同源性高達(dá)99%。與西瓜AOX2基因同源性達(dá)85%,與小麥、水稻、胡蘿卜等同源性都大于60%以上,由此可以推斷出AOX基因在不同物種中有較強(qiáng)的保守性。通過進(jìn)化樹也可以看到AOX2基因與葫蘆科的黃瓜聚為一類,由此推斷已成功克隆出伽師瓜交替氧化酶基因家族中的AOX基因。

2.4.3 CmAOX蛋白的三維結(jié)構(gòu)預(yù)測 用SWISS-MODEL能夠預(yù)測CmAOX蛋白的3D結(jié)構(gòu)。CmAOX的3D結(jié)構(gòu)是基于動物源AOX2蛋白晶體結(jié)構(gòu)對CmAOX蛋白的結(jié)構(gòu)域的3D結(jié)構(gòu)進(jìn)行同源建模預(yù)測(圖6A),同時也預(yù)測了擬南芥AOX2蛋白(AAY7882.1)的3D結(jié)構(gòu)(圖6B),CmAOX和AtAOX2的3D結(jié)構(gòu)相似度為42.92%,顯示了該蛋白與AtAOX2的結(jié)構(gòu)不同但是含有相同的保守區(qū)域。

圖6 CmAOX(A)和AtAOX2(B)蛋白的三維結(jié)構(gòu)預(yù)測Fig.6 Three dimensional structure prediction of CmAOX protein(A)and AtAOX2 protein(B)

2.5 NO處理對伽師瓜果實AOX基因表達(dá)的影響

伽師瓜在5 ℃貯藏條件下CmAOX基因的表達(dá)如圖7所示,對照果實和60 μL/L NO處理果實的CmAOX表現(xiàn)出先上升后下降的表達(dá)模式,60 μL/L NO處理可明顯促進(jìn)CmAOX的表達(dá),并且NO處理果實的CmAOX表達(dá)量最大值比對照果實提前7 d出現(xiàn)。在貯藏第28 d,經(jīng)60 μL/L NO處理果實的CmAOX表達(dá)量為對照果實的4.73倍(p<0.01)。說明NO處理能夠誘導(dǎo)果實AOX基因的上調(diào)表達(dá)。

圖7 NO處理對伽師瓜果實AOX基因表達(dá)的影響Fig.7 Effects of NO treatment on the expression of AOX gene in Jiashi muskmelon

圖8 NO處理對伽師瓜果實抗氰呼吸速率的影響Fig.8 Effects of NO treatment on the cyanide resistant respiration rate in Jiashi muskmelon

2.6 NO處理對伽師瓜果實抗氰呼吸速率的影響

如圖8所示,伽師瓜在5 ℃貯藏條件下抗氰呼吸速率呈先上升后下降的趨勢,這與果實CmAOX的表達(dá)模式相同,在整個貯藏期間,60 μL/L NO處理果實的抗氰呼吸速率明顯高于對照果實。在貯藏第14 d,伽師瓜果實的抗氰呼吸速率達(dá)到最大值,經(jīng)60 μL/L NO處理果實的抗氰呼吸速率比對照果實高了36.4%(p<0.01)。說明NO處理能夠誘導(dǎo)果實抗氰呼吸速率的增加。

3 討論

核基因編碼的AOX基因是存在于植物線粒體中交替氧化酶基因家族中的重要基因,關(guān)于AOX基因克隆表達(dá)的研究越來越多。目前,已成功地從擬南芥、水稻、煙草、番茄、大豆、紅掌、西瓜、葡萄中分離得到交替氧化酶基因的cDNA[10]。本研究從伽師瓜中分離得到了伽師瓜交替氧化酶基因的cDNA全長序列,命名為CmAOX(GenBank登錄號:KM273124),伽師瓜的交替氧化酶基因CDS區(qū)序列與同為葫蘆科的黃瓜AOX2基因(黃瓜,AAP33163)表現(xiàn)出最高的同源性,可達(dá)99%。將CmAOX基因的氨基酸序列與其他物種進(jìn)行同源性分析發(fā)現(xiàn),不同物種的AOX2存在許多完全相同的功能位點,這些位點在AOX1中同樣存在,且也是完全保守的。這表明AOX氨基酸序列主要差異是在N端的104個氨基酸序列,而在C端的氨基酸序列卻很保守,不同物種AOX基因?qū)Φ孜锏倪x擇性和功能的不同有可能都是由N端非保守的氨基酸序列決定的[11]。將來自不同物種的交替氧化酶基因進(jìn)行對比構(gòu)建樹狀圖,通過進(jìn)化樹分析發(fā)現(xiàn)AOX在不同物種中具有較強(qiáng)的保守性,這與李嚴(yán)曼等[12]在西瓜交替氧化酶AOX2基因的克隆與分析的研究結(jié)果一致。對CmAOX和AtAOX2蛋白的三維結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測,發(fā)現(xiàn)CmAOX和AtAOX2蛋白有著相同的保守區(qū)域,說明不同物種AOX基因的保守區(qū)域可能相同。

眾多研究發(fā)現(xiàn),AOX基因能夠響應(yīng)許多環(huán)境脅迫和外源信號分子,在多種逆境和生長發(fā)育中AOX的mRNA、蛋白質(zhì)都和抗氰呼吸的變化有著十分緊密的聯(lián)系[13]。Li等[14]在關(guān)于水稻的研究中發(fā)現(xiàn),過表達(dá)OsAOX1a基因可以提高水稻的耐冷性。Clifton[15]和Saisho等[16]研究了擬南芥中AOX的5個基因(AOX1a,AOX1b,AOX1c,AOX1d和AOX2),發(fā)現(xiàn)它在不同途徑的誘導(dǎo)表達(dá)水平存在著差異,也具有組織特異性。馮漢青等[17]研究發(fā)現(xiàn)水稻葉片中編碼交替氧化酶AOX基因在不同的壞境和化學(xué)試劑處理下有著不同的表達(dá)特性。王健[18]利用Northern雜交分析研究發(fā)現(xiàn)大豆AOX1a基因在防御反應(yīng)中起一定的作用,可以被水楊酸、H2O2、檸檬酸鹽強(qiáng)烈誘導(dǎo)表達(dá),但被CoCl2抑制表達(dá)。Belozerova等[19]水楊酸對黃羽扇豆呼吸途徑的影響的研究中,表明水楊酸能夠誘導(dǎo)黃羽扇豆AOX基因的表達(dá)。本實驗結(jié)果也表明,經(jīng)NO處理的伽師瓜果實CmAOX基因的相對表達(dá)量和抗氰呼吸速率都明顯高于對照果實,并且有著相同的變化趨勢。前期研究也表明,60 μL/L NO處理能夠提高果實的抗氧化能力,抑制果實的呼吸速率和乙烯釋放量,抑制可溶性固形物、可滴定酸含量的下降,較好地保持果實的硬度[20]。因此推測NO可能作為信號分子是調(diào)控果實抗氰呼吸的關(guān)鍵因子,其具體的調(diào)控機(jī)制可能與AOX基因的表達(dá)有著緊密聯(lián)系,并且可能通過調(diào)控果實的呼吸作用增強(qiáng)果實對逆境的抵抗能力,從而提高果實的貯藏品質(zhì)。但關(guān)于NO誘導(dǎo)果實抗氰呼吸增強(qiáng)的具體作用元件及調(diào)控機(jī)制還有待于進(jìn)一步研究。

4 結(jié)論

以伽師瓜果實總RNA反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為模板,克隆得到1個AOX基因片段(1300 bp),命名為CmAOX(GenBank登錄號:KM273124)。推導(dǎo)的氨基酸序列與黃瓜AOX2基因同源性高達(dá)99%,可將其歸為交替氧化酶基因家族中的AOX2基因。同其他物種的比對分析發(fā)現(xiàn),AOX2基因在不同的物種中具有較強(qiáng)的保守性。

經(jīng)60 μL/L NO處理果實的CmAOX基因相對表達(dá)量和抗氰呼吸速率明顯高于對照果實,說明NO處理能夠誘導(dǎo)伽師瓜貯藏過程中抗氰呼吸速率的增加及AOX基因上調(diào)表達(dá)。這表明NO處理對伽師瓜采后貯藏過程中抗氰呼吸途徑的影響可能與其調(diào)控AOX基因的表達(dá)密切相關(guān)。

[1]徐婷,李華,魯姍姍,等. 線粒體電子傳遞呼吸鏈及其生物學(xué)意義的研究進(jìn)展[J]. 復(fù)旦學(xué)報:醫(yī)學(xué)版,2015,42(2):250-255.

[2]馮漢青,管東東,焦青松,等. 光照下菜豆葉片抗氰呼吸與光合作用關(guān)系的分析[J]. 植物生態(tài)學(xué)報,2015,39(1):104-109.

[3]Jian W,Zhang D W,Zhu F,et al. Nitrate reductase-dependent nitric oxide production is required for regulation alternative oxidase pathway involved in the resistance to Cucumber mosaic virus infection in Arabidopsis[J]. Plant Growth Regulation,2015,77(1):99-107.

[4]郭芹,李慶鵬,靳婧,等. 交替氧化酶在果蔬抗氰呼吸途徑的調(diào)控機(jī)制[J]. 生物技術(shù)進(jìn)展,2013(6):412-415.

[5]FORESI N,MAYTA M L,LODEYRO A F,et al. Expression of the tetrahydrofolate-dependent nitric oxide synthase from the green alga Ostreococcus tauri increases tolerance to abiotic stresses and influences stomatal development in Arabidopsis[J]. Plant Journal,2015,82(5):806-821.

[6]ZOTTINI M,FORMENTIN E,SCATTOLIN M,et al. Nitric oxide affects plant mitochondrial functionalityinvivo[J].FEBS Letters,2002,515:75-78.

[7]湯紅官,張滿效,何元慶. UV-B和NO對玉米幼苗根系呼吸作用的影響[J]. 蘭州大學(xué)學(xué)報:自然科學(xué)版,2010,46(2):51-55，65.

[8]SAH S K,KAUR G,KAUR A. Rapid and reliable method of high-quality RNA extraction from diverse plants[J]. American Journal of Plant Sciences,2014,5(21):3129-3139.

[9]徐飛. 交替氧化酶在果實成熟、種子萌發(fā)和植物抗逆反應(yīng)中的作用研究[D]. 成都:四川大學(xué),2012.

[10]劉慧春,田丹青,劉建新,等. 紅掌交替氧化酶基因克隆及其在低溫脅迫下的表達(dá)分析[J]. 核農(nóng)學(xué)報,2013,27(10):1464-1472.

[11]NOGALES A,NOCEDA C,RAGONEZI C,et al. Functional marker development from AOX genes requires deep phenotyping and individualized diagnosis[M]. Alternative respiratory pathways in higher plants,2015:273-280.

[12]李嚴(yán)曼,朱磊,楊景華,等. 西瓜交替氧化酶AOX2基因的克隆與分析[J]. 果樹學(xué)報,2011(5):909-914.

[13]馮漢青,王婉,王玉佩,等. ZnCl2脅迫下抗氰呼吸對煙草細(xì)胞活力和過氧化氫水平的影響[J]. 陜西師范大學(xué)學(xué)報:自然科學(xué)版,2015,43(1):70-74.

[14]LI C R,LIANG D D,XU R F,et al. Overexpression of an alternative oxidase gene,OsAOX1a,improves cold tolerance inOryzasativaL.[J]. Genetics & Molecular Research,2013,12(4):5424-5432.

[15]CLIFTON R,LISTER R,PARKER K L,et al. Stress-induced co-expression of alternative respiratory chain components inArabidopsisthaliana[J]. Plant Molecular Biology,2006,58:193-212.

[16]SAISHO D,NAMBARA E,NAITO S,et al. Characterization of the gene family for alternative oxidase fromArabidopsisthaliana[J]. Plant Molecular Biology,1997,35:585-596.

[17]馮漢青,湯淑珍,李淮. 不同光強(qiáng)下交替氧化酶基因修飾的兩種擬南芥葉片葉綠素?zé)晒馓匦缘淖兓痆J]. 廣西植物,2013,33(5):679-684.

[18]王健. 心葉煙交替氧化酶基因NgAOX1的分離及其表達(dá)特性分析[D]. 泰安:山東農(nóng)業(yè)大學(xué),2009.

[19]BELOZEROVA N S,BAIK A S,BUTSANETS P A,et al. Effect of salicylic acid on the alternative pathway of yellow lupine respiration[J]. Russian Journal of Plant Physiology,2014,1(61):38-46.

[20]胡江偉,周江,朱璇,等. 一氧化氮對新疆伽師瓜果實采后貯藏品質(zhì)的影響[J]. 食品工業(yè)科技,2015,36(13):352-356.

EffectofexogenousnitricoxideoncloningandexpressionofAOXgeneandcyanideresistantrespirationinJiashimuskmelon

JINGYuan-yuan1,Atawulla·Tiemu2,+,HUJiang-wei2,WEIJia2,ZHANGPing2,WUBin2,*

(1.College of Food Science and Pharmaceutical Science,Xinjiang Agricultural University,Urumqi 830052,China; 2.Institute of Agro-products Storage and Processing,Xinjiang Academy of Agricultural Science,Urumqi 830091,China)

The effects of exogenous nitric oxide fumigation on the expression ofAOXgene and the cyanide resistant respiratory pathway in Jiashi muskmelon during the storage were investigated. Jiashi muskmelon(CucumismeloL.)as test materials were fumigated with 60 μL/L NO for 3 hours in sealed boxes,not filled with NO gas as control,and then stored at(5±0.5) ℃ for 49 days. According to the muskmelon genome database,primers were designed by EST,and the full length sequence of Jiashi muskmelonAOXgene was cloned. The cDNA fragment exhibited high homology to the alternative oxidase of other species and could be referred to asCmAOX. The full-length cDNA sequence ofAOXgene was obtained by splicing. The full length cDNA ofCmAOXwas 1300 bp in size with a 1042 bp open reading frame(ORF),and 346 amino acids was encoded. The predicted molecular weight ofCmAOXwas 39606.6 Da,and the isoelectric point was 9.00. The accession number ofCmAOXin GenBank database was KM273124. The cyanide resistant respiration rate of Jiashi muskmelon with the treatment of 60 μL/L NO was found to be significantly higher than that of the control. Real-time PCR showed that the expression ofCmAOXwith the NO treatment of Jiashi muskmelon was significantly higher than that of control muskmelons during the whole storage period. The NO treatment could induce the up regulation ofAOXgene in Jiashi muskmelon during the storage. It was suggested that the effect of NO treatment on the expression ofAOXgene of Jiashi muskmelon may be closely related to cyanide resistant respiration regulation during the storage.

Jiashi muskmelon;nitric oxide;cyanide resistant respiration;clone;expression

2017-01-10 +并列第一作者

敬媛媛(1992-)，女，碩士，研究方向：果蔬貯藏保鮮，E-mail：785738415@qq.com。 阿塔吾拉·鐵木爾(1988-)，男，碩士，研究方向：農(nóng)產(chǎn)品貯藏與加工，E-mail：1774721748@qq.com。

*通訊作者:吳斌(1973-)，男，博士，研究員，研究方向：農(nóng)產(chǎn)品貯藏與加工，E-mail：42042615@qq.com。

國家自然科學(xué)基金(31660478)。

TS255.3

:A

:1002-0306(2017)16-0296-07

10.13386/j.issn1002-0306.2017.16.056