, ,曲娟,2,,,,2,3,*, ,3,,3，，3

(1.九江學(xué)院藥學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院,江西九江 332000;2.江蘇大學(xué)食品與生物工程學(xué)院,江蘇省農(nóng)產(chǎn)品物理加工重點實驗室,江蘇鎮(zhèn)江 212013; 3.九江安德和生物科技有限公司,江西九江 332000)

恒溫超聲輔助提取丁香總多酚工藝優(yōu)化及其對低密度脂蛋白氧化修飾過程中熒光的抑制

熊一凡1,李文1,曲文娟1,2,劉龍秀1,張小霞1,江慎華1,2,3,*,郝澍1,3,張良慧1,3，謝麗琴1，3

(1.九江學(xué)院藥學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院,江西九江 332000;2.江蘇大學(xué)食品與生物工程學(xué)院,江蘇省農(nóng)產(chǎn)品物理加工重點實驗室,江蘇鎮(zhèn)江 212013; 3.九江安德和生物科技有限公司,江西九江 332000)

低密度脂蛋白(LDL)氧化是引起動脈粥樣硬化(AS)的一個主要原因,為了探索恒溫超聲輔助技術(shù)對丁香總多酚的提取效果,及對LDL氧化修飾過程中熒光的抑制,本文采用該技術(shù)首先對丁香總多酚提取工藝進(jìn)行了優(yōu)化,進(jìn)而分析其對LDL氧化修飾過程中熒光的抑制效果。結(jié)果表明,恒溫超聲輔助提取丁香總多酚最佳工藝條件為:超聲功率270 W、超聲頻率80 kHz、超聲時間30 min、超聲溫度50 ℃、料液比1∶30、乙醇濃度60%,此條件下所提取的總多酚含量為(0.301±0.0043) g/g。通過最優(yōu)工藝得到的丁香總多酚提取物能有效抑制LDL氧化修飾過程中Trp淬滅、總熒光產(chǎn)物及脂褐素的產(chǎn)生,且抑制效果與濃度成正比,呈現(xiàn)出良好的量效關(guān)系。該研究為后續(xù)將丁香總多酚研發(fā)成抑制LDL氧化功能食品提供依據(jù)。

丁香,總多酚,恒溫超聲提取,低密度脂蛋白,總熒光

血液中的低密度脂蛋白(low density lipoprotein,LDL)主要功能是將膽固醇運(yùn)送到外圍組織[1]。LDL是直徑18～25 nm[2]、密度1.019～1.063 g/mL的球形顆粒[3],平均分子量250萬。LDL由膽固醇酯(29%)、磷脂(28%)、蛋白(21%)、游離膽固醇(11%)及甘油三酯(9%)組成。LDL由脂性核心與外圍蛋白質(zhì)apoB-100(由4536個氨基酸殘基組成,分子量約500 kDa)組成[4-5]。

LDL富含多不飽和脂肪酸[6],在氧化應(yīng)激條件下很容易被氧化修飾形成氧化修飾低密度脂蛋白(oxidized modified low-density lipoprotein,Ox-LDL)[7]。Ox-LDL通過各種生物通路促使動脈粥樣硬化(atherosclerosis,AS)的產(chǎn)生和發(fā)展[8]。許多天然產(chǎn)物能有效緩解AS等慢性疾病[9]。因此,從相關(guān)天然產(chǎn)物中提取出對LDL氧化具有抑制效果的有效成分具有重要意義。

丁香為桃金娘科植物丁香(EugeniacaryophyllataThunb.)的干燥花蕾,屬國家公布的藥食兩用植物,在我國南方地區(qū)(如海南、廣東、廣西、云南等地)廣泛種植[6]。丁香花蕾色澤深褐色,氣味濃郁,微澀[10],主要成分為多酚、黃酮類化合物及精油等[11],可用于治療炎癥、肝損傷、癌癥、糖尿病和其他氧化應(yīng)激引起的疾病等[10]。有研究證明,丁香具有很強(qiáng)的抗氧化活性[12],總多酚為其抗氧化活性的主要物質(zhì)[9]。實驗室前期研究結(jié)果也表明,丁香在國家公布的87種藥食兩用物品名單中總多酚含量最高[13]，丁香總多酚具有很強(qiáng)的抗氧化作用[14]。盡管丁香中總多酚含量非常高[13]、其抗氧化能力很強(qiáng)[14],但是,丁香總多酚對LDL氧化修飾抑制效果,目前國內(nèi)外尚不明確。

國內(nèi)外很多學(xué)者采用超聲方法對植物總多酚提取進(jìn)行了相關(guān)研究。樊燕鴿等采取數(shù)控超聲萃取懷菊水溶性總多酚[15];Biesaga等[16]采用超聲提取蜂蜜中總多酚。盡管以上學(xué)者采用超聲輔助提取各類天然產(chǎn)物總多酚獲得了較好的效果,但是,在這些超聲輔助提取總多酚過程中,溶液溫度無法保持穩(wěn)定,溫度升高及超聲輔助對高效提取的貢獻(xiàn)無法明確,頻率對提取效果的影響也無法確定。實驗室前期研究發(fā)現(xiàn)采用恒溫超聲輔助提取訶子抗氧化活性物質(zhì)時很好地解決了這一問題[17]。但是,采用恒溫超聲技術(shù)提取丁香總多酚,在國內(nèi)外尚未見相關(guān)報道。因此,本文采用三頻恒溫超聲波提取技術(shù)對丁香總多酚提取工藝進(jìn)行了優(yōu)化,并對提取所得丁香總多酚抑制LDL氧化過程熒光的抑制效果進(jìn)行了相關(guān)研究,為后續(xù)將丁香研發(fā)成抑制LDL氧化功能食品提供依據(jù)。

1 方法與材料

1.1材料與儀器

丁香 江西樟樹天齊堂中藥飲片有限公司,產(chǎn)地廣西,生產(chǎn)批號1511008,生產(chǎn)日期2015年11月20日,過60目篩后置冰箱中備用;LDL 自健康人血漿中分離得到[17-18],以牛血清白蛋白(Albumin from Bovine Serum,BSA)為標(biāo)準(zhǔn)品,采用Lowry’s方法測定LDL中蛋白濃度[19],以該蛋白濃度表示LDL濃度;肝素鈉 購自上海阿拉丁生化科技股份有限公司;其他化學(xué)試劑 均采用優(yōu)級純或分析純;沉淀劑 0.064 mol/L檸檬酸鈉溶液(肝素鈉濃度為50000 U/L),用5 mol/L鹽酸,調(diào)節(jié)pH至5.04;洗滌液 0.064 mol/L檸檬酸鈉溶液,用5 mol/L鹽酸,調(diào)節(jié)pH至5.11;高鹽磷酸鹽緩沖溶液(pH4.5 PBS) 160 g/L NaCl、2.7 mmol/L KCl、8.1 mmol/L Na2HPO4、1.5 mmol/L KH2PO4。

KQ-300G VDV型三頻恒溫數(shù)控超聲波清洗器 昆山市超聲儀器有限公司;LS-55熒光磷光分光光度計 美國Perkin Elmer公司;CT15RT型高速冷凍離心機(jī) 上海天美生化儀器設(shè)備工程有限公司;101-1AB型電熱鼓風(fēng)干燥箱 天津市泰斯特儀器有限公司;LJL10冷凍干燥機(jī) 鞏義市予華儀器有限公司;DFY-300搖擺式高速萬能粉碎機(jī) 溫嶺市林大機(jī)械有限公司;PB-10 pH計 Sartorius儀器設(shè)備有限公司;XW-80A漩渦混合器 上海青浦滬西儀器廠。

1.2實驗方法

1.2.1 恒溫超聲輔助提取總多酚 參照文獻(xiàn)[20]的方法,略做修改,具體步驟如下:稱取5.00 g丁香粉于150 mL錐形瓶中，按下列各單因素實驗進(jìn)行恒溫超聲提取,每次提取后采用4800 r/min離心分離提取液,共提取三次,合并上清液定容成300 mL統(tǒng)一體積,稀釋200倍后測定總多酚含量。

1.2.2 恒溫超聲輔助提取丁香總多酚單因素實驗

1.2.2.1 恒溫超聲提取時間單因素實驗 選定超聲時間10、20、30、40、50、60 min,固定其他參數(shù):超聲功率240 W、超聲頻率45 kHz、料液比1∶20、超聲溫度60 ℃、乙醇濃度60%,進(jìn)行超聲時間單因素實驗。

1.2.2.2 恒溫超聲提取溫度單因素實驗 選定超聲溫度30、40、50、60、70、80 ℃,固定其他參數(shù):超聲功率240 W、超聲頻率45 kHz、料液比1∶20、超聲時間30 min、乙醇濃度60%,進(jìn)行超聲溫度單因素實驗。

1.2.2.3 恒溫超聲提取頻率單因素實驗 選定設(shè)備固有的三個超聲頻率45、80、100 kHz,固定其他參數(shù):超聲功率240 W、料液比1∶20、超聲時間30 min、超聲溫度60 ℃、乙醇濃度60%,進(jìn)行超聲頻率的單因素實驗。

1.2.2.4 恒溫超聲提取功率單因素實驗 選定超聲功率150、180、210、240、270、300 W,固定其他參數(shù):超聲頻率45 kHz、料液比1∶20、超聲時間30 min、超聲溫度60 ℃、乙醇濃度60%,進(jìn)行超聲功率的單因素實驗。

1.2.2.5 恒溫超聲提取料液比單因素實驗 選定超聲料液比1∶15、1∶20、1∶25、1∶30、1∶35、1∶40,固定其他參數(shù):超聲功率240 W、超聲頻率45 kHz、超聲時間30 min、超聲溫度60 ℃、乙醇濃度60%,進(jìn)行超聲料液比的單因素實驗。

1.2.2.6 恒溫超聲提取乙醇濃度單因素實驗 選定超聲乙醇濃度30%、40%、50%、60%、70%、80%,固定其他參數(shù):超聲功率240 W、超聲頻率45 kHz、料液比1∶20、超聲時間30 min、超聲溫度60 ℃、乙醇濃度60%,進(jìn)行超聲乙醇濃度的單因素實驗。

1.2.3 恒溫超聲輔助提取丁香總多酚正交實驗 以單因素實驗結(jié)果為基礎(chǔ),設(shè)計四因素三水平正交實驗,其因素水平如表1所示,以總多酚含量衡量提取效率。

表1 恒溫超聲輔助提取丁香總多酚正交實驗因素水平Table 1 Orthogonal experiments of UAECT for extracting polyphenols from clove

1.2.4 總多酚含量的測定 參照文獻(xiàn)[21]的方法測定總多酚的含量,具體步驟如下:將標(biāo)準(zhǔn)品沒食子酸配制成質(zhì)量濃度分別為0、3.125、6.25、12.5、25、50、100、150 μg/mL 8個樣液;再將Folin試劑原液取出一定體積用蒸餾水稀釋10倍;取該稀釋液2.25 mL加入到0.5 mL樣液中,然后加2.25 mL 6%碳酸鈉溶液,振蕩均勻,在35 ℃水浴靜置90 min后在765 nm讀數(shù),得到標(biāo)準(zhǔn)曲線方程:

Y=0.0124X-0.015(R2=0.9988)

式中,Y-765 nm處OD值,X-總多酚質(zhì)量濃度,μg/mL。

丁香總多酚含量計算公式為:

式中,Y-丁香總多酚提取含量,g/g;ρ-總多酚質(zhì)量濃度,g/mL;n-稀釋倍數(shù);v-提取液最后定容體積,mL;g-提取前丁香粉質(zhì)量,g。

1.2.5 不同濃度的丁香提取物對LDL的熒光強(qiáng)度影響

1.2.5.1 LDL氧化修飾孵育 LDL氧化修飾孵育分為以下幾組:

實驗組:取4.9 mL LDL溶液(500 μg/mL)加50 μL CuSO4(1.25 μmol/L),加50 μL不同濃度(經(jīng)預(yù)實驗確定量效關(guān)系明確的三個濃度:0.5、1.0、1.5 μg/mL)提取物溶液,37 ℃恒溫孵育48 h。

空白組:等體積甲醇溶液代替提取物溶液,等體積去離子水代替氧化劑CuSO4·5H2O,其它操作均與實驗組相同。

促氧組:等體積甲醇溶液代替提取物溶液,其它操作均與實驗組相同。

陽性對照組:添加等體積2,6-二叔丁基對甲酚(2,6-Di-tert-butyl-4-methylphenol,BHT)代替提取物溶液(BHT濃度與提取物濃度相對應(yīng)),其它操作均與實驗組相同。

本文LDL及各種試劑均以起始濃度計。

1.2.5.2 丁香提取物對LDL氧化時的色氨酸(Trp)熒光淬滅的影響 采用Chen等[22]方法,略作修改。按1.2.5.1方法孵育反應(yīng)體系,在Ex295/Em330處測定熒光強(qiáng)度。

1.2.5.3 丁香提取物對LDL氧化修飾產(chǎn)生的熒光產(chǎn)物的熒光定量測定 采用Yang等[21]方法,略作修改。按1.2.5.1方法孵育反應(yīng)體系,在Ex360/Em430處測定熒光強(qiáng)度。

1.2.5.4 丁香提取物對LDL氧化修飾產(chǎn)生的脂褐素的熒光定量測定 采用劉穎琳等[23]方法,略作修改。按1.2.5.1方法孵育反應(yīng)體系,在Ex350/Em460處測定脂褐素?zé)晒鈴?qiáng)度。

1.2.6 三維熒光等高線光譜解析提取物抑制LDL氧化過程中熒光變化的量效關(guān)系 參照Ernst Koller[24]與Larry[25]等方法,略作修改。按照1.2.5.1方法孵育反應(yīng)體系,采用石英比色皿設(shè)定Ex(200～420 nm)、Em(260～500 nm)、狹縫寬度均為4 nm及光譜間隔10 nm進(jìn)行三維熒光掃描,以獲得三維等高線光譜來反應(yīng)丁香提取物抑制LDL氧化過程中熒光變化的量效關(guān)系。

1.3數(shù)據(jù)處理

采用DPS 7.05數(shù)據(jù)處理軟件分析結(jié)果。

2 結(jié)果與分析

2.1恒溫超聲輔助提取丁香總多酚單因素實驗

2.1.1 恒溫超聲提取時間的影響 由圖1可以看出,恒溫超聲輔助提取10～40 min范圍內(nèi),提取的丁香總多酚含量隨著超聲時間延長而升高,當(dāng)超聲時間為40 min時丁香總多酚含量達(dá)到最大值。此后,隨超聲時間延長,丁香提取液總多酚含量隨之降低?？赡艿脑蚴?在40 min之前丁香粉末內(nèi)總多酚被有機(jī)溶劑大量提取出來,所以隨著時間延長而增多。40 min后,提取物發(fā)生氧化等反應(yīng),造成含量降低[26]。選定提取時間30、40、50 min做后續(xù)正交實驗。

圖1 恒溫超聲輔助提取時間單因素實驗Fig.1 Results of extraction time experiment by UAECT

2.1.2 恒溫超聲提取溫度單因素實驗 溫度單因素實驗結(jié)果見圖2所示。當(dāng)溫度在30～60 ℃范圍內(nèi),超聲輔助提取丁香總多酚含量隨溫度升高逐漸上升,60 ℃時達(dá)到最大含量,但是當(dāng)溫度超過60 ℃時,丁香總多酚提取含量逐漸下降?？赡艿脑蚴?溫度在60 ℃之前,提取的總多酚會不斷被有機(jī)溶劑提取出來;當(dāng)60 ℃后,總多酚含量有所下降[27],是因為隨溫度升高,溶劑揮發(fā)導(dǎo)致部分總多酚析出,不能溶于溶劑中[28]。選定提取溫度50、60、70 ℃做后續(xù)正交實驗。

圖2 恒溫超聲輔助提取溫度單因素實驗Fig.2 Results of ultrasonic temperature experiment by UAECT

2.1.3 恒溫超聲提取頻率單因素實驗 頻率單因素實驗結(jié)果如圖3所示。從圖3可看出,隨頻率升高,提取總多酚含量隨之降低,因為超聲頻率與總波長成反比,波長會隨頻率增加而逐漸減小,造成聲波在傳播過程中逐漸衰減,影響丁香總多酚提取[18]。所以選定提取頻率45、80、100 kHz做后續(xù)正交實驗。

圖3 恒溫超聲輔助提取頻率單因素實驗Fig.3 Results of ultrasonic frequency experiment by UAECT

2.1.4 恒溫超聲提取功率單因素實驗 功率單因素實驗結(jié)果如圖4所示,在150～270 W范圍內(nèi),丁香總多酚提取含量逐漸上升,當(dāng)270 W時,含量達(dá)到最大值。提取功率超過270 W時,含量有所下降,可能原因是超聲功率能導(dǎo)致體系內(nèi)壓力增大,破壞丁香結(jié)構(gòu),從而使提取含量有所下降[29]。所以選定提取功率240、270、300 W做后續(xù)正交實驗。

圖4 恒溫超聲輔助提取功率單因素實驗Fig.4 Results of ultrasonic power experiment by UAECT

2.1.5 恒溫超聲提取料液比單因素實驗 料液比單因素實驗結(jié)果如圖5所示,開始時,隨比例升高含量明顯增長,當(dāng)料液比達(dá)到1∶30后,再增大溶劑添加量時,提取的丁香總多酚含量變化不明顯。開始時,總多酚含量會隨有機(jī)溶劑增加不斷被提取,當(dāng)有機(jī)溶劑達(dá)到一定含量后,從理論上講,額外溶劑的增加,不會導(dǎo)致濃度差顯著增加,從而不會使提取率顯著增加[30]。所以選定料液比為1∶30作為正交實驗的固定料液比。

圖5 恒溫超聲輔助提取料液比單因素實驗Fig.5 Results of solvent to solid ratio experiment by UAECT

2.1.6 恒溫超聲提取乙醇濃度單因素實驗 乙醇濃度單因素實驗結(jié)果如圖6所示,從圖6中看出,乙醇濃度達(dá)到60%之前,總多酚含量會不斷上升,是因為隨乙醇濃度升高,總多酚能更快的被提取出。當(dāng)乙醇濃度達(dá)到60%時,提取的總多酚含量最高,當(dāng)濃度繼續(xù)升高時,提取含量有所下降?？赡苁且驗槎∠阒泻胁糠执既苄噪s質(zhì),當(dāng)乙醇濃度超過一定量后溶出,從而增大干擾因素,使總多酚含量得率有所降低[31]。所以選定乙醇濃度60%作為正交實驗的固定濃度。

圖6 恒溫超聲輔助提取乙醇濃度單因素實驗Fig.6 Results of ethanol concentration experiment by UAECT

2.2恒溫超聲輔助提取丁香總多酚正交試驗結(jié)果

正交實驗結(jié)果如表2所示,由表2可以看出,影響恒溫超聲輔助提取丁香總多酚的因素從大到小排序依次為:超聲時間>超聲頻率>超聲功率>超聲溫度,正交表中最佳提取工藝為第8組試驗:A3B2C1D3,即:超聲功率300 W、超聲頻率80 kHz、超聲時間30 min、超聲溫度70 ℃。正交試驗方差分析如表3所示。

表2 恒溫超聲輔助提取丁香總多酚正交試驗結(jié)果Table 2 Orthogonal experiments for extracting polyphenols from clove by UAECT

表3 正交試驗方差分析Table 3 Analysis of orthogonal experiments

選取恒溫超聲提取最佳工藝(A2B2C1D1)與正交實驗中總多酚含量最高的一組(A3B2C1D3)進(jìn)行比較驗證,得到恒溫超聲提取最佳工藝(A2B2C1D1)所提取的總多酚含量(0.301±0.0043) g/g高于正交表2中提取的總多酚含量的最高值(0.278±0.0049) g/g(p<0.001)。由此證明該最佳工藝較為可靠,可以考慮作為后續(xù)擴(kuò)大提取工藝的提取條件。

2.3丁香總多酚提取物對LDL氧化修飾過程中熒光強(qiáng)度抑制效果

國內(nèi)外研究結(jié)果表明植物總多酚能有效抑制LDL氧化修飾,降低AS發(fā)生[32],且有研究表明丁香總多酚含量也很高[13],為了確定丁香總多酚抑制LDL氧化修飾效果,本文采用1.2.5方法分別以Trp熒光淬滅、總熒光產(chǎn)物和脂褐素三個指標(biāo)確定丁香總多酚對LDL氧化修飾過程中所產(chǎn)熒光的抑制效果。

2.3.1 丁香提取物對LDL氧化時的Trp熒光淬滅的影響結(jié)果 Cu2+誘導(dǎo)LDL氧化時,apoB-100中色氨酸殘基結(jié)構(gòu)遭到破壞、被氧化,導(dǎo)致其熒光淬滅[33]。通過測定Trp熒光淬滅可反映出丁香總多酚提取物抑制LDL氧化修飾作用[21]。通過1.2.5.2方法測定結(jié)果如圖7所示。從圖7中可看出,與空白組相比,促氧組Trp熒光強(qiáng)度明顯衰弱(p<0.01)。與促氧組相比,不同濃度丁香總多酚提取物熒光強(qiáng)度均有不同程度上升,隨著濃度升高,其熒光強(qiáng)度隨之上升,表明丁香總多酚提取物在0.5～1.5 μg/mL濃度范圍內(nèi)對Trp殘基熒光淬滅的抑制程度呈量效關(guān)系。Chen等[22]研究后發(fā)現(xiàn),杏仁皮多酚能有效阻止Trp氧化修飾,從而抑制LDL氧化。本文發(fā)現(xiàn)丁香提取物富含總多酚,所以丁香總多酚提取物可能也是通過此途徑防止Trp殘基氧化修飾。

圖7 不同濃度丁香總多酚提取物抑制Trp熒光淬滅定量效果Fig.7 The inhibition efficiency of the different concentrations of clove extracts on Trp fluorescence quenching by quantitative determination注:不同大寫字母代表差異顯著(p<0.01);圖8、圖9同。

2.3.2 丁香提取物對LDL氧化修飾過程中總熒光產(chǎn)物的抑制效果 LDL表面的apoB-100含有的賴氨酸(Lys)游離氨基與脂質(zhì)氧化產(chǎn)物結(jié)合形成熒光發(fā)色團(tuán),Lys游離氨基活性反映出LDL氧化修飾程度[34]。采用1.2.5.3方法在Ex360/Em430處進(jìn)行產(chǎn)物熒光定量測定反映LDL氧化修飾情況,測定結(jié)果如圖8所示。促氧組熒光強(qiáng)度最強(qiáng),表明LDL氧化修飾產(chǎn)生了大量熒光產(chǎn)物。與促氧組相比,隨丁香總多酚提取物提取物濃度增高,熒光強(qiáng)度越弱,說明丁香提取物能夠顯著抑制氧化產(chǎn)物產(chǎn)生(p<0.001)。Chen等[35]通過研究也發(fā)現(xiàn),綠茶總多酚通過優(yōu)先與活性醛結(jié)合而抑制LDL氧化修飾,導(dǎo)致熒光產(chǎn)物減少。

圖8 不同濃度提取物對LDL氧化修飾過程中熒光產(chǎn)物生成的抑制效果Fig.8 The inhibition efficiency of the different concentrations of clove polyphenol extracts on fluorescent products generated during oxidation of LDL

2.3.3 丁香總多酚提取物對LDL氧化修飾過程中脂褐素產(chǎn)生的抑制效果 脂褐素是LDL氧化過程中脂質(zhì)氧化產(chǎn)物和蛋白結(jié)合形成具有熒光特性的化合物[36],通過測定Ex350/Em460處熒光強(qiáng)度反應(yīng)其含量。采用1.2.5.4方法測定脂褐素?zé)晒舛繙y定結(jié)果如圖9所示。從圖9中可看出,促氧組脂褐素?zé)晒鈴?qiáng)度最高,說明LDL氧化會產(chǎn)生大量脂褐素。添加不同濃度丁香總多酚提取物后,熒光強(qiáng)度均有明顯下降,與促氧組相比有極顯著差異(p<0.001)。不同濃度丁香總多酚提取物對脂褐素的抑制效果與上述2.3.2中對熒光產(chǎn)物的抑制效果相似,進(jìn)一步表明丁香總多酚能有效抑制LDL氧化修飾,與劉穎琳等[23]結(jié)果相似。

圖9 不同濃度提取物對LDL氧化修飾過程中脂褐素生成的抑制效果Fig.9 The inhibition efficiency of the different concentrations of clove polyphenol extracts on lipofuscin generated during oxidation of LDL

2.4三維熒光等高線光譜解析丁香總多酚提取物對LDL氧化過程中熒光抑制效果的量效關(guān)系

為更深入考察丁香總多酚對LDL氧化修飾過程中熒光的抑制效果,本文采用1.2.6方法進(jìn)行三維熒光掃描獲得三維熒光等高線光譜圖比較不同濃度丁香總多酚提取物對LDL氧化修飾的抑制效果[24]。測定結(jié)果如圖10(橫坐標(biāo)為發(fā)射波長,縱坐標(biāo)為激發(fā)波長;同心圓所在位置代表該處有熒光發(fā)色團(tuán))。

從圖10(a)中可以看出,空白組只有一個熒光發(fā)色團(tuán),Peak A即為LDL中Trp的內(nèi)源熒光,位于Ex280/Em340。

從圖10(h)中可以看出,與空白組相比,促氧組在Ex280/Em340處熒光明顯降低,說明Trp遭到氧化破壞后,其熒光產(chǎn)生淬滅[32]。在Ex360/Em430處出現(xiàn)了一個熒光強(qiáng)度為190.62的新熒光發(fā)色團(tuán)。該新熒光發(fā)色團(tuán)是因Lys游離氨基與脂質(zhì)氧化產(chǎn)物結(jié)合形成[33]。

從圖10(b、c、d)中可以看出,隨丁香總多酚提取物濃度升高,Peak A的熒光信號逐漸增強(qiáng),而Peak B的熒光信號逐漸降低,很好地驗證了本文熒光強(qiáng)度的三個結(jié)果。與圖10(e、f、g)相比可以得出,丁香總多酚提取物抑制LDL氧化修飾雖然不及BHT,但已非常接近。因此,丁香總多酚能有效抑制LDL氧化修飾。

3 結(jié)論

通過單因素實驗和正交試驗確定丁香總多酚恒溫超聲提取的最佳工藝條件為:超聲功率270 W、超聲頻率80 kHz、超聲時間30 min、超聲溫度50 ℃、料液比1∶30、乙醇濃度60%,此條件下所提取的總多酚含量為(0.301±0.0043) g/g。其可靠性由方差分析和驗證實驗得到確認(rèn)。

丁香總多酚提取物能有效抑制LDL氧化修飾過程中Trp淬滅、總熒光產(chǎn)物及脂褐素的產(chǎn)生,且抑制效果與濃度成正比,呈現(xiàn)出良好的量效關(guān)系。

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圖10 不同濃度丁香提取物對LDL氧化影響的三維熒光等高線光譜抑制效果Fig.10 The inhibition efficiency of the different concentrations of clove polyphenol extracts on three-dimensional flourescence contour spectroscopy during oxidation of LDL注:(a)空白組,(b)0.5 μg/mL提取物,(c)1 μg/mL提取物,(d)1.5 μg/mL提取物,(e)0.5 μg/mL BHT,(f)1 μg/mL BHT,(g)1.5 μg/mL BHT,(h)促氧組。

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Optimizationofextractionprocessofclovetotalpolyphenolsbyultrasonicassistedextractionwithconstanttemperature(UAECT)anditsinhibitionoffluorescenceonlowdensitylipoprotein(LDL)intheprocessofoxidationmodification

XIONGYi-fan1,LIWen1,QUWen-juan1,2,LIULong-xiu1,ZHANGXiao-xia1,JIANGShen-hua1,2,3,*,HAOShu1,3,ZHANGLiang-hui1,3,XIELi-qin1,3

(1.School of Pharmacy and Life Science,Jiujiang University,Jiujiang 332000,China;2.School of Food and Biological Engineering Jiangsu University,Jiangsu Provincal Key Lab of Physical Processing of Agricultural Products,Zhenjiang 212013,China;3.Jiujiang Andehe Biotechnology Co.,Ltd.,Jiujiang 332000,China)

Oxidation of low density lipoprotein has been a major cause of atherosclerosis. In order to explore the extracting effect on total polyphenols from clove based on ultrasonic assisted extraction with constant temperature(UAECT),and its inhibition effect on fluorescence during the process of oxidation of(low density lipoprotein)LDL,the extrcation technology of total polyphenols from cloves were firstly optimized,then the inhibition effect on fluorescence during oxidation of LDL was analysized. The results showed that the optimal parameters of the extracting technology were as follows:ultrasound power was 270 W,ultrasound frequency was 80 kHz,ultrasound time was 30 min,ultrasound temperature was 50 ℃,solid-liquid ratio was 1∶30,and ethanol concentration was 60%. Under this optimal extracting technology,the total polyphenol content was(0.301±0.0043) g/g. The total polyphenols from clove by the optimal extracting technology significantly inhibited fluorescence of Trp from quenching,inhibited the generation of fluorescent products and lipofuscin from generating,and inhibited the variation of three-dimensional fluorescence. And the inhibition effects were proportional to the concentrations,it showed positive does-effect relationship. This study laid the foundation for the subsequent research and development of functional foods of total polyphenols from clove for inhibiting oxidation of LDL.

clove;total polyphenol;ultrasonic assisted extraction in constant temperature(UAECT);low density lipoprotein;fluorescent products

2017-02-07

熊一凡(1992-)，男，大學(xué)本科，主要從事天然產(chǎn)物研究與開發(fā)方面的研究，E-mail：741639605@qq.com。

*通訊作者:江慎華(1973-)，男，博士，教授，主要從事天然產(chǎn)物研究與開發(fā)方面的研究，E-mail：jiangshenhua66@163.com。

國家自然科學(xué)基金(31360371，31301423，31560308);江西省科技支撐計劃(20151BBF60026,20171BBF60049);江西省衛(wèi)生廳科研計劃( 2013A017); 江蘇省農(nóng)產(chǎn)品物理加工重點實驗室開放課題(JAPP2010-5);江西省天然產(chǎn)物與功能食品重點實驗室開放基金資助項目;九江學(xué)院教學(xué)改革研究課題(2015-04);九江學(xué)院人才引進(jìn)基金。

TS201.4

:B

:1002-0306(2017)16-0159-08

10.13386/j.issn1002-0306.2017.16.030