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(1.石河子大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,新疆石河子 832000;2.中國(guó)科學(xué)院上海高等研究院,上海 201210)

絲氨酸吸收系統(tǒng)多基因敲除對(duì)大腸桿菌產(chǎn)L-絲氨酸的影響

石斌超1,2,崔云風(fēng)1,王晨陽(yáng)2,趙志軍2,史吉平2,張霞1,*

(1.石河子大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,新疆石河子 832000;2.中國(guó)科學(xué)院上海高等研究院,上海 201210)

sstT、cycA、sdaC和tdcC是大腸桿菌L-絲氨酸的四個(gè)吸收基因,本文在前期吸收基因單基因敲除菌的基礎(chǔ)上,系統(tǒng)研究了四個(gè)吸收基因不同組合敲除對(duì)菌株生長(zhǎng)及L-絲氨酸生產(chǎn)的影響。搖瓶發(fā)酵結(jié)果表明,在11個(gè)多基因敲除突變菌中,sstT·sdaC雙基因敲除菌,sstT·sdaC·tdcC和sstT·cycA·sdaC三基因敲除菌的L-絲氨酸產(chǎn)量與對(duì)照相比有明顯提升,分別達(dá)到271.11、312.58和322.57 mg/L;sstT·cycA·sdaC·tdcC四基因敲除菌的L-絲氨酸產(chǎn)量最高,達(dá)到了450.58 mg/L,是對(duì)照菌的6倍。在菌株生長(zhǎng)方面,雙基因敲除菌和三基因敲除菌的生長(zhǎng)量?jī)?yōu)于對(duì)照菌或者與對(duì)照菌相近,而四基因敲除菌的生長(zhǎng)量與對(duì)照菌相比則下降了28%。

L-絲氨酸,吸收基因,菌株生長(zhǎng),產(chǎn)絲氨酸能力

L-絲氨酸是一種重要的非必需氨基酸,參與了多個(gè)關(guān)鍵的生物代謝進(jìn)程,尤其是在細(xì)胞增殖、生長(zhǎng)過(guò)程中發(fā)揮著重要的作用[1],此外,絲氨酸以其獨(dú)特的生物學(xué)特性,在醫(yī)藥、食品、化妝品等領(lǐng)域得到了廣泛應(yīng)用。目前,L-絲氨酸的工業(yè)生產(chǎn)方法主要有蛋白水解法[2]、化學(xué)合成法[3]和酶轉(zhuǎn)化法[4]等,而微生物直接發(fā)酵法具有環(huán)境友好、生產(chǎn)成本低、生產(chǎn)效率高等優(yōu)點(diǎn),其菌株育種研究受到研究者的廣泛關(guān)注。谷氨酸棒桿菌和大腸桿菌是L-絲氨酸主要生產(chǎn)菌株。其中谷氨酸棒桿菌產(chǎn)量最高可達(dá)42.62 g/L[5]。而大腸桿菌產(chǎn)L-絲氨酸的研究起步較晚,工程改造主要集中在L-絲氨酸合成途徑及降解途徑。Mundhada等人在大腸桿菌MG1655基礎(chǔ)上敲除三個(gè)L-絲氨酸脫氨酶編碼基因sdaA、sdaB、tdcG以及絲氨酸羥甲基轉(zhuǎn)移酶編碼基因glyA,并過(guò)表達(dá)L-絲氨酸合成基因serAmut(突變serA,解除反饋抑制)、serB、serC，使L-絲氨酸產(chǎn)量達(dá)到8.3 g/L,在提高菌株對(duì)L-絲氨酸耐受性后,產(chǎn)量可達(dá)11.7 g/L[6]。本實(shí)驗(yàn)室前期在W3110基礎(chǔ)上敲除基因sdaA并突變基因glyA得到菌株SWCH-05,在此基礎(chǔ)上敲除L-絲氨酸吸收基因sdaC并過(guò)表達(dá)基因serAfbr(抗反饋抑制突體)、serB、serC和pgk后進(jìn)行流加補(bǔ)料發(fā)酵,L-絲氨酸產(chǎn)量達(dá)到16.3 g/L[7]。

氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng),分為吸收系統(tǒng)和分泌系統(tǒng)兩部分,對(duì)微生物生理代謝具有重要的調(diào)控作用[7-9]。氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)工程可以通過(guò)加速氨基酸的分泌或者減弱氨基酸的吸收從而達(dá)到高效積累目標(biāo)氨基酸的目的。目前氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)改造已在多種氨基酸[10-13]的育種研究中取得成功。文獻(xiàn)報(bào)道sstT、cycA、sdaC和tdcC是大腸桿菌中四個(gè)參與了L-絲氨酸吸收調(diào)控的基因。轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白SstT是一種Na+偶聯(lián)的L-絲氨酸和蘇氨酸協(xié)同轉(zhuǎn)運(yùn)載體[14-15]。轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白CycA最初發(fā)現(xiàn)是丙氨酸的主要轉(zhuǎn)運(yùn)子,但隨后發(fā)現(xiàn)其也參與細(xì)胞對(duì)絲氨酸和甘氨酸的吸收[16-18]。轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白SdaC和TdcC同屬H+協(xié)同轉(zhuǎn)運(yùn)子家族:其中,SdaC是一種具有高度特異性的L-絲氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)子,TdcC則也是一種蘇氨酸-絲氨酸協(xié)同轉(zhuǎn)運(yùn)子[19-22]。

實(shí)驗(yàn)室前期構(gòu)建了L-絲氨酸四個(gè)吸收基因sstT、cycA、sdaC和tdcC的單基因敲除菌,本研究在此基礎(chǔ)上,進(jìn)一步利用Red重組系統(tǒng)構(gòu)建了四個(gè)L-絲氨酸吸收基因的組合突變菌,共計(jì)11個(gè)多基因敲除菌;將實(shí)驗(yàn)室前期構(gòu)建的質(zhì)粒pSC-05導(dǎo)入至敲除菌中,考察L-絲氨酸吸收基因不同組合敲除情況下,菌株的生長(zhǎng)及發(fā)酵產(chǎn)L-絲氨酸的情況。

1 材料與方法

1.1材料與儀器

E.coliSWCH-05、E.coliW3110的sdaA敲除和glyA突變衍生菌 實(shí)驗(yàn)室保藏;菌株E.coliSWCH-51、E.coliSWCH-52、E.coliSWCH-53和E.coliSWCH-54 實(shí)驗(yàn)室前期以E.coliSWCH-05為出發(fā)菌株構(gòu)建的sstT、cycA、sdaC和tdcC四個(gè)基因的單基因敲除菌;E.colipSC-05 實(shí)驗(yàn)室前期構(gòu)建的攜帶絲氨酸合成關(guān)鍵基因serAfbr(抗反饋抑制突體)、serB、serC以及pgk的低拷貝質(zhì)粒,以上菌株和質(zhì)粒的具體特性見(jiàn)表1;蛋白胨、酵母粉及瓊脂粉 購(gòu)自Thermo Scientific;Primer STAR HS DNA Polymerase、Taq DNA Polymerase(Mix) 購(gòu)自寶生物工程(大連)有限公司;DNA ladder Mix 購(gòu)自Fementas;Kan抗生素 購(gòu)自上海捷倍思基因技術(shù)有限公司;細(xì)菌基因組DNA小量制備試劑盒、質(zhì)粒DNA小量制備試劑盒和清潔試劑盒 購(gòu)自AxyPrep;工具質(zhì)粒pKD13、pKD46和pCP20 購(gòu)自美國(guó)耶魯大學(xué)大腸桿菌菌株庫(kù)(E.coliGenetic Stock Center,New Haven,USA);L-絲氨酸標(biāo)準(zhǔn)樣品,L-甘氨酸標(biāo)準(zhǔn)樣品及異硫氰酸苯酯(PITC) 購(gòu)自Sigma;其他化學(xué)試劑 購(gòu)自上海國(guó)藥;常規(guī)試劑 采用分析純;液相用乙酸鈉 采用優(yōu)級(jí)純;甲醇及乙腈 采用色譜純；LB培養(yǎng)基(1 L) 酵母粉5 g,蛋白胨10 g,NaCl 10 g;搖瓶培養(yǎng)基(1 L) 低聚麥芽糊精8 g,酵母粉4 g,蛋白胨2 g,尿素2 g,K2HPO415.07 g,(NH4)SO43 g,KH2PO41.82 g,MgSO4·7H2O 1.5 g,Na-Citrate·2H2O 0.6 g,NaCl 0.5 g,FeSO4·7H2O 0.035 g,CaCl2·2H2O 0.0085 g,1000×微量元素液0.75 mL;1000×微量元素液(1 L) H3BO325 g,MnCl2·4H2O 16 g,CoCl2·6H2O 7 g,ZnSO4·7H2O 3 g,CuSO4·5H2O 2.5 g,Na2MoO4·2H2O 1.5 g。

核酸電泳儀、凝膠成像系統(tǒng)、PCR儀以及電轉(zhuǎn)儀 美國(guó)BIO-RAD公司;紫外分光光度計(jì) 德國(guó)Beckman公司;冷凍離心機(jī)和移液槍 德國(guó)Eppendorf公司;高效液相色譜儀 日本島津公司。

表1 實(shí)驗(yàn)菌株和質(zhì)粒Table 1 Strains and plasmid in the experiment

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 引物設(shè)計(jì) 根據(jù)大腸桿菌W3110基因組序列設(shè)計(jì)四對(duì)敲除引物:sstT-p1 & p2,cycA-p1 & p2,sdaC-p1 & p2和tdcC-p1 & p2以及四對(duì)驗(yàn)證引物:sstT-v1 & v2,cycA-v1 & v2,sdaC-v1 & v2和tdcC-v1 & v2,K1 & K2為Kan基因內(nèi)部序列,具體操作方法參照文獻(xiàn)[7];引物合成由英濰捷基(上海)貿(mào)易有限公司合成;測(cè)序工作由蘇州金唯智完成。

1.2.2 敲除菌的構(gòu)建 本研究采用Red重組系統(tǒng)在sstT、cycA、sdaC和tdcC四個(gè)單基因敲除菌基礎(chǔ)上進(jìn)一步構(gòu)建了11株組合敲除突變菌。具體操作方法參照文獻(xiàn)[12]。

1.2.3 搖瓶發(fā)酵條件 從平板挑取敲除菌的單菌落接種至50 mL含有Kan抗生素的LB培養(yǎng)基中,35 ℃,200 r/min,培養(yǎng)12 h;按8%接種量(v/v)取4 mL LB培養(yǎng)液轉(zhuǎn)接至50 mL含有Kan抗生素的搖瓶培養(yǎng)基中,35 ℃,200 r/min,預(yù)培養(yǎng)6 h;預(yù)培養(yǎng)結(jié)束后,將培養(yǎng)條件調(diào)整至38 ℃,200 r/min;搖瓶發(fā)酵實(shí)驗(yàn)開(kāi)始后,每6 h取樣一次,測(cè)定OD值及pH。

1.2.4 檢測(cè)方法

1.2.4.1 菌體密度測(cè)定 采用紫外分光光度計(jì)檢測(cè),用600 nm處的吸光度OD600表示。

1.2.4.2 L-絲氨酸產(chǎn)量測(cè)定 采用高效液相色譜(HPLC)檢測(cè),樣品預(yù)處理采用異硫氰酸苯酯柱前衍生法,具體方法參照文獻(xiàn)[23]。

表2 實(shí)驗(yàn)引物Table 2 Primers used in the experiment

注:下劃線表示用于同源重組的同源臂。

高效液相色譜分析條件:色譜柱為Agilent Extend C18(250 nm×4.6 nm,5 μm)。流動(dòng)相為A 0.05 mol/L乙酸鈉(pH:6.50±0.5)和B甲醇∶乙腈∶水(20∶60∶20)。流速為0.8 mL/min。進(jìn)樣體積10 μL,柱溫箱溫度為45 ℃。

L-絲氨酸標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制:準(zhǔn)確稱取L-絲氨酸標(biāo)品5.25 g溶于1 L容量瓶中,加蒸餾水定容,得到濃度為0.05 mol/L的L-絲氨酸標(biāo)準(zhǔn)母液。利用該母液加蒸餾水稀釋,得到濃度分別為0.001、0.002、0.004、0.008、0.02、0.03和0.04 mol/L的L-絲氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液。采用異硫氰酸苯酯柱前衍生法處理后進(jìn)行HPLC檢測(cè),以標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度為橫坐標(biāo),峰面積為縱坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。最終標(biāo)準(zhǔn)曲線為y=2128648382.27x-14834.45,R2=0.99。

1.3數(shù)據(jù)處理

實(shí)驗(yàn)中每個(gè)處理重復(fù)三次,采用SPSS 17.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)的顯著性分析,應(yīng)用Origin 7.0軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1雙基因敲除菌的構(gòu)建

sstT·cycA雙基因敲除菌SWCH-61和sstT·sdaC雙基因敲除菌SWCH-62是在sstT單基因敲除菌SWCH-53的基礎(chǔ)上分別敲除基因cycA和sdaC得到的,sstT·tdcC雙基因敲除菌SWCH-63和cycA·tdcC雙基因敲除菌SWCH-65是在tdcC單基因敲除菌SWCH-54的基礎(chǔ)上分別敲除基因sstT和cycA得到的,cycA·sdaC雙基因敲除菌SWCH-64和sdaC·tdcC雙基因敲除菌SWCH-66則是在sdaC單基因敲除菌SWCH-51的基礎(chǔ)上分別敲除基因cycA和tdcC得到,構(gòu)建流程如圖1所示,DNA瓊脂糖凝膠電泳驗(yàn)證圖譜如圖2所示。測(cè)序驗(yàn)證正確后,則成功構(gòu)建了sstT·cycA雙基因敲除菌SWCH-61、sstT·sdaC雙基因敲除菌SWCH-62、sstT·tdcC雙基因敲除菌SWCH-63、cycA·sdaC雙基因敲除菌SWCH-64、cycA·tdcC雙基因敲除菌SWCH-65和sdaC·tdcC雙基因敲除菌SWCH-66,菌株特征如表3所示。

表3 實(shí)驗(yàn)構(gòu)建菌株Table 3 Strains constructed in the experiment

圖1 多基因敲除菌的構(gòu)建流程Fig.1 Construction process of multi-gene deletion mutants注:實(shí)線矩形代表實(shí)驗(yàn)菌株,其中帶有下劃線的菌株為實(shí)驗(yàn)室前期構(gòu)建所得,未帶有下劃線的菌株為本實(shí)驗(yàn)構(gòu)建所得;虛線橢圓代表被敲除的L-絲氨酸吸收基因。

圖2 吸收基因sstT、cycA、sdaC和tdcC同源重組的PCR驗(yàn)證Fig.2 PCR test of homologous recombination about uptake genes sstT,cycA,sdaC and tdcC注:a為SWCH-62,其中1:sdaC-v1 & K1,2:sdaC-v2 & K2;b為SWCH-64,其中1:cycA-v1 & K1,2:cycA-v2 & K2;c為 SWCH-61,其中1:cycA-v1 & K1,2:cycA-v2 & K2;d為SWCH-65,其中1:cycA-v1 & K1,2:cycA-v2 & K2;e為SWCH-63,其中1:sstT-v1 & K1,2:sstT-v2 & K2;f為SWCH-66,其中1:tdcC-v1 & K2,2:tdcC-v2 & K1。

2.2三基因及四基因敲除菌的構(gòu)建

sstT·cycA·sdaC三基因敲除菌SWCH-71是在sstT·cycA雙基因敲除菌SWCH-61基礎(chǔ)上敲除吸收基因sdaC獲得;sstT·cycA·tdcC三基因敲除菌SWCH-72、sstT·sdaC·tdcC三基因敲除菌SWCH-73和cycA·sdaC·tdcC三基因敲除菌SWCH-74是分別在sstT·cycA雙基因敲除菌SWCH-61、sstT·sdaC雙基因敲除菌SWCH-62和cycA·sdaC雙基因敲除菌SWCH-64基礎(chǔ)上敲除吸收基因tdcC獲得;sstT·cycA·sdaC·tdcC四基因敲除菌則是在sstT·cycA·sdaC三基因敲除菌SWCH-71基礎(chǔ)上敲除吸收基因tdcC得到,構(gòu)建流程如圖1所示,DNA瓊脂糖凝膠電泳驗(yàn)證圖譜如圖3所示。測(cè)序驗(yàn)證正確后,就分別成功構(gòu)成了sstT·cycA·sdaC三基因敲除菌SWCH-71、sstT·cycA·tdcC三基因敲除菌SWCH-72、sstT·sdaC·tdcC三基因敲除菌SWCH-73、cycA·sdaC·tdcC三基因敲除菌SWCH-74及sstT·cycA·sdaC·tdcC四基因敲除菌SWCH-08,菌株特征如表3所示。

圖3 吸收基因sdaC和tdcC同源重組的PCR驗(yàn)證Fig.3 PCR test of homologous recombination about uptake genes sdaC and tdcC注:A為SWCH-71,其中1:sdaC-v2 & K2,2:sdaC-v1 & K1;B為SWCH-72(1和5),SWCH-73(2和6)、SWCH-74(3和7)和SWCH-08(4和8),1、2、3、4:tdcC-v2 & K1,5、6、7、8:tdcC-v1 & K2。

2.3雙基因敲除菌的搖瓶發(fā)酵

實(shí)驗(yàn)室前期以SWCH-05為出發(fā)菌株構(gòu)建了L-絲氨酸吸收基因sstT、cycA、sdaC和tdcC的單基因敲除菌,研究發(fā)現(xiàn)sdaC基因敲除菌在發(fā)酵罐分批補(bǔ)料實(shí)驗(yàn)中L-絲氨酸產(chǎn)量最高,達(dá)到16.3 g/L[7];與發(fā)酵罐發(fā)酵結(jié)果類似,在單基因敲除菌的搖瓶發(fā)酵實(shí)驗(yàn)中,sdaC單基因敲除菌的L-絲氨酸產(chǎn)量為105.07 mg/L,同樣是四個(gè)單基因敲除菌中L-絲氨酸產(chǎn)量最高的。

在單基因敲除菌基礎(chǔ)上進(jìn)一步構(gòu)建雙基因敲除菌,并將質(zhì)粒pSC-05導(dǎo)入到雙基因敲除菌中。在雙基因敲除菌搖瓶發(fā)酵實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn):sstT·sdaC雙基因敲除菌株SWCH-62/pSC-05的L-絲氨酸產(chǎn)量達(dá)到271.11 mg/L,是對(duì)照菌SWCH-05/pSC-05(74.98 mg/L)的3.6倍,而其他5株雙基因敲除菌的L-絲氨酸產(chǎn)量很低,僅為10 mg/L左右。菌株SWCH-62的現(xiàn)象說(shuō)明基因sstT和sdaC的敲除組合在菌株L-絲氨酸產(chǎn)量提升方面作用明顯;但同樣作為敲除基因sdaC的菌株SWCH-64/pSC-05和SWCH-66/pSC-05其產(chǎn)量卻僅為6.64和7.68 mg/L,說(shuō)明基因sdaC的L-絲氨酸吸收作用受其它三個(gè)吸收基因的影響不同(如圖4)。在菌株生長(zhǎng)方面,除sstT·sdaC雙基因敲除菌SWCH-62/pSC-05(OD600=5.73)的生長(zhǎng)與對(duì)照菌(OD600=6.28)相近外,其他雙基因敲除菌的生長(zhǎng)都明顯優(yōu)于對(duì)照菌(如圖5)。

圖4 L-絲氨酸雙基因敲除菌產(chǎn)L-絲氨酸情況Fig.4 The L-serine yield of double-gene deletion mutants

圖5 L-絲氨酸雙基因敲除菌生長(zhǎng)情況Fig.5 The cell growth of double-gene deletion mutants

2.4三基因敲除菌的搖瓶發(fā)酵

在三基因敲除菌中導(dǎo)入表達(dá)質(zhì)粒pSC-05后,進(jìn)行搖瓶發(fā)酵實(shí)驗(yàn)。從三基因敲除菌產(chǎn)L-絲氨酸的情況可以發(fā)現(xiàn):sstT·cycA·sdaC三基因敲除菌SWCH-71/pSC-05和sstT·sdaC·tdcC三基因敲除菌SWCH-73/pSC-05的L-絲氨酸產(chǎn)量分別達(dá)到322.57 mg/L和312.58 mg/L,是對(duì)照菌SWCH-05/pSC-05的4.3和4.2倍,而其他2株三基因敲除菌的L-絲氨酸產(chǎn)量均不超過(guò)5 mg/L。這種現(xiàn)象說(shuō)明基因sstT和sdaC的敲除組合確實(shí)有利于菌株L-絲氨酸產(chǎn)量提高(如圖6)。從菌株生長(zhǎng)方面看,三基因敲除菌的生長(zhǎng)狀態(tài)普遍與對(duì)照菌相似,但菌體OD總體略低(如圖7)。

圖6 L-絲氨酸三基因敲除菌產(chǎn)L-絲氨酸情況Fig.6 The L-serine yield of triple-gene deletion mutants

圖7 L-絲氨酸三基因敲除菌生長(zhǎng)情況Fig.7 The cell growth of triple-gene deletion mutants

2.5四基因敲除菌的搖瓶發(fā)酵

sstT·cycA·sdaC·tdcC四基因敲除菌SWCH-08/pSC-05的L-絲氨酸產(chǎn)量是所有敲除菌中最高的,達(dá)到450.58 mg/L,是對(duì)照菌SWCH-05/pSC-05(74.98 mg/L)的6倍(如圖8);但其菌株生長(zhǎng)同樣是所有敲除菌中最低的,OD600僅為4.52,與對(duì)照菌(OD600=6.28)相比,下降28%(如圖9)。四基因敲除菌L-絲氨酸產(chǎn)量的大幅提升說(shuō)明當(dāng)所有L-絲氨酸吸收基因被全部敲除后,對(duì)菌株產(chǎn)L-絲氨酸的促進(jìn)作用明顯,但同時(shí)也會(huì)對(duì)菌株生長(zhǎng)產(chǎn)生不利影響。

圖8 L-絲氨酸四基因敲除菌產(chǎn)L-絲氨酸情況Fig.8 The L-serine yield of quadruple-gene deletion mutants

圖9 L-絲氨酸四基因敲除菌生長(zhǎng)情況Fig.9 The cell growth of quadruple-gene deletion mutants

3 結(jié)論與討論

本文首次系統(tǒng)考察了不同組合敲除L-絲氨酸四個(gè)吸收基因sstT、cycA、sdaC和tdcC,對(duì)菌株產(chǎn)L-絲氨酸和生長(zhǎng)的影響。在11個(gè)組合敲除突變菌中,sstT·sdaC雙基因敲除菌,sstT·cycA·sdaC和sstT·sdaC·tdcC兩個(gè)三基因敲除菌以及sstT·cycA·sdaC·tdcC四基因敲除菌的L-絲氨酸產(chǎn)量均明顯高于對(duì)照菌,可見(jiàn)敲除多個(gè)L-絲氨酸吸收基因確實(shí)可以提升菌株產(chǎn)L-絲氨酸的能力;其次,上述三個(gè)敲除突變菌的基因組上均具有sstT·sdaC雙基因缺失特征,可見(jiàn)吸收基因sdaC和sstT在細(xì)胞調(diào)控L-絲氨酸吸收方面起主要作用;但值得注意的是,一些吸收基因敲除后,菌體L-絲氨酸的產(chǎn)量反而出現(xiàn)了下降,但當(dāng)四個(gè)吸收基因均被敲除后,菌體L-絲氨酸產(chǎn)量又是最高的,這說(shuō)明四個(gè)吸收基因之間可能存在一定的相互作用。在菌株生長(zhǎng)方面,當(dāng)四個(gè)吸收基因均被敲除后,菌體的生長(zhǎng)受到明顯抑制,這可能是由于菌體L-絲氨酸吸收基因全部被敲除后,培養(yǎng)液中的L-絲氨酸已經(jīng)無(wú)法轉(zhuǎn)移至胞內(nèi)供給菌體生長(zhǎng)所致。

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Effectofmulti-geneknockoutofL-serineuptakesystemonL-serineproductioninEscherichiacoli

SHIBin-chao1,2,CUIYun-feng1,WANGChen-yang2,ZHAOZhi-jun2,SHIJi-ping2,ZHANGXia1,*

(1.College of Life Science,Shihezi University,Shihezi 832000,China; 2.Shanghai Advanced Research Institute of Chinese Academy of Sciences,Shanghai 201210,China)

Four genes have been reported to be involved in serine uptake inEscherichiacoli,which weresstT,cycA,sdaCandtdcC. In this study,combinatorial deletion of these genes was performed and effects on L-serine production and strain growth were investigated. The result revealed that,in all 11 multi-gene deletion mutants,sstT·sdaCdouble-gene deletion mutant,sstT·sdaC·tdcCandsstT·cycA·sdaCtriple-gene deletion mutants had higher L-serine production than the original strain and their L-serine production were 271.11,312.58 and 322.57 mg/L,respectively. Besides,thesstT·cycA·sdaC·tdcCquadruple-gene deletion mutant achieved the highest L-serine production of 450.58 mg/L,which was 6-fold when compared to that of the original strain. In addition,the cell growth of double-and triple-gene deletion mutants were similar or above to that of the original strain. But the cell growth of the quadruple-gene deletion mutant decreased remarkably,whose OD600was 28% lower than that of the original strain.

L-serine;uptake genes;strains growth;ability to produce L-serine

2017-02-27

石斌超(1991-)，男，碩士研究生，研究方向：代謝工程，E-mail:shibc@sari.ac.cn。

*通訊作者:張霞(1964-)，女，大學(xué)本科，教授，研究方向：植物資源與遺傳，E-mail:xiazh@shzu.edu.cn。

國(guó)家自然科學(xué)基金青年科學(xué)基金項(xiàng)目(31300048)。

TS201.3

:A

:1002-0306(2017)16-0106-07

10.13386/j.issn1002-0306.2017.16.021