歐陽婧孫園園唐澤民唐政山李放軍楊寅柯

（1. 湖南大學生物學院，長沙 410082；2. 湖南省人民醫(yī)院社會醫(yī)學部，長沙 410002）

慢病毒介導沉默PD-L1基因在乳腺癌細胞中的表達

歐陽婧1孫園園1唐澤民1唐政山1李放軍2楊寅柯1

（1. 湖南大學生物學院，長沙 410082；2. 湖南省人民醫(yī)院社會醫(yī)學部，長沙 410002）

構建含細胞程序性死亡因子配體1（PD-L1）基因的慢病毒載體三質粒體系，并檢測其在乳腺癌MDA-MB-231細胞中的表達情況。pMAGic 7.1慢病毒表達載體與質?！?.91和pVSVG用聚乙烯亞胺（PEI）共轉293T包裝病毒，感染并篩選獲得MDA-MB-231穩(wěn)轉細胞系，檢測PD-L1表達情況。（1）MDA-MB-231在3種乳腺癌細胞中PD-L1表達量最高；（2）三質粒轉染293T細胞48 h后熒光強度增強，達到90%以上；用病毒感染MDA-MB-231細胞，48 h獲得20%左右熒光強度；（3）經篩選的MDA-MB-231穩(wěn)轉細胞系在mRNA水平和蛋白水平低表達PD-L1，其中由pMAGic-sh1包裝的病毒干擾能力最強；（4）分別加入病毒后，干擾組細胞增殖能力下降，pMAGic-sh1干擾組細胞在加入病毒7 d后生長速度約為陰性對照的64.77%；（5）混合淋巴實驗顯示，sh-1干擾組的腫瘤抑制率為35.8%，是正常組的3.06倍，且干擾組的T淋巴細胞活性顯著增強。成功通過PEI轉染試劑建立了三質粒慢病毒包裝體系，該體系獲得的慢病毒可有效干擾乳腺癌MDA-MB-231細胞中PD-L1的表達量，所得的干擾細胞株細胞增殖能力下降，可增強T細胞增殖活性及腫瘤細胞殺傷活性。

乳腺癌；細胞程序性死亡因子配體1基因；慢病毒載體；聚乙烯亞胺；共轉染

乳腺癌是嚴重危害女性健康的主要惡性腫瘤，發(fā)病率占全身各種惡性腫瘤的7%-10%，幾乎每8例女性中就有1例會罹患此病［1］。研究表明，乳腺癌的發(fā)生與機體免疫應答反應相關，在乳腺癌組織內，程序性死亡因子配體PD-L1和CD28分子家族的抑制性受體在腫瘤免疫特異性T細胞上表達上調［2-4］。程序性死亡因子配體1（Programmed death ligant 1，PD-L1），是一種免疫抑制分子，它是程序性死亡因子（Programmed death 1，PD-1）的配體之一，它們共同組成的信號通路能傳導抑制性信號給T細胞，從而阻斷正常免疫應答的發(fā)生［5-6］。研究表明［7-8］，PD-1/PD-L1通路的激活是腫瘤免疫逃逸的一個重要機制。PD-L1與PD-1的結合可產生多種生物學作用，例如能夠抑制淋巴細胞的增殖和活化、抑制 CD4+T細胞向Th1和Th17細胞分化、抑制炎性細胞因子的釋放，這些都起到免疫負調控作用［9-10］。為探討乳腺癌中PD-L1免疫應答、細胞增殖與凋亡等相關通路機制以及特異性抑制腫瘤細胞PD-1/PD-L1通路的靶點，本研究擬在乳腺癌細胞中，通過表達RNA干擾的慢病毒系統(tǒng)，建立PD-L1表達下調的穩(wěn)定細胞株和陰性對照細胞株，旨為后續(xù)研究奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞系 人乳腺癌細胞株MDA-MB-231細胞、BT549細胞、MCF-7細胞來自實驗室儲存；人胚腎細胞293T來自湖南大學生物學院譚擁軍教授實驗室；DH5α感受態(tài)大腸桿菌由本實驗室自制；慢病毒載體pMAGic7.1、包裝質?！?.91、包裝膜蛋白顆粒質粒pVSVG來自湖南大學生物學院譚擁軍教授實驗室。

1.1.2 主要試劑 RPMI 1640培養(yǎng)基、DMEM培養(yǎng)基和胰酶購自GIBCO公司；胎牛血清購自Hyclone公司；Trizol購自Ambion公司；2×power Taq PCR Master Mix購自Bioteke Corporation公司；2×SYBR Green Mix購自TaKaRa公司；PD-L1引物和GAPDH內參引物由上海生物工程有限公司合成；PEI轉染試劑為ALDRICH公司產品；蛋白裂解液和BCA法蛋白濃度檢測試劑盒購自Sangon Biotech公司；PVDF膜購自Millipore公司；兔抗人PD-L1一抗購自Abcam公司；鼠抗人β-actin一抗購自Promega公司；兔二抗和鼠二抗購自GE公司；ECL化學發(fā)光顯影液購自Thermo公司；淋巴細胞分離液Histopaque-1077購自Sigma公司；絲裂霉素A購自Sigma公司；Con A（刀豆球蛋白A）購自Sigma公司；CCK8試劑盒。

1.2 方法

1.2.1 檢測3種乳腺癌細胞中PD-L1的表達量 取生長狀態(tài)良好處于對數生長期的MDA-MB-231，BT549和MCF-7細胞，冷PBS洗滌2次，加入TRIzol提取總RNA，取1 μg總RNA逆轉錄合成cDNA，以cDNA為模板進行PCR反應。Real-time PCR以人GAPDH作為內參，按Quant SYBR Green PCR試劑盒說明書操作，實時熒光定量基因擴增儀上擴增，反應結束后，用Bio-Rad CFX Manager 3.0軟件對數據進行分析。反應條件：95℃變性5 min；95℃ 10 s，60℃ 30 s，72℃ 20 s，40個循環(huán)。PD-L1和GAPDH引物序列，見表1。

表1 PD-L1和GAPDH引物序列

通過免疫印跡雜交（Western blot，WB）檢測感染細胞中PD-L1蛋白水平上的表達。RIPA裂解液和PMSF蛋白酶抑制劑按100∶1混合后的試劑裂解乳腺癌MD-MBA-231細胞，冰上裂解30 min，超聲破碎2 min，12 000 r/min 4℃離心30 min吸取上清提取蛋白，用BCA法測定蛋白濃度。配制聚丙烯酰胺凝膠，以總蛋白量50 μg/孔進行電泳分離蛋白，恒流300 mA濕轉PVDF膜，5%脫脂牛奶封閉，加一抗PD-L1（1∶1 000）、β-actin（1∶10 000），室溫孵育2 h，加HRP標記的二抗（1∶10 000），室溫孵育1 h，ECL化學發(fā)光顯影。

1.2.2 三質粒體系的構建及鑒定 對照PD-L1基因序列，設計多個RNA干擾靶點序列以及陰性對照序列（NG），分別設計并合成shRNA寡聚單鏈DNA，oligo序列見表2。

將合成好的引物用1×TE buffer溶解成20 μmol/L，互補的單鏈混合后在水浴鍋中95℃加熱5 min，自然冷卻，退火形成帶黏性末端的雙鏈DNA片段；用限制性內切酶Age I and EcoR I酶切pMAGic7.1質粒載體，用T4 DNA連接酶將上述DNA片段連接至pMAGic 7.1表達載體，連接產物轉化感受態(tài)大腸桿菌DH5α，同時設立空白對照。轉化菌液涂布平板，37℃過夜培養(yǎng)。次日從大腸桿菌平板挑取3-5個單克隆進行擴增培養(yǎng)，用表達載體通用引物5'-AGCGGATCTGACGGTTCACT-3'和shRNA 5'端引物進行菌落PCR鑒定目的片段。鑒定成功的菌液用QIAGEN公司質粒小量提取試劑盒提取質粒，酶切鑒定后，送至長沙擎科生物有限公司進行測序。

表2 PD-L1 shRNA和陰性對照oligo序列

1.2.3 慢病毒干擾載體的包裝及純化 應用QIAGEN公司無內毒素的質粒小量提取試劑盒提取pMAGic 7.1、△8.91和pVSVG用于轉染。轉染前24 h選擇生長狀態(tài)良好的293T細胞按1∶4傳代至100 mm細胞培養(yǎng)皿，24 h后細胞生長達到70%左右的生長密度時，用PEI轉染試劑進行轉染。用1 mL Opti-MEM培養(yǎng)基稀釋總共16 μg質粒（目的質粒pMAGic 7.1，△8.91、pVSVG按照4∶3∶2的比例），并另取1 mL Opti-MEM培養(yǎng)基稀釋48 μL PEI轉染試劑，然后將稀釋好的PEI試劑加入到質粒中，立即吸打混勻。室溫放置20 min后，將混勻的轉染液逐滴均勻加入293T細胞中，輕輕搖晃至混勻，5% CO2、37℃細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 h后，去除所有細胞上層液體，重新在培養(yǎng)皿中加入DMEM（含10%FBS）完全培養(yǎng)基，于5% CO2、37℃細胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。在換液48 h和96 h后，兩次收取細胞上層液體，0.22 μm濾頭過濾，即為病毒原液。

1.2.4 慢病毒感染乳腺癌231細胞實驗 人乳腺癌細胞MDA-MB-231培養(yǎng)于含RPMI 1640（10%FBS）完全培養(yǎng)基，37℃、5%CO2的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。轉染前一天選用對數生長期、生長狀態(tài)良好的細胞，取1×105個細胞/孔接種于24孔板中，使細胞覆蓋率達30%。第2天，棄去24孔板上清，按（1∶2）-（1∶3）的比例分別加入新鮮培養(yǎng)基和病毒液；空白對照只添加新鮮培養(yǎng)基。每組設置3個復孔，搖勻后置于37℃、5%CO2的細胞培養(yǎng)箱中孵育。48 h后棄去細胞上清，更換為RPMI 1640（含10%FBS）完全培養(yǎng)基。

1.2.5 感染細胞中PD-L1干擾效果的鑒定 通過RT-PCR檢測感染細胞中PD-L1 mRNA水平上的表達，通過Western Blot檢測感染細胞中PD-L1蛋白水平上的表達，具體實驗操作及數據處理步驟同1.2.1。

1.2.6 干擾病毒對乳腺癌細胞增殖的影響 取生長狀態(tài)良好、對數生長期的MDA-MB-231細胞，以5×103個細胞/孔接種于96孔板，37℃、5%CO2的細胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。第2天，棄去上清，按1∶2的比例加入新鮮培養(yǎng)基和病毒液；空白對照只添加新鮮培養(yǎng)基。每組設置3個復孔，搖勻后繼續(xù)培養(yǎng)。第3天分別加入20 μL MTT溶液（5 mg/mL），繼續(xù)培養(yǎng)4 h后，吸除原有培養(yǎng)液，加入150 μL 二甲亞砜DMSO，搖床上溫和震蕩10 min，酶標儀490 nm波長下測量每孔吸光度。接連檢測3 d。最后繪制細胞生長曲線圖。

1.2.7 干擾PD-L1穩(wěn)轉細胞株對T淋巴細胞活化與功能影響 根據淋巴細胞分離液說明書提取T淋巴細胞并計數；此節(jié)用干擾效果最好的sh-1組穩(wěn)轉細胞株和正常乳腺癌MDA-MB-231細胞作為研究材料。（1）CCK8法檢測T淋巴細胞的腫瘤殺傷能力。在96孔板上分別種干擾PD-L1穩(wěn)轉細胞株和正常乳腺癌MDA-MB-231細胞5×103個細胞，用絲裂霉素C（終濃度為100 μg/mL）37℃處理45 min，再加入5×104個T淋巴細胞，共培養(yǎng)24 h、72 h后棄上清重新加入完全培養(yǎng)基用CCK8法檢測OD值；以上實驗分組為：干擾組；干擾組+T淋巴細胞；正常組；正常組+T淋巴細胞。（2）CCK8法檢測T淋巴細胞活性。用干擾sh-1組穩(wěn)轉細胞株和正常乳腺癌細胞株以1×105鋪板24孔板，絲裂霉素C處理后加入1×106個T淋巴細胞，共培養(yǎng)24 h，取含T淋巴細胞的上清計數，以1×105鋪板96孔板，每組分刺激組與非刺激組兩組，刺激組用Con A（終濃度為25 μg/mL）于細胞培養(yǎng)箱中孵育72 h，非刺激組不加Con A，72 h后用CCK8試劑盒在450 nm處測OD值。結果以增生指數（Proliferation index，PI）表示，PI=刺激細胞的OD值/未刺激細胞的OD值［11］；以上實驗分組為干擾組；正常組。

1.2.8 統(tǒng)計分析 采用SPSS13.0統(tǒng)計軟件，兩個獨立樣本組件比較用t檢驗，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 PD-L1在人乳腺細胞及3種乳腺癌細胞的表達情況

對人乳腺細胞、人乳腺癌細胞MDA-MB-231細胞、BT549、MCF-7進行熒光定量PCR分析（圖1-A）和Western Blot分析（圖1-B），結果表明，PD-L1在乳腺癌MDA-MB-231中表達最高。

2.2 pMagic 7.0 shPD-L1載體構建

由4組轉化子涂平板挑單菌落進行菌落PCR鑒定（圖2），條帶明亮清晰無雜帶，從每組干擾轉化菌分別挑取兩對送去長沙擎科生物有限公司進行測序，經比對，重組克隆中插入的片段序列與所設計的oligo完全一致，表明目的條帶已成功插入，4個慢病毒載體構建成功。

2.3 慢病毒的包裝和感染

用構建好的4個質粒載體（3個干擾和1個陰性對照）分別轉染293T細胞，24 h后可觀察到熒光，48 h后熒光加強（90%以上），結果見圖3。收集轉染293T細胞48 h和96 h的濾后病毒原液感染正常的MDA-MB-231細胞，48 h后換為新鮮完全培養(yǎng)基，觀察并繼續(xù)培養(yǎng)，結果見圖4，顯微鏡用藍光激發(fā)后，可觀察到綠色熒光（約20%），表明慢病毒感染成功。

圖1 PD-L1在3種乳腺癌細胞中的表達水平（*P<0.05）

圖2 4個質粒載體菌落PCR結果

2.4 PD-L1慢病毒載體對乳腺癌細胞MD-MBA-231中PD-L1表達的影響

收集4種病毒感染的MD-MBA-231細胞，進行qPCR檢測（圖5-A）和Western Blot檢測（圖5-B），結果表明，干擾組MDA-MB-231細胞中PD-L1在mRNA水平和Western Blot中的表達均有明顯下降。2.5 四種慢病毒對乳腺癌細胞增殖的影響

分別用4種慢病毒感染正常生長良好的MDAMB-231乳腺癌細胞，以MTT法在酶標儀上測量細胞3 d的增殖情況，結果見圖7，其中第7天pMAGic-NG組的OD值為（0.721±0.001 9），pMAGic-sh1組的OD值為（0.467±0.002 0），pMAGic-sh2組的OD值為（0.553±0.002 1）pMAGic-sh3組的OD值為（0.578±0.001 6）。其中，pMAGic-sh1抑制癌細胞增殖的效率最高，此組細胞存活率為陰性對照組的64.77%。

圖3 四種質粒載體轉染293T細胞48 h的熒光顯微鏡觀察（×100）

圖4 四種慢病毒感染MDA-MB-231細胞48 h的熒光顯微鏡觀察（×100）

圖5 PD-L1在干擾組及陰性對照組細胞中的表達情況（*P<0.05）

圖6 四種慢病毒對MDA-MB-231細胞增殖的影響（*P<0.05）

2.6 干擾PD-L1穩(wěn)轉細胞株對T淋巴細胞活化與功能影響

淋巴混合實驗24 h和72 h后，用酶標儀測試各組OD值，實驗結果如表3所示，MDA-MB-231+T cells組與MDA-MB-231組相比具有顯著性差異（P<0.05）；sh-1組與sh-1+T cells組相比具有顯著性差異（P<0.05）。實驗數據處理由腫瘤細胞抑制率表示，腫瘤細胞抑制率=（腫瘤細胞OD值-相應加入T細胞組OD值）/腫瘤細胞OD值×100%。數據處理顯示，乳腺癌MDA-MB-231在24 h后的抑制率為5.26%，72 h后的抑制率為 11.7%；sh-1乳腺癌穩(wěn)轉細胞株在24 h后的抑制率為6.29%，與正常細胞的抑制率差別小；72 h后的抑制率為35.8%，為正常細胞抑制率的3.06倍，具有顯著性差異（P<0.05）。

表3 各組腫瘤細胞增殖情況

混合淋巴實驗24 h，Con A刺激72 h后，測試各組OD值，干擾組和正常組的T淋巴細胞增殖反應比較如表4所示。

表4 T淋巴細胞增殖反應

3 討論

程序性死亡因子配體1（Programmed death receptor 1 ligand 1，PD-L1），也被稱為CD274，屬于B7家族，可表達于T細胞、B細胞、巨噬細胞、樹突狀細胞、血管內皮細胞和胎盤合體滋養(yǎng)層細胞等多種細胞［12］。PD-L1是負性免疫調節(jié)分子中的一員，在特異性腫瘤免疫應答中起重要的負性調控作用，其高表達促使腫瘤細胞逃脫機體免疫系統(tǒng)監(jiān)視，從而造成免疫逃逸［13］。關于PD-1/PD-L1在腫瘤免疫逃逸中的機制研究已成為腫瘤免疫研究中的熱點。然而，PD-L1在不結合PD-1的情況下，可以誘導初始CD4+T細胞向Foxp3+感應T細胞轉變，這是外周免疫中抑制效應T細胞作用的關鍵所在。Addio等［14］發(fā)現(xiàn)，PD-L1能夠促進CD4+Foxp3-T細胞向CD4+Foxp3+ Treg的轉變。Liu等［15］發(fā)現(xiàn)，CD4+CD25+ Foxp3+ Treg的分化依賴于PD-L1所介導的信號途徑，肝樹突狀細胞表達的PD- L1水平越高，就能誘導出更多的Treg，從而維持機體對移植物的耐受作用。用單克隆抗體或siRNA 特異性阻斷PD-L1，可減少CD4+ CD25+Foxp3+ Treg的產生，并誘導Treg 凋亡［16-17］。這些研究表明，PD-L1通過增強Tregs上的Foxp3的表達來誘導Treg細胞的分化和維持其功能。

慢病毒（Lentivirus）載體是以HIV-1（人類免疫缺陷I型病毒）為基礎發(fā)展起來的基因治療載體。目前，它被廣泛應用于表達RNAi、基因治療等研究中，相對于腺病毒而言，無論細胞是否處于分裂期，慢病毒都對細胞具有較強的感染能力［18-19］。對于一些較難轉染的細胞，如原代細胞、干細胞和非分裂細胞等，使用慢病毒載體能大大提高目的基因或目的shRNA的轉導效率，且目的基因或目的shRNA整合到宿主細胞基因組的幾率大大增加，能夠比較方便快捷地實現(xiàn)目的基因或目的shRNA在細胞中的長期、穩(wěn)定表達［20-21］。在慢病毒載體的安全性方面，目前最新一代（第三代）慢病毒載體是一種自我失活的HIV-1來源載體，只含有HIV-1中的gag、pol、rev三個基因，由于去除了其余60%HIV-1基因組成分，因此父代病毒無法復制，載體本身只能將目的基因轉移給靶細胞，轉移完成后，病毒載體便喪失了病毒長末端重復的轉錄能力，減少了產生重組病毒的機會［22］。鑒于慢病毒載體的以上優(yōu)點以及良好的安全性，該研究應用慢病毒載體干擾技術，成功構建了沉默PD-L1的慢病毒表達載體，并篩選出穩(wěn)定表達的乳腺癌MDA-MB-231細胞株。在包裝病毒過程中，聚乙烯亞胺（Polyethylenimine，PEI）轉染293T細胞比實驗前期應用傳統(tǒng)的磷酸鈣法和脂質體Lipofectamine 2000轉染293T細胞效率更高，因此，本研究最終選用PEI轉染試劑包裝慢病毒。PEI是一種陽離子聚合物，除具有轉染效率高的優(yōu)點外，還具有價格低廉、操作簡單、適用范圍廣、重復性好及細胞毒性低等特點。

本實驗結果顯示，將具有高侵襲能力的乳腺癌MDA-MB-231細胞培育成沉默PD-L1的穩(wěn)轉細胞株后，細胞增殖能力明顯下降；淋巴細胞增殖活性增強，腫瘤細胞活性收到抑制。如果患有腫瘤的機體（高表達PD-L1）能夠降低PD-L1的表達，那么PD-1/PD-L1信號通路將被抑制，機體將扭轉腫瘤細胞逃脫免疫監(jiān)視的局面，最終使得腫瘤細胞被免疫系統(tǒng)識別并消除。然而，PD-1/PD-L1通路在正常機體運行中的負性調節(jié)作用在機體外周免疫中發(fā)揮重要作用，可防止機體自身免疫性疾病的發(fā)生，且該通路對器官移植病人也起到避免移植物發(fā)生免疫排斥的關鍵性作用，那么，如何特異性靶向腫瘤細胞的PD-1/PD-L1通路將成為一大難題。

4 結論

本研究檢測了PD-L1在3種乳腺癌細胞中的表達情況，確定以表達量最高的乳腺癌MDA-MB-231細胞作為研究材料，通過雙酶切構建pMAGic目的質粒，與質?！?.91和pVSVG用PEI轉染試劑共轉染293T細胞包裝病毒，并用此病毒感染并篩選得到穩(wěn)轉MDA-MB-231細胞，檢測細胞增殖情況以及PD-L1在mRNA水平和蛋白水平的表達情況，并通過腫瘤細胞于T淋巴細胞的混合淋巴實驗檢測T淋巴細胞活性與腫瘤細胞增殖活性，最終成功獲得了有效干擾PD-L1表達量的慢病毒體系和可穩(wěn)定低表達PD-L1、細胞增殖能力明顯降低、可增強T淋巴細胞增殖活性的乳腺癌MDA-MB-231細胞系。

［1］Ferlay J, Steliarova-Foucher E, Lortet-Tieulent J, et al. Cancer incidence and mortality patterns in Europe：estimates for 40 countries in 2012［J］. Eur J Cancer, 2013, 49（6）：1374-1403.

［2］Mauricio Z, Baptista D, et al. Prognostic significance of PD-L1 and PD-L2 in breast cancer［J］. Human Pathlogy, 2016, 47（1）：78-84.

［3］Li B, VanRoey M, Wang C, et al. Anti- programmed death-1 synergizes with granulocyte macrophage colony-stimulating factorsecreting tumor cell immunotherapy providing therapeutic benefit to mice with established tumors［J］. Clin Cancer Res, 2009, 15（5）：1623-1634.

［4］Cimino-Mathews A, Thompson E, Taube JM, et al. PD-L1（B7-H1）expression and the immune tumor microenvironment in primary and metastatic breast carcinomas［J］. Human Pathology, 2016, 47（1）：52-63.

［5］Dai S, Jia R, Zhang X, et al. The PD-1/PD-Ls pathway and autoimmune diseases［J］. Cellular Immunology, 2014, 290（1）：72-79.

［6］Gianchecchi E, Delfino DV, Fierabracci A. Recent insights into the role of the PD-1/PD-L1 pathway in immunological tolerance and autoimmunity［J］. Autoimmunity Reviews, 2013, 12（11）：1091-1100.

［7］Iwai Y, Ishida M, Tanaka Y, et al. Involvement of PD-L1 on tumor cells in the escape from host immune system and tumor immunotherapy by PD- L1 blockade［J］. Proc Natl Acad Sci USA, 2002, 99（19）：12293-12297.

［8］Dong H, Strome SE, Salomao DR, et al. Tumor-associated B7-H1 promotes T-cell apotosis：a potential mechanism of immune evasion［J］. Nat Med, 2008, 8（8）：793-800.

［9］Dulos J, Carven GJ, van Boxtel SJ, et al. PD-1 blockade augments Th1 and Th17 and suppresses Th2 responses in peripheral blood from patients with prostate and advanced melanoma cancer［J］. J Immunother, 2012, 35（2）：169-178.

［10］Marzec M, Zhang Q, Goradia A, et al. Oncogenic kinase NPM/ALK induces through STAT3 expression of immunosuppressive protein CD274（PD-L1, B7-H1）［J］. Proc Natl Acad Sci USA, 2008, 105（52）：20852-20857.

［11］Tuchscherer M, Kanitz E, Otten W, et al. Effects of prenatal stress on cellular and humoral immune responses in neonatal pigs［J］. Veterinary Immunology and Immunopathology, 2002, 86（3）：195-203.

［12］Okudaira K, Hokari R, Tsuzuki Y, et al. Blockade of B7-H1 or B7-DC induces an anti-tumor effect in a mouse pancreatic cancer model［J］. Int J Oncol, 2009, 35（4）：741-749.

［13］Ghebeh H, Mohammed S, Al-Omair A, et al. The B7-H1（PD-L1）T lymphocyte-inhibitory molecule is expressed in breast cancer patients with infiltrating ductal carcinoma：correlation with important high-risk prognostic factors［J］. Neoplasia, 2006, 8（3）：190-198.

［14］D’Addio F, Riella LV, Mfarrej BG, et al. The link between the PD-L1 costimulatory pathway and Th17 in fetomaternal tolerance［J］. J Immunol, 2011, 187（9）：4530-4541.

［15］Liu H, Bakthavatsalam R, Meng Z, et al. PD-L1 signal on liver dendritic cells is critical for Foxp3+CD4+CD25 + Treg and liver tolerance induction in mice［J］. Transplant Proc, 2013, 45（5）：1853-1855.

［16］Franceschini D, Paroli M, Francavilla V, et al. PD-L1 negatively regulates CD4+ CD25+Foxp3+Tregs by limiting STAT-5 phosphorylation in patients chronically infected with HCV［J］. J Clin Invest, 2009, 119（3）：551-564.

［17］Beswick EJ, Pinchuk IV, Das S, et al. Expression of the programmed death ligand 1, B7-H1, on gastric epithelial cells after Helicobacter pylori exposure promotes development of CD4+CD25+Foxp3+ regulatory T cells［J］. Infect Immune, 2007, 75（9）：4334-4341.

［18］Sumimoto H, Kawakami Y. Lentiviral vector-mediated RNAi and its use for cancer research［J］. Future Oncol, 2007, 3（6）：655-664.

［19］Katayama K, Koichiro W, Miyoshi H, et al. RNAinterfering approach forclarifying the PPAR pathway using lentiviral vectors expressing short hairpin RNA［J］. FEBS Letters, 2004, 560（3）：178-182.

［20］李躍萍, 宋麗萍, 邱曙東, 等. 慢病毒載體在腫瘤基因治療中的應用［J］. 現(xiàn)代腫瘤醫(yī)學, 2006, 14（12）：1615-1617.

［21］Naldini L, Blomer U, Gallay P, Ory D, Mulligan R, et al. In vivo gene delivery and stable transduction of nondividing cells by a lentiviral vector［J］. Science, 1996, 272（5259）：263-267.

［22］羅望, 張泓, 許淼, 顧林, 等. 慢病毒——基因轉移的潛在新載體［J］. 江蘇藥學與臨床研究, 2006, 14（6）：366-371.

（責任編輯 狄艷紅）

Low Expression of PD-L1 Gene in Human Breast Carcinoma Cell Mediated by Lentiviral Vector

OUYANG Jing1SUN Yuan-yuan1TANG Ze-min1TANG Zheng-shan1LI Fang-jun2YANG Yin-ke1
（1.College of Biology，Hunan University，Changsha 410082；2. Department of Social Medicine，Hunan Province People’s Hospital，Changsha 410002）

This study aims at constructing three-plasmid system of the lentiviral vector carrying the programmed death ligant 1（PD-L1）gene and investigating the expression of PD-L1 in human breast carcinoma cell MDA-MB-231. A pMAGic 7.1 recombinant lentiviral expression vector，plasmid △8.91 and pVSVG were co-transfected into 293T cells for packaging virus，using polyethylenimine（PEI）as transfected solution. The lentiviral products were added to infect and extract stably-expressed MDA-MB-231 cells，and finally the PD-L1 expression of mRNA and protein levels were detected. The results showed as followings：（1）The PD-L1 expression in MDA-Mb-231 was the highest，compared with other two breast cancer cells. （2）At 48 h after co-transfecting three plasmids，the fluorescence intensity reached over 90%. Moreover，the fluorescence intensity reached almost 20% at 48 h after using virus infecting MDA-MB-231 cells. （3）There were low PDL1 expressions of mRNA and protein levels in the stably-expressed MDA-MB-231 cell lines，and the pMAGic-sh1 had the best effect on it among the three plasmids. （4）After adding viruses，the cell proliferation declined in interfering groups，and the cell proliferation rate in the pMAGic-sh1 interfering groups was 64.77% at 7 days of adding virus compared with the negative group. （5）Mixed lymphatic experiments showed that the tumor inhibition rate of sh-1 group was 35.8%，which was 3.06 times of that in normal group，and the T lymphocyte proliferation rate significantly enhanced. In conclusion，the three-plasmid system of lentiviral vector containing PD-L1 gene using PEI reagent is successfully established. The study demonstrates that the PD-L1 expression of mRNA and protein is lower through the virus infecting system，and interfering groups have lower cell proliferation rate and they enhance the T lymphocyte proliferation rates and its ability to kill tumor cells.

breast cancer；programmed death factor ligant 1 gene；lentiviral vector；PEI；co-transfected

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2017-0181

2017-03-09

湖南大學“985工程”專項資金資助項目（531109020011）

歐陽婧，女，碩士研究生，研究方向：腫瘤免疫機制；E-mail：oyjing@hnu.edu.cn

楊寅柯，男，博士，教授，研究方向：細胞毒理機制，細胞移植，干細胞分化及調控機制等，E-mail：ykyang99@hnu.edu.cn；李放軍，女，主任護師，研究方向：細胞分化機制及其調控，E-mail：690263089@qq.com