陳春野劉劍朱瑞李姝璇葉江輝王瑋潘德全徐飛海程通夏寧邵

（1. 廈門大學公共衛(wèi)生學院 分子疫苗學與分子診斷學國家重點實驗室 國家傳染病診斷試劑與疫苗工程技術研究中心，廈門 361102；2. 廈門萬泰凱瑞生物技術有限公司，廈門 361003）

大腸桿菌可溶性表達人鱗狀上皮細胞癌抗原的制備及應用

陳春野1劉劍1朱瑞1李姝璇1葉江輝1王瑋1潘德全1徐飛海2程通1夏寧邵1

（1. 廈門大學公共衛(wèi)生學院 分子疫苗學與分子診斷學國家重點實驗室 國家傳染病診斷試劑與疫苗工程技術研究中心，廈門 361102；2. 廈門萬泰凱瑞生物技術有限公司，廈門 361003）

旨在建立基于大腸桿菌表達系統(tǒng)的高效可溶性表達人鱗狀上皮細胞癌抗原（SCCAg）方法，獲得具有較好活性的重組SCCAg抗原并應用于建立抗原檢測方法?；趐GEX-6P-1載體和大腸桿菌E. coli ER2566菌株開展重組SCCAg抗原可溶性表達純化方法研究，評價純化抗原活性，篩選特異性單克隆抗體，初步建立并評價SCCAg抗原檢測方法。結果顯示，pGEX-6P-1載體和E. coli ER2566菌株可用于建立較高效的可溶性表達和純化SCCAg抗原的方法，獲得了具有較高純度和活性的重組SCCAg抗原，篩選獲得特異性單克隆抗體并初步建立了SCCAg管式化學發(fā)光檢測方法。建立了有效的基于大腸桿菌表達系統(tǒng)的可溶性表達和純化SCCAg的方法。

人鱗狀上皮細胞癌抗原；大腸桿菌表達系統(tǒng)；可溶性表達；單克隆抗體

鱗狀上皮細胞癌抗原（Squamous cell carcinoma antigen，SCCAg）最早發(fā)現(xiàn)于子宮頸癌組織，包括兩種同源分子SCCA1和SCCA2，二者具有92%的氨基酸同源性和高度相似的抗原表位特征，均屬于絲氨酸蛋白酶抑制劑家族［1-4］。研究顯示，SCCAg是一種重要的腫瘤標記物，與多種器官的鱗狀上皮細胞癌有較密切關系［5-8］。血清SCCAg水平可用于有效輔助宮頸癌、頭頸部癌、肺非小細胞肺癌、結直腸癌等多種鱗狀上皮細胞癌的臨床診斷、病情監(jiān)測和預防判斷［5-13］。獲得較高純度和活性的SCCAg抗原是建立臨床檢測方法及開展相關基礎研究的重要基礎。

目前，SCCAg抗原主要通過天然提取和重組表達兩種方式獲得。天然提取方法是從人源組織中進行分離和純化，該方法需要使用較大量的人源樣品，有倫理限制，成本高，難于獲得較大量的抗原。重組表達方法目前較多使用真核表達系統(tǒng)，盡管真核表達系統(tǒng)解決了倫理限制和部分降低了生產成本，但存在表達量偏低、耗時長、表達和純化方法較為復雜等特點［14-15］。大腸桿菌原核表達系統(tǒng)具有操作簡便和表達量較高的優(yōu)點，在基因工程中具有突出優(yōu)勢。目前，雖然已有應用大腸桿菌表達系統(tǒng)開展SCCAg抗原表達的研究，但多以包涵體的表達形式為主，缺乏可溶性表達的報道［16-17］。研究顯示，包涵體是一種錯誤折疊的蛋白形式，重組抗原可溶性表達可更有利于保持抗原的天然構象。因此，本研究擬探索建立基于大腸桿菌表達系統(tǒng)的SCCAg抗原可溶性表達和純化方法。選擇有利于目標抗原可溶性表達的表達載體和表達菌株是探索實現(xiàn)重組抗原可溶性表達的重要方法。多項研究已顯示，攜帶GST（谷胱甘肽S轉移酶）融合表達標簽的pGEX-6P-1載體與E. coli ER2566菌株在重組抗原可溶性表達方面具有較好的表現(xiàn)［18-24］，但尚沒有研究將兩者聯(lián)合應用于SCCAg抗原表達。為此，本研究即探索將pGEX-6P-1載體和E. coli ER2566菌株應用于建立重組SCCAg抗原可溶性表達和純化方法的可行性，開展抗原活性比較及篩選檢測抗體并應用于建立SCCAg管式化學發(fā)光檢測方法。

1 材料與方法

1.1 材料

限制性內切酶、T4 DNA連接酶、Taq DNA聚合酶和pMD18-T載體購自TaKaRa公司。弗式完全佐劑和不完全佐劑購自Sigma公司。RPMI1640培養(yǎng)基購自GIBCO公司。胎牛血清（FBS）購自PAA公司。表達載體質粒pGEX-6P-1、大腸桿菌表達菌株E.coli DH5α和E. coli ER2566為本實驗室保存，小鼠骨髓瘤細胞SP2/0亦為本實驗室保存。SPF級BABL/c小鼠和F1小鼠購自上海斯萊克實驗動物有限公司，飼養(yǎng)于廈門大學實驗動物中心。其他常規(guī)藥品試劑購于國藥集團。分別攜帶有全長SCCA1與SCCA2基因序列的pFB質粒由本實驗室構建及保存［25］。美國雅培公司的SCCAg抗原檢測試劑（批號：62111LP06）、人源SCCAg抗原標準品和SCCAg陽性血清盤由廈門萬泰凱瑞生物技術有限公司提供?？笻IS標簽的鼠單克隆抗體（HT501-02）購自北京全式金生物技術有限公司。

1.2 方法

1.2.1 重組SCCAg抗原表達載體構建 分別以攜帶有全長SCCA1與SCCA2基因序列的pFB質粒為模板，以引物（pGEX-SCCAg-SalI-F：5'-ACGCGTCG ACAATTCACTCAGTGAAGCCAAC-3'；PGEX-SCCAg-XhoI-HIS-R：5' -ATACCGTCTAAGAGTAGGGGCGTG GTAGTAGTAGTAGTAATTGAGCTCGCC-3'）分別擴增獲得SCCA1與SCCA2全長基因，PCR產物經回收后分別連接pMD18-T載體，經限制性內切酶Sal I/ Xho I處理后連接到已經用相同限制性內切酶處理的pGEX-6P-1載體中，經測序鑒定后，分別獲得SCCA1和SCCA2抗原的重組表達載體pGEX-SCCA1和pGEX-SCCA2。

1.2.2 重組SCCAg抗原的表達與純化 重組表達載體轉化E. coli ER2566感受態(tài)菌株，37℃擴增至OD600為1.5，之后將培養(yǎng)溫度降至特定溫度并添加IPTG（0.2-0.6 mmol/L）進行5-8 h的誘導表達。離心（7 000×g，10 min）收集菌體，以緩沖液（30 mmol/L咪唑，20 mmol/L Tris）重懸菌體，在冰水浴條件下使用超聲破碎儀對菌體進行破碎。破碎后的菌液離心（25 000×g，20 min）取上清。利用Ni+親和層析柱對超聲上清進行親和層析純化（平衡緩沖液：30 mmol/L咪唑，20 mmol/L Tris；核酸沖洗液：1 mol/L NaCl，20 mmol/L Tris；洗脫液：250 mmol/L咪唑，20 mmol/L Tris），收集洗脫峰并透析至PBS中。使用PreScission蛋白酶切掉重組抗原上的GST標簽，過GST親和層析柱，收集穿透峰并透析至PBS中。純化抗原經SDS-PAGE鑒定后保存于-20℃中。

1.2.3 單克隆抗體制備 將純化的重組SCCA1和SCCA2抗原以1∶1質量比例混合，以弗式完全佐劑乳化后采用皮下多點注射方式免疫6-8周齡的SPF級雌性BALB/c小鼠5只（總劑量100 μg/只），分別于第2、4周進行加強免疫。初次免疫采用完全弗氏佐劑，加強免疫采用不完全弗氏佐劑。每次免疫前和免疫全部完成后2周采集血清用間接ELISA方法檢測抗體滴度。應用常規(guī)的小鼠雜交瘤制備單克隆抗體技術，以PEG 4000為融合劑，將小鼠脾臟細胞與SP2/0骨髓瘤細胞按5∶1比例融合，在含HAT的1640選擇培養(yǎng)基中培養(yǎng)。以純化的重組SCCAg抗原作為包被抗原，辣根過氧化物酶（HRP）標記的羊抗鼠抗體為二抗，應用間接ELISA方法檢測融合細胞培養(yǎng)上清。通過有限稀釋法對陽性克隆孔進行多輪克隆化。將單克隆抗體細胞注射入F1小鼠腹腔誘導腹水，使用硫酸銨鹽析法和Protein A親和層析法對小鼠腹水進行純化。純化后的單克隆抗體測定濃度后保存于-20℃。

1.2.4 間接ELISA方法 將重組SCCAg用CB緩沖液（pH9.6）進行稀釋，按100 ng/孔包被在96孔微孔板上，放置于37℃溫箱中孵育2 h；每孔加入200 μL含有2%明膠的PB緩沖液并放置于37℃溫箱中孵育2 h，甩干后真空密封保存?zhèn)溆?。檢測時每孔加入50 μL雜交瘤細胞上清，放置于37℃溫箱中孵育30 min，經1×PBST清洗5次，吸干多余的液體后加入100 μL HRP標記的羊抗鼠抗體（1∶5 000）作為二抗并放置于37℃中孵育，30 min后用1×PBST清洗5次，吸干多余的液體后加入100 μL顯色液于37℃溫箱中孵育15 min，加入50 μL終止液后在微孔酶標儀上讀值。

1.2.5 化學發(fā)光免疫分析方法（CLIA） 按照文獻報道方法將單克隆抗體分別標記磁珠和吖啶酯［26］。將50 μL的檢測樣品和50 μL標記了抗體的磁珠緩沖液加入U型微孔板中，貼上封板膜并放至37℃恒溫箱內孵育15 min，之后用磁力板架吸附微孔板中的磁珠，PBST清洗3遍后加入吖啶酯標記的抗體緩沖液50 μL，37℃孵育10 min后用PBST清洗3遍，將磁珠轉移至發(fā)光管中并加入100 μL的激發(fā)液A，加入100 μL激發(fā)液B后上機（全自動微粒子化學發(fā)光免疫分析儀）檢測發(fā)光值。

1.2.6 配對實驗 將單克隆抗體標記辣根過氧化酶（HRP），同時將單克隆抗體包被到96孔ELISA微孔板上，人源SCCAg稀釋至濃度為1 ng/mL。單克隆抗體兩兩配對對稀釋好的人源SCCAg抗原進行檢測，將OD讀值大于1的單克隆抗體配對組合定為高反應配對，將OD讀值介于0.1和1之間的單克隆抗體配對組合定為中等反應配對，將OD讀值小于0.1的單克隆抗體配對組合定義為低反應配對。

1.2.7 檢測靈敏度的分析 依照《體外診斷試劑分析性能評估系列指導原則》中的方法對檢測試劑進行檢測靈敏度分析。檢測試劑對梯度稀釋的SCCAg標準品進行檢測并繪制劑量反應曲線，對0水平校準品進行20次重復測定計算檢測靈敏度。

1.2.8 SDS-PAGE方法 配制12%的聚丙烯酰胺凝膠，凝固后放入電泳槽中加滿電泳液，取50 μL的樣品加入10 μL的6×含有還原劑的樣品緩沖液，沸水浴10 min后上樣，電泳結束后用考馬斯亮藍染色液染色15-30 min，經KCl溶液脫色后進行樣品分析。

1.2.9 Western-blot方法 取50 μL樣品進行SDSPAGE分析，電泳結束后通過電轉儀將重組抗原轉至硝酸纖維素膜上，5%脫脂奶封閉2 h后加入抗HIS標簽的鼠抗（1∶1 000）室溫孵育1 h，TNT漂洗5遍后加入GAM-HRP（1∶5 000）作為二抗，室溫孵育45 min后用TNT漂洗5遍并進行化學發(fā)光顯色。

2 結果

2.1 重組SCCAg抗原可溶性表達與純化方法建立

將SCCA1和SCCA2全長基因分別克隆入pGEX-6P-1載體構建獲得重組表達質粒pGEXSCCA1和pGEX-SCCA2。將重組表達質粒分別轉化E. coli ER2566感受態(tài)菌株，并分別在不同的溫度條件下進行誘導表達。SDS-PAGE顯示，在不同誘導溫度條件下SCCA1和SCCA2的表達菌株在75 kD的位置均有目的表達條帶，其分子量與預期的融合有GST標簽的SCCAg抗原的大小相符，并且均能夠以可溶性形式存在于超聲裂解上清中，不同誘導溫度的抗原表達量無顯著差異。該結果說明，采用pGEX-6P-1載體和E. coli ER2566菌株可實現(xiàn)SCCA1和SCCA2抗原的可溶性表達。通過進一步優(yōu)化IPTG溶度、誘導溫度和誘導時間，本研究獲得了較優(yōu)的誘導可溶性表達SCCA1和SCCA2抗原的條件為0.2 mmol/L IPTG和37℃下誘導表達8 h。本研究應用親和層析純化方法獲得了純化的SCCA1和SCCA2重組抗原，SDS-PAGE和Western blot分析（圖1）顯示，純化的SCCA1和SCCA2重組抗原具有較好的純度，其分子量約為48 kD，與預期大小相符。

圖1 重組SCCAg的SDS-PAGE和Western Blot分析

2.2 重組SCCAg抗原的活性評價

本研究應用目前臨床上主要使用的SCCAg檢測試劑對比了本研究表達純化獲得重組抗原與人源SCCAg抗原的反應活性，分別將表達純化獲得SCCA1抗原、SCCA2抗原和人源SCCAg抗原進行系列梯度稀釋，用SCCAg檢測試劑分別檢測其反應活性。結果（圖2）顯示，本研究獲得的重組SCCA1抗原、SCCA2抗原與對照的人源SCCAg抗原均具有良好的反應性，檢測試劑對其的檢測靈敏度分別為2.14 ng/mL、1.06 ng/mL和1.40 ng/mL。本研究獲得的重組SCCAg抗原具有與人源抗原相當?shù)姆磻钚浴?/p>

圖2 雅培試劑檢測SCCAg標準品和重組SCCAg

2.3 重組SCCAg抗原應用于單克隆抗體制備

本研究利用純化的重組SCCA1和SCCA2抗原免疫免疫BALB/c小鼠5只，并進一步制備了抗SCCAg的特異性單克隆抗體。應用間接ELISA方法分別檢測免疫后不同時間點小鼠多抗血清與重組SCCA1和SCCA2抗原的反應活性。結果（圖3）顯示，小鼠血清對重組SCCA1和SCCA2抗原均具有較好的反應活性，免疫程序完成后血清的反應活性均在1∶50 000以上。該結果顯示了本研究獲得的重組SCCAg抗原具有良好的免疫原性。本研究進一步篩選獲得了80株同時對SCCA1和SCCA2抗原具有反應活性的單克隆抗體。

圖3 SCCAg免疫小鼠多抗血清監(jiān)測

2.4 SCCAg管式化學發(fā)光檢測方法的初步建立

通過配對實驗檢測人源SCCAg抗原獲得29組OD值讀值較高的單克隆抗體配對組合（圖4-A），其中兩組單克隆抗體配對（7F10/4H8-HRP和12F6/7E2-HRP）的檢測靈敏度較優(yōu)（圖4-B）。進一步應用17份確證陽性人血清標本對上述兩種配對方法進行評價，結果（圖4-C）顯示，單克隆抗體7F10與SAE標記的單克隆抗體4H8的組合具有更優(yōu)的檢測性能。本研究即以之為基礎初步建立了SCCAg抗原的管式化學發(fā)光檢測方法。

2.5 SCCAg管式化學發(fā)光檢測方法的初步評價

對新建立的檢測方法的性能進行了初步評價。結果（圖5-A）顯示，該檢測方法對人源SCCAg抗原的檢測靈敏度為0.15 ng/mL，達到現(xiàn)有臨床主流SCCAg檢測試劑水平；對20份確證陰性人血清標本均檢出陰性，特異性為100%。本研究同時應用該方法與對照試劑平行對30份確證陽性人血清標本進行了檢測，結果（圖5-B）所示，上述兩種檢測方法獲得的檢測結果具有良好的相關性（R2=0.9953）。上述結果說明，本研究建立的SCCAg檢測方法性能較好，與對照主流試劑相當。

圖4 SCCAg管式化學發(fā)光檢測方法的建立

圖5 SCCAg管式化學發(fā)光檢測方法的初步評價

3 討論

本研究以pGEX-6P-1載體和E. coli ER2566菌株為基礎建立了重組SCCAg抗原的原核表達純化方法，該方法可實現(xiàn)重組SCCAg在原核表達系統(tǒng)中的可溶性表達，且制備獲得的重組SCCAg抗原具有較好的純度和活性。在已報道的應用原核系統(tǒng)表達SCCAg抗原的研究中，SCCAg抗原主要以包涵體形式表達［16，17］。對比分析顯示，本研究方法與已報道方法在目標抗原基因序列和總體表達策略上并無顯著差別，較主要的差別在于表達菌株和表達載體。此前研究中使用的菌株均為E. coli BL21，表達載體包括pGEX-4T-1［16］、pET-32a［16］和pET-28b［17］；本研究采用的菌株為E. coli ER2566，表達載體為pGEX-6P-1。其中，pET-32a為6×His-Trx（6組氨酸-硫氧還蛋白）標簽，pET-28b為6×His標簽，pGEX-4T-1與本研究使用的pGEX-6P-1類似均為GST標簽，但此前研究顯示pGEX-4T-1載體在E. coli BL21中也未能實現(xiàn)SCCAg抗原的可溶性表達［16］。因此分析顯示，采用GST為融合表達標簽并以E. coli ER2566為表達菌株是本研究實現(xiàn)可溶性表達SCCAg抗原的重要特征。其詳細機制有待后續(xù)研究進一步揭示。本研究建立的SCCAg抗原原核表達方法有利于避免天然提取抗原方法存在的人組織來源問題，進而降低原料制備成本。同時原核表達系統(tǒng)具有擴增速度快、培養(yǎng)操作簡單等特點，因此相比真核表達系統(tǒng)和天然提取抗原，使用原核表達系統(tǒng)制備重組SCCAg可較方便、快捷地獲取大量抗原，從而為SCCAg檢測試劑的研發(fā)奠定良好基礎。

化學發(fā)光檢測技術具有檢測范圍廣、檢測靈敏度高、無放射性廢物以及容易自動化等優(yōu)點，已被廣泛應用于常規(guī)的臨床檢測以及醫(yī)療和生化研究中。目前使用的主流SCCAg化學發(fā)光檢測試劑多為雅培、羅氏等進口試劑，因此研制具有自主產權的SCCAg化學發(fā)光檢測試劑對于降低國民醫(yī)療費用，提高診斷試劑的市場競爭力具有較為重要的意義。本研究從6 400組單克隆抗體配對組合中篩選獲得了一組對血清SCCAg具有良好檢測性能的單克隆抗體配對7F10和4H8。該配對的檢測靈敏度與目前臨床上應用較廣的雅培SCCAg檢測試劑相當，且二者檢測結果具有良好的相關性。

4 結論

本研究首次將pGEX-6P-1載體和E. coli ER2566菌株聯(lián)合應用重組SCCAg抗原的表達與純化，應用原核表達系統(tǒng)高效表達了全長、可溶的重組SCCAg抗原，經驗證其具有純度較高、活性較好的優(yōu)點，并應用于SCCAg診斷試劑研發(fā)獲得了檢測性能與國外試劑盒水平相當?shù)膯慰寺】贵w配對。

［1］Kato H, Torigoe T. Radioimmunoassay for tumor antigen of human cervical squamous cell carcinoma［J］. Cancer, 1977, 40（4）：1621-1628.

［2］Schneider SS, Schick C, Fish KE, et al. A serine proteinase-inhibitor locus at 18q21. 3 contains a tandem duplication of the human squamous-cell carcinoma antigen gene［J］. Proc Natl Acad Sci USA, 1995, 92（8）：3147-3151.

［3］Schick C, Kamachi Y, Bartuski AJ, et al. Squamous cell carcinoma antigen 2 is a novel serpin that inhibits the chymotrypsin-likeproteinases cathepsin G and mast cell chymase［J］. Journal of Biological Chemistry, 1997, 272（3）：1849-1855.

［4］Schick C, Pemberton PA, Shi GP, et al. Cross-class inhibition of the cysteine proteinases cathepsins K, L, and S by the serpin squamous cell carcinoma antigen 1：a kinetic analysis［J］. Biochemistry, 1998, 37（15）：5258-5266.

［5］Eibling DE, Johnson JT, Wagner RL, et al. SCC-RIA in the diagnosis of squamous cell carcinoma of the head and neck［J］. Laryngoscope, 1989, 99（2）：117-124.

［6］Sanchez De Cos J, Masa F, de la Cruz JL, et al. Squamous cell carcinoma antigen（SCC Ag）in the diagnosis and prognosis of lung cancer［J］. Chest, 1994, 105（3）：773-776.

［7］Williams M, Swampillai A, Osborne M, et al. Squamous cell carcinoma antigen：a potentially useful prognostic marker in squamous cell carcinoma of the anal canal and margin［J］. Cancer, 2013, 119（13）：2391-2398.

［8］Yamanaka N, Himi T, et al. Soluble immune complexes and squamous cell carcinoma-related antigens in patients with head and neck cancer［J］. Cancer, 1988, 62（9）：1932-1938.

［9］Kato H, Tamai K, Morioka H, et al. Tumor-antigen TA-4 in the detection of recurrence in cervical squamous cell carcinoma［J］. Cancer, 1984, 54（8）：1544-1546.

［10］Brioschi PA, Bischof P, Delafosse C, et al. Squamous-cell carcinoma antigen（SCC-A）values related to clinical outcome of pre-invasive and invasive cervical carcinoma［J］. Int J Cancer, 1991, 47（3）：376-379.

［11］Kato H, Miyauchi F, Morioka H, et al. Tumor antigen of human cervical squamous cell carcinoma. Correlation of circulating levels with disease progress［J］. Cancer, 1979, 43（2）：585-590.

［12］Kato H, Morioka H, Tsutsui H, et al. Value of tumor-antigen（TA-4）of squamous cell carcinoma in predicting the extent of cervical cancer［J］. Cancer, 1982, 50（7）：1294-1296.

［13］Kato H, Tamai K, Nagaya T, et al. The use of a tumor antigen TA-4 for the management of squamous cell carcinoma［J］. Cancer Detection & Prevention, 1985, 8（1-2）：155.

［14］范翠英, 馮利興, 樊金玲, 等. 重組蛋白表達系統(tǒng)的研究進展［J］. 生物技術, 2012, 22（2）：76-80.

［15］陳曉娟, 閆少春, 邵國. 蛋白表達系統(tǒng)的研究進展［J］. 包頭醫(yī)學院學報, 2014（3）：142-143.

［16］于華實, 孫曉琳, 等. 鱗狀細胞癌抗原SCCA基因的構建、表達及鑒定［J］. 現(xiàn)代生物醫(yī)學進展, 2013, 13（18）：3420-3423.

［17］Butvilovskaya VI, Tsybulskaya MV, Tikhonov AA, et al. Preparation of recombinant serpins B3 and B4 and investigation of their specific interactions with antibodies using hydrogel-based microarrays［J］. Molecular Biology, 2015, 49（5）：705-713.

［18］ de Almeida Ramos D, Miani M, et al. Production and characterization of a Brazilian candidate antigen for Hepatitis E Virus genotype 3 diagnosis［J］. FEMS Microbiol Lett. , 2016, 363（5）：fnw021.DOI：10. 1093/femsle/fnw021. Epub 2016 Jan 31.

［19］ Li X, Xu J, et al. Vaccination with recombinant flagellar proteins FlgJ and FliN induce protection against Brucella abortus 544 infection in BALB/c mice［J］. Vet Microbiol, 2012, 161（1-2）：137-144.

［20］Lin CC, Liu TT, Kan SC, et al. Production of D-hydantoinase via surface display and self-cleavage system［J］. J Biosci Bioeng, 2013, 116（5）：562-566.

［21］Ren LQ, Liu W, Wi WB, et al. Peptidylprolyl cis/trans isomerase activity and molecular evolution of vertebrate Cyclophilin A［J］. Yi Chuan, 2016, 38（8）：736-745.

［22］Wu X, Liu Q, He J, et al. Preparation and characterization of a monoclonal antibody against the core protein VP7 of the 25th serotype of bluetongue virus［J］. Monoclon Antib Immunodiagn Immunother, 2015, 34（2）：116-121.

［23］Xiong D, Song L, Zhai X, et al. A porcine reproductive and respiratory syndrome virus（PRRSV）vaccine candidate based on the fusion protein of PRRSV glycoprotein 5 and the Toll-like Receptor-5 agonist Salmonella Typhimurium FljB［J］. BMC Vet Res, 2015, 11：121.

［24］Maseko SB, Natarajan S, Sharma V, et al. Purification and characterization of naturally occurring HIV-1（South African subtype C）protease mutants from inclusion bodies［J］. Protein Expression & Purification, 2016, 122：90-96.

［25］Chen M, Cheng T, Xu CY, et al. Hydrophobicity of reactive site loop of SCCA1 affects its binding to hepatitis B virus［J］. World J Gastroenterol, 2005, 11（19）：2864-2868.

［26］陳鷺穎, 林海軍, 翁祖星, 等. 基于全自動管式化學發(fā)光免疫檢測系統(tǒng)的人結核感染T細胞檢測方法的建立［J］. 分子診斷與治療雜志, 2015, 7（5）：296-301.

（責任編輯 朱琳峰）

Preparation and Application of Soluble Human Squamous Cell Carcinoma Antigen Expressed by Escherichia coli

CHEN Chun-ye1LIU Jian1ZHU Rui1LI Shu-xuan1YE Jiang-hui1WANG Wei1PAN De-quan1XU Fei-hai2CHENG Tong1XIA Ning-shao1
（1. State Key Laboratory of Molecular Vaccinology and Molecular Diagnostics，National Institute of Diagnostics and Vaccine Development of Infectious Disease，School of Life Science，Xiamen University，Xiamen 361102；2. Xiamen WANTAI Inndox Biotechnology Co.，Ltd.，Xiamen 361003）

The aims of this study are to establish a method for efficient soluble expression of human squamous cell carcinoma antigen（SCCAg）based on Escherichia coli expression system and obtain the recombinant SCCAg antigen in fine activity，then apply it in the detection method establishment of antigen. The study on the method of soluble expression and purification of recombinant SCCAg antigen was conducted based on pGEX-6P-1 vector and E. coli ER2566 strain. The activity of the purified antigen was evaluated by Abbott Kit and the specific monoclonal antibody was screened by indirect ELISA. It was proved that PGEX-6P-1 vector and E. coli strain ER2566 could be used to establish efficient soluble expression and purification method for recombinant SCCAg antigen. Moreover，the recombinant SCCAg antigen was proved to be in high purity and activity. Thus，the SCCAg detection method of chemical luminous tube was established with the specific monoclonal antibodies. In conclusion，an effective method for the expression and purification of SCCAg，which is based on the E. coli expression system，is established.

human squamous cell carcinoma antigen；Escherichia coli expression system；soluble expression；monoclonal antibody

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2017-0228

2017-03-22

國家高技術研究發(fā)展計劃（“863”計劃）（2011AA02A101）

陳春野，男，碩士研究生，研究方向：轉化醫(yī)學；E-mail：80911843@qq.com

夏寧邵，男，研究方向：分子病毒學；E-mail：nsxia@xmu.edu.cn