李麗 趙彭年 朱希坤

（沈陽化工研究院有限公司物與醫(yī)藥研究室，沈陽 110021）

凍干保護劑對假單胞菌菌粉存活率的影響

李麗 趙彭年 朱希坤

（沈陽化工研究院有限公司物與醫(yī)藥研究室，沈陽 110021）

保護劑的添加對提高假單胞菌冷凍干燥菌粉的存活率和貯藏穩(wěn)定性有顯著效果。設(shè)計實驗對凍干保護劑進行篩選和優(yōu)化研究，通過單因素實驗和正交實驗篩選出了最佳保護劑組合：脫脂乳粉10%，山梨醇3%，甘油1%，L-抗壞血酸鈉2%，假單胞菌凍干后的存活率可達90%，菌粉25℃存放6個月，存活率為50.2%。

假單胞菌，凍干保護劑，存活率

假單胞菌生長速度快、環(huán)境適應(yīng)能力強，在抑制植物病害、促進植物生長［1-6］、污染物降解［7-10］等方面具有重要的作用和應(yīng)用前景，但其對極端環(huán)境（高溫、低溫、干燥、缺營養(yǎng)等）抵抗能力較差，干燥保藏存活率低，低存活率制約了假單胞菌的工程應(yīng)用，因此提高假單胞菌制劑收率對假單胞菌的實際應(yīng)用有重要的現(xiàn)實意義。

真空冷凍干燥技術(shù)在微生物保藏方面得到了廣泛的應(yīng)用，是目前適應(yīng)性最廣的菌劑制備技術(shù)，在低溫、真空條件下，微生物的生理活動停止，細(xì)胞活力不易受損，特別適合熱敏性、氧敏性的微生物干燥制備，且菌劑保藏中不易受污染，易于分裝運輸。然而，由于各類微生物菌株的生境條件、營養(yǎng)需求、培養(yǎng)方法等存在較大差異，造成了不同微生物菌株的凍干保護劑和凍干方法也不盡相同。因此，制備假單胞菌菌粉的關(guān)鍵在于保護劑的使用。本研究旨在通過正交試驗對保護劑進行篩選和優(yōu)化，得到最佳的保護劑配方，提高菌粉的存儲期。

1 材料與方法

1.1 材料

實驗所用的假單胞菌為本課題組選育出來的降解酚類化合物的菌種［11］（CCTCC No.M2014400）；脫脂乳粉和食用級購自內(nèi)蒙古伊利集團；麥芽糊精和食用級購自山東西王糖業(yè)有限公司；甘油、甘露醇和AR購自國藥試劑集團化學(xué)試劑有限公司；葡聚糖和BR購自國藥試劑集團化學(xué)試劑有限公司；胰蛋白胨、酵母粉和BR購自O(shè)XOID LTD公司；氯化鈉和AR購自國藥試劑集團化學(xué)試劑有限公司。

Free Zone 2.5L冷凍干燥機，美國LABCONCO公司；SHP-350生化培養(yǎng)箱，上海精宏實驗設(shè)備有限公司；DW-86L388醫(yī)用低溫冰箱，青島海爾公司；3K-15高速離心機，德國SIGMA公司；YXQLS-100G高壓滅菌鍋，上海博迅實業(yè)有限公司；HZP-250全溫?fù)u床，上海精宏實驗設(shè)備有限公司；SW-CJ-2FD超凈工作臺，上海博迅實業(yè)有限公司；AL204-IC電子天平，梅特勒公司。

1.2 方法

1.2.1 假單胞菌的培養(yǎng)及菌懸液制備 LB液體培養(yǎng)基：胰蛋白胨 10 g/L，酵母粉5 g/L，NaCl 10 g/L，5 mol/L NaOH溶液調(diào)節(jié)pH至7.0。LB固體培養(yǎng)基：胰蛋白胨 10 g/L，酵母粉5 g/L，NaCl 10 g/L，瓊脂粉15 g/L，5 mol/L NaOH溶液調(diào)節(jié)pH至7.0。

培養(yǎng)方法：將假單胞菌菌液于LB固體培養(yǎng)基上劃線，30℃倒置過夜培養(yǎng)，檢驗菌株純度合格后，挑取單菌落接種到液體LB 培養(yǎng)基中（50 mL/250 mL），在30℃、150 r/min 條件下培養(yǎng)24 h，得到種子液。將種子液按2%接種于液體LB培養(yǎng)基中（100 mL/500 mL）培養(yǎng)48 h，在5 000 r/min 條件下離心15 min，去除上清液，用無菌生理鹽水將菌泥配制成菌懸濁液。

1.2.2 冷凍干燥保護劑的篩選 選取脫脂乳粉、葡聚糖、甘油、β-環(huán)糊精、山梨醇、抗壞血酸鈉6種保護劑［12-15］作為假單胞菌冷凍干燥保護劑的篩選對象，通過單因素實驗及正交試驗，選出最佳保護劑組合。

1.2.3 冷凍干燥方法 將保護劑加入裝有菌懸濁液的凍干瓶中，用勻漿機將菌液與保護劑混合均勻，于-80℃超低溫冰箱中預(yù)凍3 h，確認(rèn)樣品預(yù)凍完全，待真空冷凍干燥機凍干艙溫度降至-80℃時，放入預(yù)凍完全的樣品，開始抽真空，真空冷凍干燥24-48 h后取出，獲得凍干菌粉。

1.2.4 假單胞菌存活率的測定方法 以細(xì)菌存活率表征保護劑對的保護效果，通過梯度稀釋平板計數(shù)法測定假單胞菌活菌數(shù)，然后根據(jù)以下公式計算假單胞菌的存活率：

存活率（%）=凍干后樣品總活菌數(shù)/凍干前樣品總活菌數(shù)×100%。

2 結(jié)果

2.1 單一保護劑對假單胞菌存活率的影響

保護劑種類及濃度見表1。6種保護劑分別以不同的量添加到假單胞菌懸濁液中，混合均勻，預(yù)凍后進行真空冷凍干燥，菌粉存活率結(jié)果見圖1。與空白組相比，加入保護劑后，隨著保護劑濃度的提高，菌體存活率均有不同程度的提升，到達一定濃度后，過多保護劑的加入會對菌體存活率產(chǎn)生負(fù)面影響。在最佳濃度條件下，保護劑對菌粉保護效果為：抗壞血酸鈉＞脫脂乳粉＞山梨醇＞甘油＞β-環(huán)糊精＞葡聚糖，上述保護劑的最優(yōu)添加量分別為：2 wt%、10 wt%、5 wt%、1 wt%、5 wt%和4 wt%，對應(yīng)的菌粉活菌收率分別為：55%、47%、40%、30%、27%和25%。后續(xù)實驗選擇保護效果較好的抗壞血酸鈉、脫脂乳粉、山梨醇及甘油作為假單胞菌凍干保護劑進行優(yōu)化研究。

表1 單一保護劑質(zhì)量濃度

圖1 單一保護劑對假單胞菌存活率的影響

2.2 復(fù)合保護劑對假單胞菌存活率的影響

采用L9（34）正交實驗設(shè)計篩選最佳保護劑配方，正交實驗影響因素及水平見表2，正交實驗結(jié)果見表3。從表2可知，各因素對對假單胞菌凍干后的存活率影響次序為：脫脂乳粉＞山梨醇＞抗壞血酸酸鈉＞甘油，最優(yōu)保護劑組合為A2B1C2D2，即脫脂乳粉10%、山梨醇3%、甘油1%和L抗壞血酸鈉2%，此時活菌菌粉存活率為90%，采用優(yōu)化后的復(fù)合保護劑配方制備的菌粉活菌存活率，明顯高于單因素保護劑制備菌粉活菌存活率。后續(xù)實驗采用最優(yōu)保護劑組合為A2B1C2D2作為假單胞菌菌粉凍干保護劑進行研究。

表2 L9（34）正交實驗影響因素水平表

表3 正交實驗結(jié)果表

2.3 假單胞菌菌粉儲存穩(wěn)定性實驗

最優(yōu)保護劑組合為A2B1C2D2作為假單胞菌菌粉凍干保護劑，實驗選取4℃和25℃兩種溫度條件考察菌粉貯存穩(wěn)定性，實驗結(jié)果見表4。隨著貯存時間的延長，菌粉活菌數(shù)及存活率呈現(xiàn)下降的趨勢，25℃貯存比4℃貯存菌粉活菌數(shù)下降快，貯存6個月后，菌粉存活率分別為：50.2%和96.5%，實驗結(jié)果表明，凍干菌粉更適合在4℃條件下貯存。

表4 假單胞菌菌粉貯存穩(wěn)定性實驗結(jié)果

3 討論

假單胞菌在真空冷凍干燥過程中，主要受到冷凍傷害和干燥傷害［16］，前者主要與“胞內(nèi)凍結(jié)”有關(guān)，后者主要與細(xì)胞過度失水有關(guān)。為提高假單胞菌的凍干存活率，通常采用加入保護劑的方式，提高細(xì)胞的活性［17］。就保護劑系統(tǒng)而言，通常加入多種物質(zhì)，協(xié)同強化保護效果。保護劑按不同方式可分為滲透型、非滲透型、大分子、小分子等類型。滲透型保護劑可進入細(xì)胞，易與水分子結(jié)合，水合作用使溶液的黏性增大，從而弱化了水的結(jié)晶過程；非滲透型保護劑不能進入細(xì)胞內(nèi)部，可在特定溫度降低溶質(zhì)濃度（使溶液呈現(xiàn)過冷狀態(tài)）；大分子保護劑通過“包裹”形式保護菌體，使細(xì)胞表面免受傷害，單獨使用效果并不明顯，通常與小分子保護劑共同使用，可強化小分子保護劑的保護作用；小分子保護劑發(fā)揮主要保護作用，一些親水且能透過細(xì)胞膜的小分子，其含有的羥基在凍干過程中可取代水分子與菌體細(xì)胞膜磷脂中的磷酸基團或與菌體蛋白質(zhì)極性基團形成氫鍵，減緩和抑制冰晶的生長，保護細(xì)胞膜和蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能的完整性［13，16，18，19］。

本工作結(jié)合保護劑作用機制及前期研發(fā)經(jīng)驗，選擇脫脂乳粉、葡聚糖、甘油、β-環(huán)糊精、山梨醇、抗壞血酸鈉作為凍干保護劑，篩選得到選擇保護效果較好的抗壞血酸鈉、脫脂乳粉、山梨醇、甘油進行優(yōu)化研究，在最優(yōu)條件下，假單胞菌凍干后的存活率可達90.3%，說明選擇的保護劑起到較好的保護效果。但真空冷凍干燥過程中，干燥工藝條件不僅影響菌的凍干存活率，還影響菌的貯存穩(wěn)定性，整個干燥過程中涉及的影響因素較多，如前期菌株生長條件、預(yù)凍條件、細(xì)胞含水量、保護劑等。有關(guān)工藝條件與假單胞菌存活率、貯存穩(wěn)定性的關(guān)系，將作進一步研究。

4 結(jié)論

保護劑的添加對提高假單胞菌在冷凍干燥過程中的存活率有明顯效果，在添加優(yōu)化的復(fù)合保護劑（脫脂乳粉10%、山梨醇3%、甘油1%和L抗壞血酸鈉2%）條件下，假單胞菌凍干后的存活率可達90.3%，菌粉在4℃、25℃條件下貯存6個月的活菌存活率分別為96.5%和50.2%。

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（責(zé)任編輯 狄艷紅）

Effect of Cryoprotectant on the Survival Rate of Freeze-dried Pseudomonas sp. Powder

LI Li ZHAO Peng-nian ZHU Xi-kun
（Biotechnology and Pharmaceutical Research Laboratory，Shenyang Research Institute of Chemical Industry，Shenyang 110021）

The cryoprotectant presents remarkable effect on increasing the survival rate and stability of freeze-dried Pseudomonas sp. powder. Here single-factor and orthogonal experimental designs were conducted to screen the optimal combination of cryoprotectant. The results showed that the survival rate reached 90% when the concentration of skim milk powder，sorbitol，glycerol，and L-sodium ascorbate were 10%，3%，1%，2%，and was 50.2% while stored for 6 months at 25℃.

Pseudomonas sp.；cryoprotectant；survival rate

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2017-0215

2017-03-21

李麗，女，工程師，研究方向：環(huán)境微生物；E-mail：chemlily@163.com

朱希坤，男，研究方向：環(huán)境微生物；E-mail：zhuxikun@sinochem.com