趙紅偉，張 建，和麗麗，李月芹，朱葉珊，劉建平

(1.河北省人民醫(yī)院消化一科，河北 石家莊 050051； 2.河北省人民醫(yī)院老年病科，河北 石家莊 050051；3.河北省唐山市中醫(yī)院脾胃科，河北 唐山 063000；4. 河北省中醫(yī)院脾胃科，河北 石家莊 050011)

·論著·

銀杏葉提取物對(duì)腸炎小鼠免疫機(jī)制的調(diào)節(jié)作用

趙紅偉1，張 建1，和麗麗2，李月芹1，朱葉珊3，劉建平4*

(1.河北省人民醫(yī)院消化一科，河北 石家莊 050051； 2.河北省人民醫(yī)院老年病科，河北 石家莊 050051；3.河北省唐山市中醫(yī)院脾胃科，河北 唐山 063000；4. 河北省中醫(yī)院脾胃科，河北 石家莊 050011)

目的探討銀杏葉提取物(extract of ginkgo biloba,EGB 761)對(duì)腸炎模型小鼠免疫機(jī)制調(diào)節(jié)作用。方法將30只小鼠隨機(jī)分為正常組、模型組、EGB 761組，建立動(dòng)物模型；觀察小鼠疾病活動(dòng)指數(shù)(disease activity index,DAI)、結(jié)腸大體評(píng)分、結(jié)腸病理學(xué)變化、流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)T淋巴細(xì)胞亞群(CD3+、CD4+、CD8+)變化、免疫比濁法檢測(cè)血清免疫球蛋白(IgA、IgG、IgM)變化、免疫組織化學(xué)染色測(cè)定結(jié)腸組織細(xì)胞間黏附分子1(intercellular cell adhesion molecule 1，ICAM-1)變化。結(jié)果EGB 761干預(yù)后小鼠DAI下降明顯，結(jié)腸黏膜炎癥程度較模型組明顯減輕；同時(shí)能明顯降低模型小鼠血清中CD3+、CD4+含量，升高CD8+含量，降低IgA、IgG、IgM含量，減少結(jié)腸組織黏膜中ICAM-1陽(yáng)性細(xì)胞染色。結(jié)論EGB 761對(duì)腸炎模型小鼠具有免疫調(diào)節(jié)作用。

結(jié)腸炎，潰瘍性；免疫機(jī)制；小鼠

潰瘍性結(jié)腸炎(ulcerative colitis, UC)是一種原因不明的腸道炎癥性疾病，目前的流行病學(xué)資料顯示，其發(fā)病率在國(guó)內(nèi)外有逐年上升的趨勢(shì)，UC反復(fù)發(fā)作，嚴(yán)重影響患者的正常工作和生活[1-2]。研究表明UC的發(fā)病機(jī)制與免疫異常關(guān)系密切，故針對(duì)免疫機(jī)制進(jìn)行調(diào)節(jié)，可為UC的治療提供新的方向。銀杏葉提取物(extract of ginkgo biloba，EGB 761)的活性成分是萜烯部分，其中包括白果內(nèi)酯及銀杏內(nèi)酯，對(duì)免疫功能有較大的調(diào)節(jié)作用。本研究通過(guò)對(duì)急性期UC模型小鼠的EGB 761干預(yù)，探討EGB 761在UC免疫機(jī)制方面的調(diào)節(jié)作用。

1 材料與方法

1.1 試劑與動(dòng)物 右旋葡聚糖硫酸鈉(美國(guó)Sigma公司；EGB 761(金鈉多注射液,德國(guó)威瑪舒培藥廠)；免疫球蛋白IgA、IgG、IgM (四川邁克科技有限責(zé)任公司)；細(xì)胞間黏附分子1(intercellular cell adhesion molecule 1，ICAM-1)(北京博奧森生物技術(shù)有限公司)；CD3+、CD4+、CD8+抗體(美國(guó)Beckmen Coulter公司)；磷酸緩沖鹽溶液(phosphate buffer saline，PBS)；C57BL/6小鼠(體質(zhì)量19～21 g，年齡8～11周)，購(gòu)于北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司。

1.2 動(dòng)物模型建立及干預(yù)方法 按隨機(jī)數(shù)字表隨機(jī)將30只雄性C57BL/6小鼠分為正常組(10只)、模型組(10只)和EGB 761組(10只)。正常組小鼠從實(shí)驗(yàn)第1天開(kāi)始自由飲用蒸餾水至第7天，同時(shí)給予PBS 1 mL(200 mg/kg)灌腸從第1～7天。模型組小鼠從第1天起自由飲用2% DSS 至第7天，同時(shí)給予PBS 1 mL(200 mg/kg)灌腸從第1～7天。EGB 761組小鼠自實(shí)驗(yàn)開(kāi)始第1天起自由飲用2% DSS至第7天，同時(shí)給予銀杏葉提取物1 mL(200 mg/kg)灌腸從第1～7天。第8天處死所有動(dòng)物[3]。

1.3 小鼠一般情況和疾病活動(dòng)指數(shù)(disease activity index，DAI)以及結(jié)腸組織大體評(píng)分 每天觀察小鼠的精神狀態(tài)、毛發(fā)光澤度、食欲、體質(zhì)量、糞便性狀和有無(wú)潛血等。DAI評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)、臨床表現(xiàn)和病理大體評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)見(jiàn)表1。

1.4 標(biāo)本制作 在實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)處死小鼠，蠟包埋的結(jié)腸組織分別進(jìn)行5 μm連續(xù)切片，按以下步驟進(jìn)行染色：二甲苯脫蠟，梯度酒精脫水，自來(lái)水沖洗1 min，蘇木精染色7 min，自來(lái)水沖洗2 min，1%鹽酸酒精2 s，自來(lái)水沖洗2 min，1%氨水30 s，自來(lái)水沖洗4 min，0.5%伊紅酒精30 s，酒精梯度脫水，二甲苯透明，中性樹(shù)膠封片，光鏡下觀察腸組織的組織病理學(xué)改變。

表1 DAI評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)、臨床表現(xiàn)和結(jié)腸組織大體評(píng)分

注：DAI評(píng)分=(體質(zhì)量下降分?jǐn)?shù)+糞便性狀分?jǐn)?shù)+便血分?jǐn)?shù))/3

1.5 檢測(cè)T細(xì)胞亞群及免疫球蛋白變化 經(jīng)腹腔麻醉小鼠，在動(dòng)物解剖臺(tái)上固定，剖開(kāi)腹部，各組小鼠腹主動(dòng)脈取血用乙二胺四乙酸(ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA抗凝)后，取專(zhuān)用試管3支，分別加入CD3 FITC/CD4 PE、CD3 FITC/CD8 PE及其同型對(duì)照各10 μL，立刻加抗凝血100 μL，充分混勻后，室溫下避光放置30 min。每管加紅細(xì)胞裂解液2～3 mL，充分混勻，避光放置，至液體透亮。1 000 r/min離心5 min，去上清液。上機(jī)檢測(cè)，流式細(xì)胞儀計(jì)數(shù)。檢測(cè)前常規(guī)對(duì)流式細(xì)胞儀進(jìn)行質(zhì)量監(jiān)控和雙色熒光補(bǔ)償，使其均在允許范圍內(nèi)。免疫比濁法檢測(cè)血清免疫球蛋白IgA、IgG、IgM人血清或血漿中免疫球蛋白IgG、IgA和IgM與其相應(yīng)抗體(羊抗人免疫球蛋白IgG、IgA和IgM血清)在液相中相遇，立即形成抗原-抗體復(fù)合物，并形成一定濁度。與通過(guò)同樣處理的校準(zhǔn)血清比較，即可計(jì)算出樣品中免疫球蛋白IgG、IgA和IgM含量。

1.6 結(jié)腸組織免疫組織化學(xué)染色 新鮮腸組織以5 μm的厚度進(jìn)行連續(xù)冰凍切片，按以下步驟進(jìn)行一抗ICAM-1的免疫組織化學(xué)染色：4%多聚甲醛固定10 min，免疫染色洗滌液洗5 min 3次，封閉液封閉，4 ℃過(guò)夜免疫染色洗滌液洗5 min 3次，二抗37 ℃孵育30 min，洗滌液洗5 min 3次，光鏡下觀察結(jié)腸組織ICAM-1蛋白的表達(dá)情況，陰性對(duì)照組用PBS替代一抗，其余步驟同上。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料數(shù)比較分別采用單因素方差分析和SNK-q檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 3組DAI評(píng)分比較 與正常組比較，模型組從第4天開(kāi)始DAI評(píng)分逐漸升高，EGB 761組在第4天DAI評(píng)分已經(jīng)下降為0，第5～8天DAI評(píng)分也較模型組明顯降低，但仍高于正常組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，見(jiàn)表2。

表2 3組DAI評(píng)分比較 分)

*P<0.01與正常組比較 #P<0.01與模型組比較(SNK-q檢驗(yàn))

2.2 3組結(jié)腸大體評(píng)分比較 與正常組比較，模型組結(jié)腸大體評(píng)分明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；EGB761組結(jié)腸組織大體評(píng)分低于模型組，但仍高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)有意義(P<0.01)。見(jiàn)表3。

2.3 3組結(jié)腸組織病理學(xué)表現(xiàn)比較 與正常組比較，模型組小鼠結(jié)腸黏膜缺損，炎癥細(xì)胞廣泛浸潤(rùn)，隱窩增生；而EGB 761組結(jié)腸病理炎癥浸潤(rùn)、病變深度、隱窩破壞均與模型組比較有不同程度的減輕。見(jiàn)圖1。

2.4 EGB 761對(duì)小鼠T細(xì)胞亞群變化的影響 與正常組比較，模型組明顯升高血中CD3+、CD4+含量，降低CD8+含量，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；與模型組比較，EGB 761組明顯降低血中CD3+、CD4+含量，升高CD8+含量，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。見(jiàn)表4。

表3 3組結(jié)腸組織大體評(píng)分比較 分)

*P<0.01與正常組比較 #P<0.01與模型組比較(SNK-q檢驗(yàn))

組別 CD3+(%)CD4+(%)CD8+(%)CD4+/CD8+EGB761組49.48±3.35#27.24±3.40#24.80±4.29#1.01±0.25#模型組 64.98±3.55*43.03±3.27*15.34±3.55*2.80±0.22*正常組 43.98±3.3822.18±3.4226.65±4.800.86±0.19F 6873.4007232.3114086.6255145.556P 0.0000.0000.0000.000

*P<0.01 與正常組比較 #P<0.01與模型組比較(SNK-q檢驗(yàn))

2.5 3組免疫球蛋白水平比較 與正常組比較，模型組明顯升高血中IgA、IgG、IgM含量，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；與模型組比較，EGB 761組明顯降低血中IgA、IgG、IgM含量(P<0.01)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。見(jiàn)表5。

組別 IgAIgGIgMEGB761組0.03±0.02#0.21±0.08#0.22±0.06#模型組 0.08±0.02*0.31±0.08*0.30±0.07*正常組 0.03±0.020.20±0.080.19±0.07F 1626.1686392.0164892.789P 0.0000.0000.000

*P<0.01與正常組比較 #P<0.01與模型組比較(SNK-q檢驗(yàn))

2.6 EGB 761對(duì)小鼠結(jié)腸組織ICAM-1蛋白表達(dá)水平的影響 與正常組比較，模型組結(jié)腸組織ICAM-1陽(yáng)性細(xì)胞染色面積明顯增多；而EGB 761組ICAM-1陽(yáng)性細(xì)胞蛋白染色面積較模型組明顯減弱。見(jiàn)圖2。

3 討 論

UC是一種高復(fù)發(fā)的慢性腸道炎癥性疾病，是炎癥性腸病的主要臨床形式之一，但由于本病病程長(zhǎng)、病變范圍廣被認(rèn)為是結(jié)腸癌的癌前病變，目前公認(rèn)本病是一種自身免疫性疾病。研究表明，體內(nèi)免疫機(jī)制的異常誘導(dǎo)了UC的發(fā)生[4-5]；免疫反應(yīng)的異常將進(jìn)一步導(dǎo)致炎癥細(xì)胞和炎癥介質(zhì)異常，T淋巴細(xì)胞(CD3+、CD4+、CD8+)是免疫反應(yīng)中抗原遞呈的核心環(huán)節(jié)，從而造成腸道黏膜組織的損傷。在正常情況下ICAM-1很少表達(dá)，當(dāng)多種因素作用下使體內(nèi)免疫系統(tǒng)被激活時(shí)，才會(huì)在各種炎癥細(xì)胞上表達(dá)；腸道黏膜免疫反應(yīng)的調(diào)節(jié)有賴(lài)于免疫細(xì)胞及免疫球蛋白(IgA、IgG、IgM)的參與[6-10]。因此，尋求更為有效的、且不良反應(yīng)小的、不易復(fù)發(fā)的理想藥物已成為研究的熱點(diǎn)。

銀杏是古老的樹(shù)種，銀杏葉的葉子、果實(shí)、種子均有較高的藥用價(jià)值，它的藥理作用不斷被認(rèn)識(shí)，臨床應(yīng)用范圍逐步擴(kuò)大。銀杏葉中含有天然活性黃酮、苦內(nèi)酯等對(duì)人體健康有益的多種成分，EGB 761廣泛用于治療呼吸系統(tǒng)、心腦血管系統(tǒng)等疾病，有調(diào)節(jié)循環(huán)系統(tǒng)、改善血液循環(huán)、保護(hù)黏膜組織等作用。研究表明，EGB 761可通過(guò)調(diào)節(jié)免疫機(jī)制，抑制炎性癥狀，對(duì)大鼠實(shí)驗(yàn)性結(jié)腸炎具有保護(hù)作用[11-14]。

免疫功能紊亂在UC發(fā)生發(fā)展中起重要作用，尤其是T淋巴細(xì)胞是免疫反應(yīng)中抗原遞呈的核心環(huán)節(jié)，T淋巴細(xì)胞亞群其中的一亞群功能增強(qiáng)，另一亞群功能減弱，引起亞群間比例紊亂[15]。本研究UC模型小鼠的T淋巴細(xì)胞亞群存在著紊亂，但經(jīng)EGB 761干預(yù)后，EGB 761組T淋巴細(xì)胞亞群的紊亂得以調(diào)節(jié)，進(jìn)一步抑制了炎癥細(xì)胞和炎癥介質(zhì)異常，減少了腸黏膜組織損傷。表明EGB 761組中的結(jié)腸組織黏膜較模型組明顯改善，充血及水腫明顯減輕。IgG、IgA 參與UC的變態(tài)反應(yīng),并參與黏膜內(nèi)局部免疫復(fù)合物的形成[16]。本研究結(jié)果顯示EGB 761對(duì)異常增高的IgA、IgG有明顯的抑制作用，說(shuō)明該藥治療UC的機(jī)制與有效調(diào)節(jié)異常免疫反應(yīng)有關(guān)。在正常腸黏膜中ICAM-1通常在毛細(xì)血管、微靜脈和大血管內(nèi)皮細(xì)胞低水平表達(dá)，而UC時(shí)ICAM-1在結(jié)腸組織中的分布和表達(dá)均明顯增加，在機(jī)體免疫過(guò)程中起重要作用，使人們認(rèn)識(shí)到直接針對(duì)ICAM-1的治療可能成為一種新的手段。本研究結(jié)果顯示，對(duì)UC模型組小鼠結(jié)腸組織行免疫組織化學(xué)染色可見(jiàn)ICAM-1陽(yáng)性細(xì)胞染色明顯增多，而經(jīng)EGB 761干預(yù)后結(jié)腸組織中ICAM-1陽(yáng)性細(xì)胞的染色明顯減弱。表明EGB 761在急性期UC模型小鼠的機(jī)體免疫過(guò)程中起重要作用，這為臨床治療UC提供了理論依據(jù)。(本文圖見(jiàn)封三)

[1] Dupont A,Kaconis Y,Yang I,et al. Intestinal mucus affinity and biological activity of an orally administered antibacterial and anti-inflammatory peptide[J]. Gut，2015,64(2):222-232.

[2] Long TM,Nisa S,Donnenberg MS,et al. Enteropathogenic Escherichia coli inhibits type Ⅰ interferon-and RNase L-mediated host defense to disrupt intestinal epithelial cell barrier function[J]. Infect Immun,2014,82(7):2802-2814.

[3] Zhao H,Zhang H,Wu H,et al. Protective role of 1,25(OH)2 vitamin D3 in the mucosal injury and epithelial barrier disruption in DSS-induced acute colitis in mice[J]. BMC Gastroenterol,2012,12:57.

[4] Forte D,Ciciarello M,Valerii MC,et al. Human cord blood-derived platelet lysate enhances the therapeutic activity of adipose-derived mesenchymal stromal cells isolated from Crohn′s disease patients in a mouse model of colitis[J]. Stem Cell Res Ther,2015,6:170.

[5] Zhang H,Wu H,Liu L,et al. 1,25-dihydroxyvitamin D3 regulates the development of chronic colitis by modulating both T helper (Th)1 and Th17 activation[J]. APMIS,2015,123(6):490-501.

[6] Zeng JQ,Xu CD,Zhou T,et al. Enterocyte dendritic cell-specific intercellular adhesion molecule-3-grabbing non-integrin expression in inflammatory bowel disease[J]. World J Gastroenterol,2015,21(1):187-195.

[7] Zhang YJ,Xu JJ,Wang P,et al. Multidrug resistance gene and its relationship to ulcerative colitis and immune status of ulcerative colitis[J]. Genet Mol Res,2014,13(4):10837-10851.

[8] Hartog A,Belle FN,Bastiaans J,et al. A potential role for regulatory T-cells in the amelioration of DSS induced colitis by dietary non-digestible polysaccharides[J]. J Nutr Biochem,2015,26(3):227-233.

[9] Schey R,Danzer C,Mattner J. Perturbations of mucosal homeostasis through interactions of intestinal microbes with myeloid cells[J]. Immunobiology,2015,220(2):227-235.

[10] Adachi T,Sakurai T,Kashida H,et al. Involvement of heat shock protein a4/apg-2 in refractory inflammatory bowel disease[J]. Inflamm Bowel Dis,2015,21(1):31-39.

[11] Wang L,Zhang T,Bai K. System evaluation on Ginkgo Biloba extract in the treatment of acute cerebral infarction[J]. Zhong Nan Da Xue Xue Bao： Yi Xue Ban，2015,40(10):1096-1102.

[12] Stark M,Behl C. The ginkgo biloba extract egb 761 modulates proteasome activity and polyglutamine protein aggregation[J]. Evid Based Complement Alternat Med,2014,2014:940186.

[13] Serrano-Garca N,Pedraza-Chaverri J,Mares-Sámano JJ,et al. Antiapoptotic Effects of EGb 761[J]. Evid Based Evid Based Complement Alternat Med，2013，2013:495703.

[14] 章靜，吳香麗，劉麗霞，等.銀杏葉提取物對(duì)大鼠視神經(jīng)損傷后Bcl-2和Bax表達(dá)的影響[J].河北醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào),2014,35(3):336-338.

[15] Ghaemi A,Sajadian A,Khodaie B,et al. Immunomodulatory Effect of Toll-Like Receptor-3 Ligand Poly I∶C on Cortical Spreading Depression[J]. Mol Neurobiol,2014,11(23):143-154.

[16] Stockinger S,Duerr CU,Fulde M,et al. TRIF signaling drives homeostatic intestinal epithelial antimicrobial peptide expression[J]. J Immunol,2014,193(8):4223-4234.

(本文編輯：許卓文)

2016-06-17；

2016-07-19

河北省中醫(yī)藥管理局科研計(jì)劃項(xiàng)目(2016180)

趙紅偉(1979-)，女，河北玉田人，河北省人民醫(yī)院主治醫(yī)師，醫(yī)學(xué)博士，從事消化科疾病診治研究。

*通訊作者。E-mail:13603396653@163.com

R574.62

B

1007-3205(2017)09-1076-04

10.3969/j.issn.1007-3205.2017.09.020