薄立軍，于沛霞，黃立寧，薛 輝，康榮田*

(1.河北醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院麻醉科，河北 石家莊 050000；2. 河北醫(yī)科大學(xué)第三醫(yī)院麻醉科，河北 石家莊 050051； 3.河北省邯鄲市第四醫(yī)院麻醉科，河北 邯鄲 056200)

·論著·

右美托咪定對(duì)腦缺血缺氧新生大鼠神經(jīng)功能的影響

薄立軍1，于沛霞2，黃立寧1，薛 輝3，康榮田1*

(1.河北醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院麻醉科，河北 石家莊 050000；2. 河北醫(yī)科大學(xué)第三醫(yī)院麻醉科，河北 石家莊 050051； 3.河北省邯鄲市第四醫(yī)院麻醉科，河北 邯鄲 056200)

目的觀察右美托咪定對(duì)腦缺血缺氧新生大鼠神經(jīng)凋亡以及對(duì)神經(jīng)功能和長(zhǎng)期學(xué)習(xí)記憶能力的影響。方法7天齡SD大鼠90只。建立大鼠(7 d)腦缺血缺氧損傷(hypoxic-ischemic encephalopathy，HIE)模型。假手術(shù)組(S)僅進(jìn)行手術(shù)而不造成缺氧狀態(tài)；HIE模型組(R)持續(xù)缺氧2 h；右美托咪定25 μg /kg組(D1)、右美托咪定50 μg/kg組(D2)，于HIE 2 h后，即刻分別靜脈注射右美托咪定25 μg/kg 、50 μg/kg；育亨賓組(Y)，于HIE 2 h后，即刻靜脈注射給予右美托咪定50 μg/kg和育亨賓5 μg。Western blot法檢測(cè)各組干預(yù)后24 h，caspase-3表達(dá)和新生大鼠神經(jīng)功能評(píng)分；干預(yù)后4周后，Morris水迷宮檢測(cè)學(xué)習(xí)記憶能力的變化。結(jié)果干預(yù)后24 h，R組caspase-3表達(dá)和神經(jīng)功能評(píng)分明顯高于S組，D1組、D2 組和Y組低于R組，Y組高于D1組和D2組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。干預(yù)后4周后，Morris水迷宮逃避潛伏期第1～5天逐漸縮短，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。第1天各組逃避潛伏期差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；第2、3、4、5天，R組逃避潛伏期較S組延長(zhǎng)，D1組、D2組、Y組較R組縮短，Y組長(zhǎng)于D1組、D2組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。R組目標(biāo)像限停留時(shí)間明顯少于S組，D1組、D2組、Y組明顯多于R組，Y組少于D1和D2組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。D1與D2組神經(jīng)功能評(píng)分、caspase-3表達(dá)、水迷宮檢測(cè)差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)論腦缺血缺氧導(dǎo)致新生大鼠腦海馬組織神經(jīng)元凋亡增多，遠(yuǎn)期新生大鼠學(xué)習(xí)記憶能力降低；右美托咪定25 μg/kg、50 μg/kg均抑制caspase-3表達(dá)，減少神經(jīng)元的凋亡，并改善新生大鼠遠(yuǎn)期學(xué)習(xí)記憶能力。

缺氧缺血，腦；模型，動(dòng)物；右美托咪定

新生兒缺氧缺血性腦病(hypoxic-ischemicencephalopatly,HIE)是由圍產(chǎn)期窒息導(dǎo)致的腦缺氧缺血性損害,臨床以意識(shí)障礙、肌張力及原始反射改變、驚厥、腦水腫、顱內(nèi)高壓為主的神經(jīng)系統(tǒng)表現(xiàn),是新生兒死亡及影響神經(jīng)預(yù)后的嚴(yán)重疾病[1-2]。右美托咪定是α2受體興奮劑，已廣泛應(yīng)用于臨床麻醉和重癥監(jiān)護(hù)室。研究表明，右美托咪定對(duì)HIE有神經(jīng)保護(hù)作用[3-5]。右美托咪定的神經(jīng)保護(hù)作用與其藥物機(jī)制和α2受體相關(guān)，它能夠減少capase-3、bcl-2等的表達(dá)和神經(jīng)元的凋亡[6]，但目前還沒有其對(duì)HIE長(zhǎng)期影響的研究。本研究通過動(dòng)物實(shí)驗(yàn)建立新生大鼠HIE模型，探討右美托咪定對(duì)新生大鼠HIE的影響，尤其是對(duì)長(zhǎng)期神經(jīng)功能、學(xué)習(xí)能力的影響，報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組 健康7天齡SD大鼠90只，體質(zhì)量11～16g(河北省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供)。采用隨機(jī)數(shù)字表法分成5組，每組18只: 假手術(shù)組(S組)、HIE模型組(R組)、右美托咪定25μg/kg(D1組)、50μg/kg組(D2組)、育亨賓5μg組(Y組)。

1.2 模型制備Rice方法[7]建立大鼠HIE模型。SD大鼠于術(shù)前禁食6h，自由飲水，環(huán)境溫度19～22 ℃。假手術(shù)組：僅進(jìn)行手術(shù)而不造成缺血缺氧。HIE模型組：行HIE模型手術(shù)。新生大鼠行左側(cè)頸總動(dòng)脈永久性結(jié)扎,2h后置于玻璃缺氧箱中，37℃恒溫,輸入氧濃度為(8±0.1)%的氮氧混合氣體持續(xù)缺氧2h，右美托咪定25μg/kg、50μg/kg組于持續(xù)缺氧2h后即刻分別尾靜脈一次性注射給予右美托咪定(批號(hào)：13112332，江蘇恒瑞醫(yī)藥有限公司)25μg/kg、50μg/kg。假手術(shù)組和HIE模型組，給予同量的生理鹽水。育亨賓組給予右美托咪定50μg/kg和育亨賓5μg(批號(hào)：552206，J&KScientificLtd)。每組均母鼠喂養(yǎng)24h。

1.3 神經(jīng)功能缺損評(píng)分 各組大鼠干預(yù)24h后，采用五點(diǎn)量表法評(píng)估神經(jīng)行為，由不知道動(dòng)物分組的研究者操作。每組隨機(jī)選取6只。正常(無神經(jīng)功能缺損)0分：大鼠表現(xiàn)正常，完全可以伸開前肢和抬起尾巴；神經(jīng)功能缺損1分：大鼠不能完全伸展其左前肢，抬起尾巴困難；神經(jīng)功能缺損2分：大鼠已經(jīng)減少抗側(cè)推，并有輕度神經(jīng)行為；神經(jīng)功能缺損3分：轉(zhuǎn)身成一個(gè)圓圈，并有輕度和中度神經(jīng)行為；神經(jīng)功能缺損4分：走路不協(xié)調(diào)，并有輕度意識(shí)障礙。

1.4Westernblot法檢測(cè)caspase-3表達(dá) 新生大鼠于干預(yù)24h后，每組隨機(jī)選取6只，在冰板上立即處死大鼠，取海馬，儲(chǔ)存-80 ℃冰箱備用。Westernbolt按文獻(xiàn)描述方法進(jìn)行[8]。樣品的蛋白質(zhì)濃度采用BCA法測(cè)定。采用抗裂解的caspase-3(1∶1 000 ，Affinity公司)一抗和二抗，抗β-actin(1∶500，Affinity公司)，用凝膠電泳成像分析系統(tǒng)掃描PVDF膜，用ChemiScopeCapture軟件曝光并捕捉圖像，利用GelImageAnalysisV2.02軟件分析各條帶的灰度值。

1.5Morris水迷宮實(shí)驗(yàn) 每組剩余新生大鼠6只，繼續(xù)喂養(yǎng)4周，行Morris水迷宮檢測(cè)。水迷宮直徑150cm，深度50cm， 水深40cm，水溫22°C。分別行定位導(dǎo)航和空間探索實(shí)驗(yàn)。預(yù)先設(shè)定4個(gè)象限，進(jìn)行5d的學(xué)習(xí)和記憶，每天4次，將以12cm圓形平臺(tái)置于一定位置并淹沒1cm。如果動(dòng)物60s未找到平臺(tái)，潛伏期為60s。撤出平臺(tái)，將大鼠隨機(jī)置入水中，采用攝像機(jī)記錄其活動(dòng)，記錄其60s探索軌跡和不同象限停留時(shí)間。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS23.0統(tǒng)計(jì)軟件處理數(shù)據(jù)，計(jì)量資料比較分別采用單因素方差分析和SNK-q檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 各組caspase-3表達(dá)、神經(jīng)功能評(píng)分比較 干預(yù)后24h,R組caspase-3表達(dá)和神經(jīng)功能評(píng)分明顯高于S組，D1組、D2 組和Y組低于R組，Y組高于D1組和D2組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表 1，圖1。

組別caspase-3神經(jīng)功能評(píng)分(分)S組 0.078±0.012 0.000±0.000 R組 0.468±0.031*3.501±0.551*D1組0.221±0.024*#1.502±0.541*#D2組0.200±0.021*#1.333±0.510*#Y組 0.305±0.211*#△☆2.667±0.521*#△☆F236.81247.574P0.0000.000

*P<0.05與S組比較 #P<0.05與R組比較 △P<0.05與D1組比較 ☆P<0.05與D2組比較

圖1各組Western blot檢測(cè)結(jié)果

Figure1TheresultofWesternblot

2.2 Morris水迷宮實(shí)驗(yàn) 干預(yù)后4周后，各組大鼠Morris水迷宮逃避潛伏期從第1～5天逐漸縮短，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。第1天各組逃避潛伏期差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；第2、3、4、5天，R組逃避潛伏期較S組延長(zhǎng)，D1組、D2組、Y組較R組縮短，Y組長(zhǎng)于D1組、D2組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。R組目標(biāo)象限停留時(shí)間明顯少于S組，D1組、D2組、Y組明顯多于R組，Y組少于D1和D2組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表2。

組別逃避潛伏期第1天第2天第3天第4天第5天目標(biāo)象限停留時(shí)間S組 57.67±0.8247.50±1.05a34.50±2.07ab25.83±0.75abc20.67±1.03abcd30.000±1.788R組 59.00±1.2649.50±1.05*a47.17±1.47*ab42.00±1.41*abc39.01±0.89*abcd12.001±1.414*D1組58.17±0.7548.00±0.63#a39.83±1.47*#ab32.50±1.38*#abc27.10±0.99*#abcd22.833±1.472*#D2組57.83±1.1748.02±0.65#a39.17±1.32*#ab32.00±1.41*#abc26.01±0.94*#abcd23.500±1.870*#Y組 58.16±1.1748.33±1.03#a43.00±1.03*#△☆ab37.01±1.32*#△☆abc31.11±0.88*#△☆abcd17.167±1.722*#△☆F1.4224.16044.921129.203327.109100.982P0.2560.0110.0000.0000.0000.000

*P<0.05與S組比較 #P<0.05與R組比較 △P<0.05與D1組比較 ☆P<0.05與D2組比較 aP<0.05與第1天比較 bP<0.05與第2天比較 cP<0.05與第3天比較 dP<0.05與第4天比較(SNK-q檢驗(yàn))

3 討 論

臨床統(tǒng)計(jì)結(jié)果表明新生兒HIE的發(fā)病率約為足月嬰兒的2/1 000，早產(chǎn)兒6/1 000[9]。HIE給新生兒帶來嚴(yán)重的損害甚至危及生命，主要臨床表現(xiàn)包括肢體麻痹、癲癇、行為異常和神經(jīng)發(fā)育缺陷等。HIE是由于腦組織氧供氧耗嚴(yán)重失衡，導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞死亡和炎性細(xì)胞因子釋放導(dǎo)致級(jí)聯(lián)反應(yīng)，進(jìn)一步促進(jìn)神經(jīng)細(xì)胞凋亡，影響神經(jīng)功能。目前臨床多采用低溫和支持療法，但其效果十分有限，迫切需要探索有效的神經(jīng)保護(hù)措施和治療藥物，以進(jìn)一步減少HIE引起的新生兒死亡和嚴(yán)重的長(zhǎng)期損害[10]。研究表明右美托咪定能夠減輕HIE造成的神經(jīng)功能損傷，故本研究采用新生大鼠HIE模型缺血缺氧2 h后即刻尾靜脈注射右美托咪定的治療方案，觀察其能否減輕HIE導(dǎo)致的新生大鼠腦損傷以及對(duì)長(zhǎng)期神經(jīng)功能的影響。

到目前為止，新生鼠是最常見的圍產(chǎn)期HIE損傷動(dòng)物模型，其主要優(yōu)勢(shì)是能夠更好地觀察HIE的長(zhǎng)期影響。因此，本研究采用新生大鼠HIE模型。本研究中HIE模型組新生大鼠caspase-3表達(dá)和神經(jīng)行為評(píng)分明顯高于假手術(shù)組，證明本研究HIE模型成功可行。凋亡主要的發(fā)生途徑：依賴caspase-3和非依賴caspase-3途徑[11]。有學(xué)者研究表明右美托咪定在腦缺血期間和之前應(yīng)用，具有一定的神經(jīng)保護(hù)作用[12]。同時(shí)右美托咪定可以通過血腦屏障激活α2受體，更容易減輕腦損傷，起到神經(jīng)保護(hù)作用。在異氟醚誘導(dǎo)的神經(jīng)毒性作用的研究中，有學(xué)者應(yīng)用25 μg、50 μg、75 μg右美托咪定，發(fā)現(xiàn)右美托咪定能夠改善異氟醚誘導(dǎo)的神經(jīng)損傷，同時(shí)發(fā)現(xiàn)3種劑量沒有明顯不同[8]。因此，本研究采用25 μg、50 μg 2種劑量右美托咪定單次給藥，觀察其對(duì)HIE模型缺氧2 h后腦神經(jīng)功能的影響，結(jié)果顯示HIE模型缺氧2 h即刻caspase-3和神經(jīng)功能缺損評(píng)分明顯升高，給予25 μg、50 μg右美托咪定均能夠減少caspase-3活化，改善干預(yù)后24 h新生大鼠的神經(jīng)功能，且2種劑量右美托咪定(25 μg 、50 μg)減少caspase-3活化的程度差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。表明應(yīng)用25 μg、50 μg右美托咪定，能夠改善HIE模型誘導(dǎo)的神經(jīng)損傷，同時(shí)發(fā)現(xiàn)2種劑量沒有明顯不同。

本研究發(fā)現(xiàn)同時(shí)應(yīng)用育亨賓5 μg和右美托咪定50 μg， caspase-3活化量較單純應(yīng)用右美托咪定50 μg明顯增加；應(yīng)用育亨賓5 μg和右美托咪定50 μg干預(yù)后24 h，神經(jīng)功能改善明顯好于HIE模型組，而明顯差于右美托咪定組。育亨賓作為α2受體特異性的阻斷劑，能夠阻斷右美托咪定的α2受體激動(dòng)作用。本研究結(jié)果顯示育亨賓組仍然存在改善神經(jīng)功能的作用。因此，進(jìn)一步證明了右美托咪定在新生大鼠HIE模型中發(fā)揮的神經(jīng)保護(hù)作用與α2受體有關(guān)，但還存在其他作用機(jī)制。這與Xiong等[13]的研究相一致。本研究應(yīng)用Morris水迷宮分別對(duì)干預(yù)后4周的大鼠進(jìn)行定位導(dǎo)航和空間探索實(shí)驗(yàn)，進(jìn)一步分析干預(yù)對(duì)長(zhǎng)期神經(jīng)行為學(xué)和學(xué)習(xí)記憶的影響，結(jié)果顯示各組在訓(xùn)練的第1～5天逃避潛伏期逐漸縮短，第1天各組逃避潛伏期無明顯差異，第2、3、4、5天，右美托咪定25 μg、50 μg組明顯短于HIE模型組和育亨賓組，而長(zhǎng)于假手術(shù)組，育亨賓組明顯短于HIE模型組；HIE模型組目標(biāo)象限停留時(shí)間明顯短于右美托咪定25 μg和50 μg組、育亨賓組、假手術(shù)組，右美托咪定25 μg、50 μg組停留時(shí)間少于假手術(shù)組而多于育亨賓組。表明新生大鼠HIE模型導(dǎo)致大鼠4周的行為和學(xué)習(xí)記憶能力降低，右美托咪定能夠改善HIE長(zhǎng)期的神經(jīng)損傷的影響，改善新生大鼠HIE后的神經(jīng)功能。本研究的不足之處為僅觀察了右美托咪定2個(gè)劑量，應(yīng)用更多不同劑量觀察右美托咪定的作用有待進(jìn)一步探討。

總之，右美托咪定25 μg、50 μg能夠減輕新生大鼠HIE的神經(jīng)凋亡，改善新生大鼠短期、長(zhǎng)期的神經(jīng)功能和學(xué)習(xí)記憶能力。右美托咪定的神經(jīng)保護(hù)作用與α2受體有關(guān)，但還存在其他作用機(jī)制。

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(本文編輯：許卓文)

Effects of dexmedetomidine on neurological function in neonatal rats with hypoxic-ischemic encephalopathy

BO Li-jun1， YU Pei-xia2, HUANG Li-ning1， Xue Hui3， Kang Rong-Tian1*

(1.DepartmentofAnesthesiology,theSecondHospitalofHebeiMedicalUniversity，Shijiazhuang050051，China；2.DepartmentofAnesthesiology，theThirdHospitalofHebeiMedicalUniversity，Shijiazhuang050000，China; 3.DepartmentofAnesthesiology,theForthHospitalofHandan,HebeiProvince,Handan056200，China)

ObjectiveToobservetheeffectofdexmedetomidineonneuronalapoptosisinneonatalratswithcerebralischemiaandhypoxia,andtoexploretheeffectofdexmedemidineonneurologicalfunctionandlong-termlearningandmemoryability.MethodsHypoxic-ischemicencephalopathy(HIE)wasbuiltforthemodelofcerebralischemiaandhypoxia.Ninetyseven-day-old(P7)Sprague-Dawleyratswererandomizedintofivegroups:shamoperationgroup(S),theHIEgroup(R),thedexmedetomidine(25μg/kg)group(D1),thedexmedetomidine(50μg/kg)group(D2),theyohimbinegroup(5μg)(Y).P7ratswereoperatedwithouthypoxiainSgroup,andcontinuedhypoxiafor2hinRgroup.AfterHIE2h,P7ratswerepretreatedwithdifferentconcentrationsofdexmedetomidine(25μg/kg,)inD1group,andpretreatedwithdexmedetomidine(50μg/kg)inD2groupandyohimbine(5μg)inYgroup.After24h,theexpressionofcaspase-3wasdetected.Neurologicaldeficitscoreswereusedtoevaluateneurologicalfunction.For4weeksaftertheintervention,Morriswatermazetestwasusedtoevaluatethechangesinlearningandmemoryability.ResultsHIEinRgroupinducedtheup-regulationofcaspase-3andneurologicaldeficitscores,comparedwithSgroup(P<0.05).Dexmedetomidine(25μg/kg, 50μg/kg)andyohimbinepretreatmentmarkedlydown-regulatedtheexpressionofcaspase-3andneurologicaldeficitscores,comparedwithRgroup(P<0.05).TheescapelatencyofRgroupwasincreasedcomparedwithSgroup,andreducedwithD1,D2,Ygroupat2th,3th,4thand5thdayaftertraining(P<0.05).TheescapelatencyofbothD1andD2groupwerereducedat2th,3th,4thand5thday,andincreasedtimeoftargetquadrantcomparedwithRgroup,andreducedcomparedwithSgroup(P<0.05).Neurologicaldeficitscoresandtheexpressionofcaspase-3weresignificantlyreducedinYgroupcomparedwithD1andD2group(P<0.05).TherewerenotsignificantdifferencesbetweenD1andD2groupinneurologicaldeficitscores,theexpressionofcaspase-3andMorriswatermazetest.ConclusionHIEcausesneuronalapoptosisinthehippocampusofneonatalrats,anddecreasetheabilityoflearningangmemoryinlong-termneonatalrats.Theexpressionofcaspase-3wasinhibitedbydexmedetomidinepretreatment(25μg/kg, 50μg/kg),whichreducedtheapoptosisofneurons.DexmedetomidinetreatmentforneonatalratsduringHIEcouldimprovethelong-termlearningandmemoryabilityofneonatalrats.

hypoxic-ischemic,brain;modes,animal;dexmedetomidine

2017-06-14；

2017-08-18

河北省醫(yī)學(xué)科學(xué)研究重點(diǎn)課題(20150222)

薄立軍(1979-)，男，河北唐山人，河北醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院主治醫(yī)師，醫(yī)學(xué)碩士，從事臨床麻醉學(xué)研究。

*通訊作者。E-mail:535498241@qq.com

R735.7

A

1007-3205(2017)09-1068-05

10.3969/j.issn.1007-3205.2017.09.018