易 輝，祖瑞鈴，易玉玲，李 燕

(成都中醫(yī)藥大學(xué)醫(yī)學(xué)技術(shù)學(xué)院，成都 611137)

隱丹參酮對表皮葡萄球菌生物膜的抑制作用

易 輝，祖瑞鈴，易玉玲，李 燕

(成都中醫(yī)藥大學(xué)醫(yī)學(xué)技術(shù)學(xué)院，成都 611137)

目的探索隱丹參酮對表皮葡萄球菌(SE)生物膜不同成熟階段的抑制效果。方法體外構(gòu)建SE生物膜模型，確定其黏附、聚集、成熟階段時間點；通過半定量黏附實驗、XTT法和掃描電鏡檢測不同濃度隱丹參酮作用下SE不同成熟階段中生物膜基質(zhì)量、膜內(nèi)菌代謝活性和微觀形態(tài)結(jié)構(gòu)的變化。結(jié)果SE生物膜黏附、聚集和成熟時間點分別為6、24、48 h；對于黏附階段生物膜，128 μg/mL和32 μg/mL的隱丹參酮均能明顯減少其生物膜基質(zhì)量和殺滅膜內(nèi)菌，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，且隱丹參酮抑制作用128 μg/mL優(yōu)于32 μg/mL，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，同時均能破壞其微觀形態(tài)結(jié)構(gòu)；對于聚集與成熟階段生物膜，僅128 μg/mL的隱丹參酮能明顯減少其生物膜基質(zhì)量和殺滅膜內(nèi)菌，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，同時能破壞其微觀形態(tài)結(jié)構(gòu)，而32 μg/mL的隱丹參酮則無明顯抑制效果(P>0.05)。結(jié)論隱丹參酮對SE生物膜不同成熟階段均具有一定抑制效果，且存在一定的劑量效應(yīng)。

表皮葡萄球菌； 生物膜； 隱丹參酮

[Chin J Infect Control，2017，16(9)：798-803]

近年，高分子材料制成的醫(yī)療植入物的廣泛應(yīng)用，如導(dǎo)管、人工心瓣膜、人工關(guān)節(jié)等，表皮葡萄球菌(Staphylococcusepidermidis，SE)所致感染日趨嚴(yán)重，已位于醫(yī)院感染病原體的第四位。研究[1]表明，細(xì)菌黏附于醫(yī)療植入物表面形成生物膜是該菌致病、難以治愈、容易復(fù)發(fā)的主要原因。目前，臨床多采用大劑量的抗菌藥物治療此類感染，造成該菌耐藥性加劇，相對而言，中藥不易造成細(xì)菌耐藥，在新藥研發(fā)中具有一定的優(yōu)勢。丹參作為川產(chǎn)道地藥材，臨床常用功效為祛瘀止痛、活血通經(jīng)、清心除煩，其有效成分分為脂溶性的丹參酮和水溶性的丹酚酸兩大類，其中丹參酮類化合物(即總丹參酮)還具有抗菌、抗炎作用，但研究和臨床應(yīng)用較少。已有研究[2]發(fā)現(xiàn)，丹參根甲醇提取物對SE、金黃色葡萄球菌、巨大芽孢桿菌、肺炎克雷伯菌、大腸埃希菌等浮游菌表現(xiàn)出較強(qiáng)的抑菌活性，且價格低廉，具有進(jìn)一步開發(fā)應(yīng)用潛力。目前，國內(nèi)外尚未見丹參酮抑制細(xì)菌生物膜形成的相關(guān)報道，本課題組的前期研究中，通過測定總丹參酮及其主要單體成分丹參酮I、丹參酮ⅡA、隱丹參酮、二氫丹參酮Ⅰ對SE的最小抑菌濃度(minimum inhibitory concentration，MIC)和最小生物膜抑菌濃度(minimum biofilm inhibitory concentration，MBIC)，發(fā)現(xiàn)隱丹參酮為丹參酮類化合物中對SE抑菌活性最強(qiáng)的單體成分，故本研究選用隱丹參酮作為靶藥，以萬古霉素為陽性對照藥物，觀察不同濃度藥物作用下SE生物膜形成過程不同階段基質(zhì)量、膜內(nèi)菌代謝活性和微觀形態(tài)結(jié)構(gòu)的變化，探索不同濃度隱丹參酮對SE生物膜不同成熟階段的抑制效果。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗菌株 表皮葡萄球菌1457(生物膜陽性株)和表皮葡萄球菌ATCC 12228(生物膜陰性株)，均由復(fù)旦大學(xué)瞿滌教授惠贈；臨床菌株：本實驗室從成都地區(qū)兩所醫(yī)院收集、鑒定、保存的5株臨床生物膜陽性菌株[3-4]。

1.1.2 主要試劑與儀器 包括隱丹參酮對照品(成都普菲德生物公司)、萬古霉素標(biāo)準(zhǔn)品(中國食品藥品檢定研究院)、XTT試劑(南京凱基生物科技公司)、無菌96孔板和6孔板(美國Costar公司)、酶標(biāo)儀(Nanodrop 2000)、掃描電鏡(日立 1000B)。

1.2 方法

1.2.1 SE黏附、聚集、成熟階段生物膜的建立 參照文獻(xiàn)[5-6]方法略做改動：SE接種至TSB培養(yǎng)基37℃過夜培養(yǎng)，調(diào)節(jié)菌液濃度至1×106CFU/mL，200 μL/孔加至96孔板中，分別于37℃ 0、3、6、12、24、36、48、72、96 h結(jié)束培養(yǎng)，無菌PBS漂洗3次；2.5%戊二醛固定30 min，棄去孔內(nèi)液體；0.1%結(jié)晶紫染液染色5～15 min，自來水沖洗未黏附染料，室溫晾干；加入95%乙醇微振蕩，酶標(biāo)儀檢測A570值，繪制生物膜基質(zhì)生長曲線。

1.2.2 藥物處理 SE接種至TSB中37℃過夜培養(yǎng)，調(diào)節(jié)菌液濃度至1×106CFU/mL，200 μL/孔加至96孔板中37℃培養(yǎng)，分別于1.2.1確立的時間點結(jié)束培養(yǎng)，無菌PBS漂洗3次，200 μL/孔加入以下實驗分組(見表1)的藥液，37 ℃培養(yǎng)24 h。

表1生物膜形成階段和實驗分組情況

Table1Biofilm formation periods and experimental groups

生物膜形成階段及實驗分組干預(yù)藥物 藥物終濃度(μg/mL)6h(黏附) A1不加藥對照0 A2萬古霉素32 A3高濃度隱丹參酮128 A4低濃度隱丹參酮3224h(聚集) B1不加藥對照0 B2萬古霉素32 B3高濃度隱丹參酮128 B4低濃度隱丹參酮3248h(成熟) C1不加藥對照0 C2萬古霉素32 C3高濃度隱丹參酮128 C4低濃度隱丹參酮32

1.2.3 半定量黏附實驗檢測SE生物膜基質(zhì)的變化 參照文獻(xiàn)[7]方法略做改動：按照1.2.2中方法處理后，無菌PBS漂洗3次，戊二醛固定30 min，結(jié)晶紫染液染色5～15 min，自來水沖洗，室溫晾干，加入95%乙醇微振蕩，檢測A570值。

1.2.4 XTT法檢測SE生物膜內(nèi)細(xì)菌代謝活性變化 參照文獻(xiàn)[8-9]方法略做改動：按照1.2.2中方法處理后，無菌PBS漂洗3次，加入 100 μL MH培養(yǎng)基和50 μL XTT工作液，37℃避光培養(yǎng)1～4 h，酶標(biāo)儀檢測A450值。

1.2.5 掃描電鏡觀察SE生物膜微觀形態(tài)變化 按文獻(xiàn)[10]方法略做改動：調(diào)節(jié)SE菌液濃度至1×106CFU/ mL，3 mL/孔加入到無菌6孔板中，每孔加入一片無菌玻片，分別于37℃ 6、24、48 h結(jié)束培養(yǎng)，取出玻片用無菌PBS漂洗3次，然后放入新的無菌6孔板中，3 mL/孔加入表1中實驗分組的藥液，37℃培養(yǎng)24 h，取出玻片用無菌PBS漂洗3次，戊二醛4℃固定2 h，無菌PBS漂洗，依次用濃度為30%、50%、70%、70%、80%、90%、100%的乙醇，4℃梯度脫水10 min，叔丁醇置換及真空干燥后噴金進(jìn)行掃描電鏡觀察拍照(10 000×，10 μm視野)。

2 結(jié)果

2.1 SE生物膜生長曲線及黏附、聚集和成熟時間點確立 SE生物膜生長有3個增長期，分別是0～12 h、12～36 h和36～72 h，其中0～12 h增長最快，對應(yīng)生物膜黏附期，此時浮游SE正不斷黏附到聚丙乙烯微孔板上；12～36 h增長第二快，對應(yīng)生物膜聚集期，此時已經(jīng)黏附于聚丙乙烯微孔板上的SE相互聚集并合成分泌大量胞外基質(zhì)逐漸形成微菌落，同時生物膜也逐漸走向成熟；36～72 h生物膜基質(zhì)量增長緩慢，對應(yīng)生物膜成熟期，此時主要是已形成的微菌落之間相互融合生長，發(fā)育成具有蘑菇狀結(jié)構(gòu)的成熟生物膜。因此，本實驗分別選擇各階段中間時間點6、24、48 h作為SE生物膜的黏附、聚集和成熟點進(jìn)行藥物干預(yù)。見圖1。表皮葡萄球菌 ATCC 12228為生物膜形成陰性株，不能在聚丙乙烯微孔板上形成生物膜，故其黏附于微孔板上的細(xì)菌量基本保持不變。

圖1 SE生物膜生長曲線

2.2 藥物作用下SE生物膜基質(zhì)的變化 SE不同階段生物膜基質(zhì)量的變化見圖2。

圖2SE生物膜基質(zhì)量的變化

Figure2Change in quantity ofS.epidermidisbiofilm matrix

黏附階段：與不加藥對照組相比，32 μg/mL萬古霉素組、128 μg/mL隱丹參酮組和32 μg/mL隱丹參酮組生物膜基質(zhì)量均明顯降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；但128 μg/mL和32 μg/mL隱丹參酮組的抑制作用均不及32 μg/mL萬古霉素組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；32 μg/mL隱丹參酮組又不及128 μg/mL隱丹參酮組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

聚集階段：與不加藥對照組相比，32 μg/mL萬古霉素組和128 μg/mL隱丹參酮組生物膜基質(zhì)量均明顯降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，而32 μg/mL隱丹參酮組則無降低。

成熟階段：與不加藥對照組相比，僅128 μg/mL隱丹參酮組明顯降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，32 μg/mL萬古霉素組和32 μg/mL隱丹參酮組的降低無統(tǒng)計學(xué)意義(均P>0.05)。

2.3 藥物作用下SE生物膜內(nèi)細(xì)菌代謝活性變化 SE不同階段生物膜膜內(nèi)菌代謝活性變化見圖3。黏附和聚集階段呈現(xiàn)結(jié)果一致：與不加藥對照組相比，32 μg/mL萬古霉素組、128 μg/mL隱丹參酮組和32 μg/mL隱丹參酮組生物膜膜內(nèi)菌代謝活性均明顯降低，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(均P<0.05)；但 128 μg/mL和32 μg/mL隱丹參酮組的抑制作用均不及32 μg/mL萬古霉素組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；32 μg/mL隱丹參酮組又不及128 μg/mL隱丹參酮組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。成熟階段：與不加藥對照組相比，僅32 μg/mL萬古霉素組和128 μg/mL隱丹參酮組明顯降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，而32 μg/mL隱丹參酮組則無明顯降低。

圖3SE生物膜內(nèi)細(xì)菌代謝活性變化

Figure3Change in metabolism ofS.epidermidisinside biofilm

2.4 藥物作用下SE生物膜微觀形態(tài)變化 掃描電鏡下SE不同階段生物膜微觀形態(tài)見圖4。黏附階段：不加藥對照組生物膜形態(tài)結(jié)構(gòu)完整，而萬古霉素組、高濃度和低濃度隱丹參酮組生物膜結(jié)構(gòu)均被破壞瓦解。聚集和成熟階段：呈現(xiàn)相似的抑制效果，不加藥對照組生物膜結(jié)構(gòu)復(fù)雜完整，膜內(nèi)細(xì)菌形態(tài)正常，SE分泌了大量胞外基質(zhì)將細(xì)菌包裹于生物膜之中，而低濃度隱丹參酮組生物膜結(jié)構(gòu)無明顯變化，萬古霉素組和高濃度隱丹參酮組生物膜結(jié)構(gòu)雖然存在，但是膜結(jié)構(gòu)遠(yuǎn)遠(yuǎn)不如不加藥對照組完整緊密，且膜厚度明顯減低，膜內(nèi)細(xì)胞可見變形、皺縮、或死亡。

注：A1、B1、C1分別為黏附、聚集、成熟階段不加藥對照組；A2、B2、C2分別為黏附、聚集、成熟階段32 μg/mL萬古霉素作用組；A3、B3、C3分別為黏附、聚集、成熟階段128 μg/mL隱丹參酮作用組；A4、B4、C4分別為黏附、聚集、成熟階段32 μg/mL隱丹參酮作用組

圖4掃描電鏡下SE生物膜微觀形態(tài)(10 000×，10 μm)

Figure4Change in microstructure ofS.epidermidisbiofilm observed by SEM(10 000×，10 μm)

3 討論

一直以來，中藥在控制細(xì)菌感染及多重耐藥性方面具有獨特的優(yōu)勢，已成為繼抗生素之后又一抗感染藥物研究的重點。近年來，國內(nèi)外學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)中藥或中藥活性成分在抑制細(xì)菌生物膜方面顯現(xiàn)了一定的優(yōu)勢，Zeng等[11]發(fā)現(xiàn)穿心蓮內(nèi)酯能夠抑制銅綠假單胞菌生物膜胞外基質(zhì)的形成，并與多種抗菌藥物聯(lián)用表現(xiàn)出協(xié)同抗菌效果；Pammi等[12]發(fā)現(xiàn)，金合歡醇能夠抑制SE生物膜形成，并與利福平和萬古霉素顯現(xiàn)出協(xié)同抗菌作用。丹參作為常用的天然藥物，臨床主要用于治療心腦血管疾病，對其活血化淤、清心除煩的藥理藥效研究較多，而對丹參的抗炎、抗菌作用研究和臨床應(yīng)用較少。丹參的脂溶性提取物(丹參酮類化合物)作為丹參發(fā)揮抗菌作用的最主要物質(zhì)基礎(chǔ)，對大多數(shù)細(xì)菌表現(xiàn)出抑制作用，特別是對葡萄球菌屬細(xì)菌等革蘭陽性菌[13-14]。Lee等[13]測定了隱丹參酮和二氫丹參酮Ⅰ對多種革蘭陽性菌和陰性菌的MIC值，發(fā)現(xiàn)二者對SE抑菌效果好，MIC分別為6.3 μg/mL和3.1 μg/mL；Feng等[15]采用隱丹參酮對臨床21株金黃色葡萄球菌進(jìn)行抑菌試驗，得到隱丹參酮對21株菌的MIC為4～64 μg/mL，具有較好的抑菌效果。盡管已有隱丹參酮抑制細(xì)菌浮游菌生長的相關(guān)報道，但目前尚未見其抑制細(xì)菌生物膜形成的報道。故本研究選擇隱丹參酮為靶藥，觀察隱丹參酮對SE生物膜不同成熟階段的抑制效果，為丹參酮用于預(yù)防和治療生物膜耐藥SE感染的可能性提供實驗依據(jù)。

生物膜是依附于某載體表面的，由胞外多聚物和基質(zhì)包被的高度組織化、系統(tǒng)化的微生物膜性聚合物，其臨床意義為不斷釋放膜內(nèi)細(xì)菌造成感染遷延不愈。對于生物膜狀態(tài)的致病菌，根據(jù)臨床傳統(tǒng)的抗菌藥物敏感性試驗所得到的抗菌藥物治療濃度已經(jīng)完全不能控制此類感染。已有大量證據(jù)表明，殺死生物膜內(nèi)細(xì)菌所用的抗生素濃度是殺死浮游菌所用抗生素濃度的10～1 000倍，因此，目前美國傳染病協(xié)會提出了抗生素鎖定技術(shù)(antibiotic lock technique，ALT)用于治療生物膜引起的醫(yī)療植入物相關(guān)感染[16]?；贏LT的提出，目前許多研究者通過在體外建立生物膜模型，然后使用10～1 000倍MIC的抗菌藥物作用于生物膜，觀察藥物清除生物膜所需的濃度及時間，以便更加準(zhǔn)確地為臨床指導(dǎo)用藥。如Lee等[17]依據(jù)ALT，發(fā)現(xiàn)5 mg/mL的萬古霉素、5 mg/mL的環(huán)丙沙星和5 mg/mL的利福平能夠在5 d內(nèi)清除SE生物膜。根據(jù)本課題組前期實驗中用二倍稀釋法測得隱丹參酮對SE的MIC為2 μg/mL，MBIC為32 μg/mL，故本研究選擇的低濃度隱丹參酮作用濃度為32 μg/mL(16倍MIC)，高濃度隱丹參酮為128 μg/mL(64倍MIC)，觀察藥物作用生物膜的劑量效應(yīng)。同時，通過建立SE生物膜生長曲線，以確定細(xì)菌黏附、聚集和成熟各個階段時間點，在不同時間點給予藥物干預(yù)，從而更加全面、深入地探討藥物對其抑制效果。由于萬古霉素是臨床治療葡萄球菌感染的最后一道防線，故本研究選擇其為陽性對照藥物。

本研究首次證明了隱丹參酮一定程度上能夠抑制SE生物膜各個階段基質(zhì)形成、膜內(nèi)菌代謝活性、破壞生物膜整體微觀形態(tài)，且此抑制作用存在一定的劑量效應(yīng)。隨著生物膜成熟度的增高，高濃度的隱丹參酮抑制作用強(qiáng)于低濃度的隱丹參酮，甚至對于成熟生物膜結(jié)構(gòu)，低濃度的隱丹參酮并不能發(fā)揮抑制作用，證實了細(xì)菌形成生物膜后耐藥性會明顯增強(qiáng)，臨床必須使用高劑量的藥物濃度才能達(dá)到控制生物膜感染的目的，也說明應(yīng)進(jìn)一步設(shè)置藥物作用的濃度梯度，尋找抑制生物膜形成的藥物濃度拐點，才能真正為隱丹參酮防治生物膜耐藥的SE感染提供科學(xué)的、有價值的實驗依據(jù)。

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(本文編輯：左雙燕)

InhibitoryeffectofcryptotanshinoneonbiofilmofStaphylococcusepidermidis

YIHui,ZURui-ling,YIYu-ling,LIYan

(CollegeofMedicalTechnology,ChengduUniversityofTCM,Chengdu611137,China)

ObjectiveTo investigate the inhibitory effect of cryptotanshinone on different maturation stages ofStaphylococcusepidermidis(S.epidermidis) biofilm.MethodsThe biofilm model ofS.epidermidiswas constructed in vitro, the timing of adhesion, accumulating, and maturation was determined; matrix quantity, bacterial metabolism, microstructure of biofilm were detected with semi-quantitative adhesion test, XTT assay, and scanning electron microscope(SEM) respectively.ResultsThe timing of adhesion, accumulating, and maturation ofS.epidermidisbiofilm were 6h, 24h,and 48h respectively; in adhesion period, cryptotanshinone at the concentration of 128μg/mL and 32μg/mL could both obviously reduce the matrix and kill bacteria inside biofilm, difference was statistically significant(P<0.05)，inhibitory effect of 128μg/mL cryptotanshinone was better than 32μg/mL (P<0.05), the microstructure was destroyed by both concentrations. During accumulating and mature period, only cryptotanshinone at 128μg/mL could reduce the matrix of biofilm and kill bacteria inside biofilm (P<0.05), the microstructure was damaged by cryptotanshinone at concentration of 128μg/mL, while 32g/mL of cryptotanshinone had no obvious inhibitory effect(P>0.05).ConclusionCryptotanshinone has a certain inhibitory effect on different stages ofS.epidermidisbiofilm, and there is a certain dose effect.

Staphylococcusepidermidis; biofilm; cryptotanshinone

2016-11-24

四川省科技廳應(yīng)用基礎(chǔ)項目(2015JY0159)

易輝(1991-)，女(漢族)，四川省成都市人，碩士研究生，主要從事感染微生物的實驗診斷及耐藥性研究。

李燕 E-mail：1067267085@qq.com

10.3969/j.issn.1671-9638.2017.09.002

R378.1+1

A

1671-9638(2017)09-0798-06