吳麗莉

摘要：傳統(tǒng)的土壤微生物分離培養(yǎng)、鑒定技術(shù)難以深入了解微生物的生態(tài)學(xué)特性和多樣性，而分子生物學(xué)方法可以獲取更加豐富的土壤微生物群落多樣性信息，包括傳統(tǒng)方法無法培養(yǎng)的土壤微生物。本文就目前土壤微生物的多樣性研究中使用的分子生物學(xué)技術(shù)進(jìn)行探討研究，并對各個(gè)分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)的特點(diǎn)做了比較分析。

關(guān)鍵詞：土壤微生物；生物多樣性；分子生物學(xué)；DNA

一、土壤微生物多樣性的定義

土壤微生物的多樣性體現(xiàn)在生物體在遺傳、種類和生態(tài)系統(tǒng)層次上的差異和變化，也反映了土壤生態(tài)機(jī)制對微生物群落的影響。土壤微生物多樣性還可以理解為豐富的微生物生命。一般由土壤生物區(qū)的變化和生物化學(xué)過程間的關(guān)系來體現(xiàn)。

二、土壤微生物多樣性研究中運(yùn)用的分子生物學(xué)技術(shù)

（一）土壤微生物DNA復(fù)性動(dòng)力學(xué)分析

實(shí)驗(yàn)表明，可以通過測定微生物群落DNA的復(fù)性率和解鏈行為來確定土壤微生物群落的大體成分和整體遺傳多樣性。微生物多樣性的復(fù)雜程度隨著DNA的同源性變化，DNA同源性越差，多樣性越復(fù)雜，DNA的復(fù)性率就越低。在受不同程度重金屬污染的土壤中微生物多樣性的變化中這種方法被Sandaa等所采用。沒有受到污染的對照土壤通過該技術(shù)分析顯示含有32 000個(gè)細(xì)菌基因組，而這個(gè)數(shù)字在受重金屬污染程度較輕的土壤是1 2800，在受嚴(yán)重重金屬污染的土壤是4000個(gè)，相比未受污染的土壤中的細(xì)菌基因組分別減少了60%和90%。由數(shù)據(jù)可知，土壤受到污染越嚴(yán)重，土壤微生物多樣性越低。但這個(gè)技術(shù)有明顯的缺點(diǎn)，即分辨率不高，僅僅用這個(gè)技術(shù)來分析只能知道土壤微生物群落的大體情況，并不能精確表示微生物多樣性的變化情況。因此在實(shí)際研究中，還需要結(jié)合核酸雜交等更好的技術(shù)才能得到更精確的結(jié)果。

（二）核酸分子雜交技術(shù)

20世紀(jì)70年代出現(xiàn)了分子生物學(xué)技術(shù)——核酸分子雜交技術(shù)。這種技術(shù)的原理是根據(jù)核酸分子堿基互補(bǔ)配對的原則，將待測微生物的DNA或RNA與特異性探針進(jìn)行雜交形成新的分子。核酸分子雜交技術(shù)由于其特異性靈敏性高的優(yōu)點(diǎn)，在近年的微生物多樣性研究中被廣泛應(yīng)用。其中最為常用的的手段是近年來發(fā)展起來的熒光原位雜交技術(shù)。它可以鑒定細(xì)胞形態(tài)和微生物種群結(jié)構(gòu)，進(jìn)行樣品的原位雜交，也可用于測定細(xì)胞活性和計(jì)數(shù)。該技術(shù)根據(jù)已知微生物的不同類別種群特殊的DNS序列用熒光標(biāo)記的特殊寡聚核苷酸片段作為探針，與待測微生物的DN分子雜交，以測定該微生物群落多樣性的豐度。研究結(jié)果也顯示，土壤微生物的多樣性隨土壤受污染程度的升高而下降，但是熒光原位雜交技術(shù)（FISH）對于土壤樣品的靈敏度較低。

（三）基于PCR的分子生物學(xué)研究技術(shù)

PCR技術(shù)的出現(xiàn)和運(yùn)用使土壤微生物生態(tài)學(xué)研究獲得飛躍發(fā)展。由于土壤微生物群落的16S rRNA、18S rDNA 或ITS 區(qū)域目標(biāo)基因含有高度保守序列、多拷貝序列和高度可變序列，因而其基因結(jié)構(gòu)相對穩(wěn)定，利于設(shè)計(jì)特異性引物，現(xiàn)已成為細(xì)菌分類學(xué)研究中最常用最有效的分子鐘。此外，真菌ITS的分析也越來越受到重視，因?yàn)槠湫蛄兄邪Ｊ睾涂勺冃畔ⅰ？梢越柚锰禺愋曰蛲ㄓ靡镌谥苯犹崛『图兓寥牢⑸飿悠返目侱NA后擴(kuò)增目標(biāo)片段，然后分期目標(biāo)片段?；赑CR的分子生物學(xué)技術(shù)有以下幾種。

1. 變性梯度凝膠電泳和溫度梯度凝膠電泳（DGGE/TGGE）。該技術(shù)的原理是對DNS雙鏈分子使用化學(xué)變性劑或溫度對其進(jìn)行處理，以分離序列不同但長度相同的DNA片段?？梢愿鶕?jù)條帶的位置和電泳條帶的數(shù)量大致確定土壤中的微生物種類，對土壤中的微生物的多樣性進(jìn)行粗略分析。此方法有很高的靈敏度，通過成像系統(tǒng)分析染色后的凝膠，切下目標(biāo)帶進(jìn)行擴(kuò)增或測序可以獲取更完整的信息。除此之外DGGE/TGGE技術(shù)因?yàn)槟芡瑫r(shí)測定多個(gè)土壤樣品的微生物群落構(gòu)成和變化情況，具有可重復(fù)性、快速等特點(diǎn)，所以被廣泛應(yīng)用在土壤微生物的多樣性研究等方面。其缺點(diǎn)是，目前還不能檢測到所有的微生物多樣性，特變是難以檢測到劣勢微生物種群。

2.單鏈構(gòu)象多態(tài)性（SSCP）。SSCP方法的原理是，單鏈DNA的構(gòu)象會(huì)隨著堿基的變化而變化，而具有不同空間構(gòu)象的單鏈DNA分子在非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳中的帶型也不同，以此精確地區(qū)分二級結(jié)構(gòu)不同但大小一樣的PCR產(chǎn)物。在研究高溫堆肥微生物群落、根系微生物、受污染的土壤微生物生態(tài)多樣性方面SSCP方法已經(jīng)被成功應(yīng)用。比如通過該方法分析根系微生物，已準(zhǔn)確地檢測到微生物群落的動(dòng)態(tài)變化，SSCP方法比傳統(tǒng)培養(yǎng)更加省時(shí)省力，避免了誤差大的干擾，在對微生物群落結(jié)構(gòu)和演替的分析中非常適用。

3.限制性片段長度多態(tài)性（RFLP）/擴(kuò)增核糖體DNA限制性分析（ARDRA）。限制性片段長度多態(tài)性（RFLP）另一個(gè)名稱是擴(kuò)增核糖體DNA限制性分析（ARDRA），該技術(shù)通過通用引物擴(kuò)增DNA目標(biāo)片段（如：16S rDNA），然后將其克隆轉(zhuǎn)移至大腸桿菌中，將陽性克隆篩選出來，建立16S rDNA克隆文庫。然后用帶有目標(biāo)基因的克隆細(xì)胞作為PCR模板，利用限制性內(nèi)切酶對PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行酶切，進(jìn)過電泳之后，可對酶切片段進(jìn)行限制性多態(tài)性分析。該技術(shù)的特點(diǎn)是能對微生物種群的目標(biāo)DNA構(gòu)成進(jìn)行直接研究，而且限制性內(nèi)切酶識(shí)別序列專一性使得RFLP技術(shù)就有較高的可靠性。此外，該技術(shù)涉及較多的遺傳信息，因此具有較強(qiáng)的區(qū)分種群差異的能力。

4.末端限制片段長度多態(tài)性（T-RFLP）。T-RFLP是在RFLP方法的基礎(chǔ)上加以改良，在PCR擴(kuò)增16S rRNA基因過程中，使用熒光標(biāo)記一個(gè)引物用，而且僅僅分析被標(biāo)記的末端限制片段，以此簡化多態(tài)性圖譜，使得每個(gè)可見的條帶都代表一個(gè)“核型”或一個(gè)分類單元，最后得到一個(gè)微生物群落的特征指紋圖譜?？捎糜诒容^不同群落的相似性和檢測污染造成的群落結(jié)構(gòu)在時(shí)空上的變化。

5.隨機(jī)引物擴(kuò)增多態(tài)性方法（RAPD）。RAPD方法在非嚴(yán)格條件下運(yùn)用短的任意序列引物進(jìn)行PCR，使得可以同時(shí)擴(kuò)增基因組的多個(gè)位點(diǎn)，讓后將PCR產(chǎn)物進(jìn)行凝膠電泳分析。該方法可以同時(shí)在一次試驗(yàn)中觀測到大量DNA多態(tài)性片段，方法簡單，靈敏度高，成本較低。例如運(yùn)用RAPD方法分析四種受到農(nóng)業(yè)污染的土壤微生物的多樣性，發(fā)現(xiàn)土壤中的微生物數(shù)量因?yàn)槭褂脷⑾x劑而降低。但是多樣性依然較高，而用過化肥的土壤中的微生物數(shù)量很高，但多樣性卻下降了。endprint

6.擴(kuò)增片段長度多態(tài)性（AFLP）。擴(kuò)增片段長度多態(tài)性是基于PCR和RFLP的一種DNA指紋技術(shù)。該技術(shù)結(jié)合PCR的高效性和RFLP的可靠性，選擇性擴(kuò)增基因組對基因組DNA酶切片段，通過切割兩種以上的酶形成有不同酶切位點(diǎn)的限制酶切片段，然后在片段上增加雙鏈人工接頭，AFLP修飾了PCR的引物，結(jié)合引物與酶切片段識(shí)別序列，其核心序列與人工接頭互補(bǔ)，從而實(shí)現(xiàn)了選擇性擴(kuò)增。該技術(shù)能有效地呈現(xiàn)微生物多樣性程度，AFLP標(biāo)記理論上數(shù)目是無限的，其重復(fù)性較好。

7.核糖體間隔序列分析（RISA）/自動(dòng)核糖體間隔序列分析（ARISA）。RISA和ARISA是一種分子指紋技術(shù)，基于核糖體分析土壤微生物。它也是利用PCR技術(shù)對細(xì)菌高度可變序列IGS區(qū)域進(jìn)行擴(kuò)增，再利用變性聚丙烯酰胺凝膠電泳使其變性和分離，從而獲取各種微生物指紋信息。ARISA不同于RISA，其正向引物用熒光標(biāo)記，且自動(dòng)完成測試。其靈敏性高、可重復(fù)，比RISA方法更加省時(shí)高效，不要的DNA樣品也更少。目前ARISA法被廣泛應(yīng)用于檢測土壤微生物多樣性、測定污染土壤的微生物多樣性、微生物群落結(jié)構(gòu)的檢測等方面。

三、結(jié)束語

綜上所述，這些技術(shù)都可以運(yùn)用在土壤微生物多樣性的檢測上，每種方法都有各自的優(yōu)缺點(diǎn)，都存在局限性。而當(dāng)前最合理的方式是綜合運(yùn)用多種方法研究土壤微生物多樣性，以獲取盡量完整的信息。此外，我們有必要繼續(xù)探索更新的研究技術(shù)，如果能找到更好的方法來研究土壤微生物多樣性，那么我們就能更加清晰準(zhǔn)確地解土壤微生物的種類和及其和環(huán)境之間的關(guān)系?，F(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)給我們的研究提供了更多的可能，幫助我們打開了土壤微生物世界的大門。筆者相信，有機(jī)結(jié)合現(xiàn)代分子生物技術(shù)與其他方法，一定能幫助我們更好地認(rèn)識(shí)研究土壤微生物多樣性。

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