王晉+鄭亞萍

摘 要：目的： 阻斷Wnt信號通路對多發(fā)性骨髓瘤骨病作用；方法： 收集30例診斷為多發(fā)性骨髓瘤患者和18例健康對照組的臨床資料、血清；采用ELISA方法測定血清SDF-1，DKK-1水平；體外培養(yǎng)多發(fā)性骨髓瘤細胞株，分別加入35ng/ml SDF-1和100ng/mlDKK-1，通過 Western Blot 方法觀察DKK-1的表達量；采用 SPSS Statistics 13. 0進行統(tǒng)計學分析。當P<0. 05時認為存在統(tǒng)計學差異。結(jié)果：MM患者（n=30）血清SDF-1水平顯著高于健康對照（n=18） （（3724.5土 1586.8）pg/ml VS （3028.6±587.4）pg/ml， P =0.015）。MM 患者血清 DKK-1 水平亦顯著高于健康對照[（3814.6土3487. 8）pg/ml VS （1881.3土657.8）pg/ml，P=0.029]。在體外培養(yǎng)MM細胞株，采用35ng/ml SDF-1作用于MM細胞和100ng/mlDKK-1作用于MM細胞，Western Blot結(jié)果：顯示在SDF-1介導下，DKK-1的表達量較對照組及SDF-1組都有明顯升高（P <0.005）。結(jié)論 SDF-1與DKK-1共同介導多發(fā)性骨髓瘤。

關(guān)鍵詞：SDF-1 DKK-1 多發(fā)性骨髓瘤

基質(zhì)細胞衍生因子（Stromal cell derived factor， SDF-1）是通過CXCR4受體調(diào)節(jié)成骨系統(tǒng)。SDF-1主要是由骨髓間充質(zhì)干細胞（bone marrow derived stroma cell，BMSC）分泌，而SDF-l具有促進破骨細胞（Osteoclast ， OC）活化及骨吸收作用。近年來SDF-l在骨髓瘤骨病中的作用逐漸受到關(guān)注，與其配體CXCR4趨化瘤細胞。但SDF-1/CXCR4對多發(fā)性骨髓瘤患者（multiple myeloma， MM）成骨作用的影響目前尚未見報道，在MM患者血清SDF-l與DKK1二者是否相互作用促進骨髓瘤骨病發(fā)生尚不明確。

一、材料和方法

1.材 料

收集2014年10月至2015年6月收集漯河市中心醫(yī)院血液科多發(fā)性骨髓瘤病例，30例；收集2014年10月與漯河市中心醫(yī)院體檢中心進行健康體檢，18例；細胞株：人多發(fā)性骨髓瘤細胞株，漯河醫(yī)學高等?？茖W?？蒲兄行膬Υ?。RPMI1640培養(yǎng)（ Gibcol），人淋巴細胞分離液（TBD），胰蛋白酶（Gibco公司），胎牛血清（ 四季青），兔抗actin（ 多克隆抗體， Abcom），兔抗DKK-1（ 多克隆抗體，Sigma），辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔 IgG抗體（ 碧云天）。

2.方法

（1）血清分離 采集患者治療前及治療后或者復發(fā)及健康成人外周血各10mL，EDTA抗凝，3000rpmXl5min離心，取上清液。ELISA檢測血清中SDF-1的含量。

（2）MM培養(yǎng)1640培養(yǎng)基中培養(yǎng)，2-3天換液，當細胞密度大于1XlO6/ml時，進行傳代， 加入SDF-1剌激，將細胞分為兩組，其一加入35ng/ml SDF-1，另一組加入100ng/ml DKK-1溶液，培養(yǎng)48h后收集細胞，提取蛋白。Western Blot檢測DKK-1蛋白表達量。

（3）統(tǒng)計學處理：采用 SPSS13.0 軟件進行方差分析 數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差（x±s）表示，P <0.05 說明差異有統(tǒng)計學意義。

二、結(jié)果

MM患者（n=30）血清SDF-1水平顯著高于健康對照（n=18） （（3724.5土 1586.8）pg/ml VS （3028.6±587.4）pg/ml， P =0.015）。MM 患者血清 DKK-1 水平亦顯著高于健康對照（（3814.6土3487. 8）pg/ml VS （1881.3土657.8）pg/ml，P=0.029）。在體外培養(yǎng)MM細胞株，采用35ng/ml SDF-1作用于MM細胞和100ng/mlDKK-1作用于MM細胞，Western Blot結(jié)果：顯示在SDF-1介導下，DKK-1的表達量較對照組及SDF-1組都有明顯升高（P <0.005）。

三、討論

研究證明（組織形態(tài)學），MM患者的骨吸收增加的同時破骨細胞（OC）數(shù)量和活性也相應(yīng)在增加。而腫瘤細胞與OC之間交流密切，相互促進，形成惡性循環(huán)[1]。研究表明，Wnt信號通路可以調(diào)節(jié)骨的代謝和維持骨質(zhì)穩(wěn)態(tài)[2]，DKK-1是Wnt信號通路的一種可溶性抑制劑[3]。DKK-1阻斷劑可通過阻斷Wnt信號通路而阻斷成骨細胞分化進而調(diào)節(jié)成骨細胞。本實驗首先比較了MM患者組與健康對照組中血清SDF-1水平，發(fā)現(xiàn)MM患者血清SDF-1 水平較對照組顯著升高，具有統(tǒng)計學意義。

在MM疾病中，SDF-1和DKK-l的關(guān)聯(lián)是一種特有情況。主要是表達在造血干細胞和淋巴細胞表面。SDF-lct對于破骨作用的增強已得到廣泛認可[4]。其能夠增加0C活力和骨吸收活性，破骨激活的相關(guān)基因包括RANK，RANKL，TRAP等表達增加。但在MM疾病狀態(tài)中，本研究結(jié)合血清SDF-1和DKK-l的水平，為了進一步深層的解釋SDF-1與DKK-1之間在蛋白之間的關(guān)系，及他們之間的相關(guān)性，體外培養(yǎng)MM細胞株，提取蛋白用Western Blot檢測，研究結(jié)果顯示，SDF-1可以促使DKK-1的表達上調(diào)（如圖1），可推斷，Wnt信號通路受到抑制，DKK-1對于破骨作用有增強的作用，也使成骨作用減弱，從而打破了骨吸收與骨形成的動態(tài)平衡。

為了進一步研究其機制，有研宄人員通過建立敲除CXCR4基因的小鼠模型，因而進一步證實SDF-1/CXCR4軸參與并介導成骨的分化，而且對以后發(fā)育骨豁起到了一個非常重要作用。本研宄創(chuàng)新性地發(fā)現(xiàn)SDF-l和DKK-1密切作用，DKK-1抑制劑目前已進入臨床試驗階段。

參考文獻

[1] Roodman GD. Pathogenesis of myeloma bone disease[J]. Blood cells，molecules & diseases， 2004， 32 （2） ：290 - 2.

[2] Hosogane N. Stromal derived factor-1 regulates bone morphogenetic protein 2-induced osteogenic differentiation of primary mesenchymal stem cells [J]. The international journal of biochemistry cell biology， 2010， 42（7）：1132 -41.

[3] Zhu W， Liang G， Huang Z， et al. Conditional inactivation of the CXCR12 receptor in osteoprecursors reduces postnatal bone formation due to impaired osteoblast development [J]. The Journal of biological chemistry ， 2011， 286（30）：26794 – 805.

[4] Zannettino ACff. Elevated serum levels of stromal-derived factor—lalpha are associated with increased osteoclast activity and osteolytic bone disease in multiple myeloma patients [J]. Cancer research， 2005， 65（5）：1700-9.endprint