何文棟朱葆華馮磊力常雅青楊官品潘克厚,

(1. 海水養(yǎng)殖教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(中國海洋大學(xué)), 青島 266003; 2. 中國海洋大學(xué)海洋生命學(xué)院, 青島 266003; 3. 青島海洋科學(xué)與技術(shù)國家實(shí)驗(yàn)室, 海洋漁業(yè)科學(xué)與食品產(chǎn)出過程功能實(shí)驗(yàn)室, 青島 266003)

微擬球藻富油藻株篩選及柱狀光生物反應(yīng)器培養(yǎng)評(píng)價(jià)研究

何文棟1朱葆華1馮磊力1常雅青1楊官品2潘克厚1,3

(1. 海水養(yǎng)殖教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(中國海洋大學(xué)), 青島 266003; 2. 中國海洋大學(xué)海洋生命學(xué)院, 青島 266003; 3. 青島海洋科學(xué)與技術(shù)國家實(shí)驗(yàn)室, 海洋漁業(yè)科學(xué)與食品產(chǎn)出過程功能實(shí)驗(yàn)室, 青島 266003)

研究以親脂性熒光染料BODIPY505/515和流式細(xì)胞儀為基礎(chǔ), 從多株誘變海洋微擬球藻(Nannochloropsis oceanica)中篩選到4株候選富油藻株(MT-1,2,3,4), 并利用柱狀光生物反應(yīng)器對(duì)誘變株的產(chǎn)油能力進(jìn)行了綜合評(píng)價(jià)。結(jié)果表明, 藻株篩選時(shí)最佳BODIPY505/515使用濃度為0.87 μg/mL, 染色時(shí)間為10min; 4株誘變株產(chǎn)油性能較野生株有較大提高, 其中MT-4油脂積累達(dá)到了干重的66%, 油脂產(chǎn)率比野生型藻株提高了45%, 達(dá)到了27.32 mg/(L·d)。4株誘變株的脂肪酸組成合適, 其中C16和C18之和占78%以上, 且主要以飽和脂肪酸和單不飽和脂肪酸為主; 多不飽和脂肪酸只占總脂肪酸的6%—8%, 非常適合生物柴油生產(chǎn)。研究提供了一種針對(duì)海洋微擬球藻富油藻株快速、有效的篩選方法, 并以此為基礎(chǔ)篩選得到4株極具生物柴油生產(chǎn)潛力的候選藻株, 有望用于規(guī)?；a(chǎn)。

生物柴油; 海洋微擬球藻; BODIPY505/515; 誘變篩選; 柱狀光生物反應(yīng)器

由于化石能源的不可再生性以及其消耗對(duì)環(huán)境造成的污染, 尋找可再生、清潔型能源勢(shì)在必行[1]。生物柴油由于其不含硫、閃點(diǎn)高、易儲(chǔ)存運(yùn)輸、易降解等優(yōu)點(diǎn), 近年來備受關(guān)注[2,3]。微藻具備生長快、生物量大、光合作用效率高、油脂含量高等優(yōu)點(diǎn)而被認(rèn)為是最具潛力的生物柴油生產(chǎn)原料[4—7]。

微擬球藻(Nannochloropsis)屬真眼點(diǎn)藻綱(Eustigmatophyceae), 微擬球藻屬, 直徑約2—3 μm, 在海水和淡水中均有分布。其生長速度快, 能夠在1d內(nèi)實(shí)現(xiàn)生物量倍增, 油脂含量高, 且脂肪酸組成非常適合生物柴油的生產(chǎn)[8,9]。盡管微擬球藻應(yīng)用潛力巨大, 但以此生產(chǎn)生物柴油的成本仍然很高。降低生物柴油生產(chǎn)成本的方式眾多, 選育優(yōu)良藻株是其中一個(gè)重要環(huán)節(jié)。誘變育種作為一種簡單易行的育種策略, 若能結(jié)合高效的篩選方法, 將有助于為生物柴油生產(chǎn)提供更多的候選優(yōu)良藻株, 從而降低生產(chǎn)成本。

BODIPY505/515是一種親脂性的熒光染料, 能夠特異性的與中性脂結(jié)合, 具有摩爾消光系數(shù)和熒光量子產(chǎn)量高, 發(fā)射波譜范圍窄, 不受微藻自身熒光干擾等良好的光譜性質(zhì)[10,11], 可以應(yīng)用在微藻富油藻株的篩選中。本研究利用BODIPY505/515結(jié)合流式細(xì)胞儀的方法, 對(duì)亞硝基胍(NTG)誘變后的海洋微擬球藻進(jìn)行篩選, 并在柱狀光生物反應(yīng)器中對(duì)篩選得到的4株誘變?cè)逯赀M(jìn)行了產(chǎn)油特性驗(yàn)證評(píng)價(jià), 旨在提供一種快速、有效篩選富油藻株的方法, 為優(yōu)良富油藻株的選育提供參考。

1 材料與方法

1.1 藻種及培養(yǎng)方法

野生型海洋微擬球藻(N. oceanica)取自中國海洋大學(xué)應(yīng)用微藻生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室微藻種質(zhì)庫。所有誘變株(共92株)均由原始藻株經(jīng)NTG誘變后得到。培養(yǎng)條件如下: 光照強(qiáng)度約50 μmol/(m2·s)(日光燈光源); 培養(yǎng)溫度(25±1)℃; 光暗周期12h:12h。

1.2 誘變?cè)逯甑暮Y選及柱狀光生物反應(yīng)器驗(yàn)證

誘變?cè)逯昱囵B(yǎng)至平臺(tái)期初期后, 接種至100 mL錐形瓶中(20 mL培養(yǎng)體系), 起始接種密度為105個(gè)細(xì)胞/mL。在培養(yǎng)至平臺(tái)期后, 將所有誘變株的藻細(xì)胞濃度調(diào)整為106個(gè)細(xì)胞/mL, 并向其中加入DMSO (終濃度2%), 常溫下預(yù)處理10min; 經(jīng)BODIPY505/515染色后, 使用流式細(xì)胞儀(激發(fā)波長488 nm,發(fā)射波長為515 nm)對(duì)誘變?cè)逯甑臒晒庵颠M(jìn)行測(cè)定。染色處理設(shè)置如下: 首先, 在基礎(chǔ)染色時(shí)間定為15min的條件下, 設(shè)置不同的BODIPY505/515梯度(0.12、0.37、0.62、0.87、1.12和1.49 μg/mL)以確定最佳染色濃度。然后, 在最佳染色濃度下進(jìn)一步探討不同染色時(shí)間對(duì)結(jié)果的影響(5、10、15和20min)。每個(gè)樣品設(shè)置3個(gè)重復(fù)。

篩選后使用柱式反應(yīng)器對(duì)熒光值最高的4株誘變?cè)逯赀M(jìn)行培養(yǎng), 并對(duì)產(chǎn)油表現(xiàn)進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)。反應(yīng)柱直徑6 cm, 培養(yǎng)體積800 mL。培養(yǎng)條件如下:培養(yǎng)溫度20—26℃, 光照強(qiáng)度54—90 μmol/(m2·s) (日光燈光源), 光暗周期12h:12h。以CO2和空氣的混合氣體進(jìn)行通氣培養(yǎng)(CO2體積占比1.5%), 通氣速率為200 mL/min。每個(gè)藻株設(shè)置3個(gè)重復(fù)。

1.3 生長曲線繪制及比生長速率測(cè)定

每天定時(shí)取樣, 用分光光度計(jì)(Hitachi U-3310)測(cè)定OD750并繪制生長曲線。比生長率通過公式K=(lnNt–lnN0)/(t1–t0)計(jì)算, Nt和N0分別為在時(shí)間t1和t0時(shí)的吸光值[12]。

1.4 葉綠素含量及PSII最大光能轉(zhuǎn)化效率(Fv/Fm)測(cè)定

每天定時(shí)取樣, 將藻液稀釋至適當(dāng)濃度, 暗適應(yīng)15min后, 使用Water-PAM水樣葉綠素?zé)晒鈨x(Walz, Germany)測(cè)定Fv/Fm。葉綠素a使用甲醇進(jìn)行提取, 并通過公式u=13.43A665v/(lV)計(jì)算[13], v為藻液體積(mL), V為甲醇體積(mL), l為測(cè)量光程(cm)。

1.5 總脂和油脂產(chǎn)率

總脂使用重量法進(jìn)行測(cè)定, 具體步驟參照文獻(xiàn)[14, 15]。油脂產(chǎn)率通過公式PL=PDMDW×LW計(jì)算[16]。PDMDW代表生物量產(chǎn)率, LW為總脂含量(%, 占干重百分比)。

1.6 甘油三酯(TAG)分析

甘油三酯分析采用薄層層析法[17]進(jìn)行。將TAG標(biāo)準(zhǔn)品和樣品滴加至硅膠板, 樣品量為2 μL,展層劑體系為正己烷:乙醚:乙酸=70:30:1。將點(diǎn)好樣的硅膠板置于展缸中無展層液的一側(cè), 5min后待揮發(fā)的展層液浸潤硅膠板后, 將展層液傾斜至展缸另一側(cè)。展層后將層析板置于通風(fēng)櫥內(nèi)吹干, 然后放入含少量碘粒的燒杯中, 37℃恒溫顯色5— 10min, 三酰甘油標(biāo)準(zhǔn)品為美國Sigma產(chǎn)品(Glyceryl trioleate T7140-500MG), 所用硅膠板為TCL Silica gel 60 F254(Merck Millipore)。

1.7 脂肪酸組成

脂肪酸測(cè)定使用氣相色譜法, 具體參考文獻(xiàn)[15, 18]。

1.8 數(shù)據(jù)分析

采用軟件SPSS16.0進(jìn)行單因素方差分析(ANOVA),并進(jìn)行多重比較(LSD), 顯著水平為P＜0.05。

2 結(jié)果

2.1 最佳篩選條件

由圖 1可以看出, 在BODIPY505/515濃度為0.12—1.12 μg/mL時(shí), 藻細(xì)胞熒光強(qiáng)度隨BODIPY505/515濃度的增加而增加; 而當(dāng)濃度繼續(xù)增加至1.49 μg/mL時(shí), 藻細(xì)胞熒光值反而有所降低。另外, 在BODIPY505/515濃度達(dá)到1.12 μg/mL后, 其背景熒光值開始急劇增加。從實(shí)驗(yàn)的準(zhǔn)確性及經(jīng)濟(jì)性考慮, 最終確定BODIPY505/515的最佳使用濃度為0.87 μg/mL。

圖 1 不同BODIPY濃度下藻細(xì)胞自發(fā)熒光, BIDIPY背景熒光和藻細(xì)胞染色后熒光值Fig. 1 Microalgae autofluorescence, BODIPY505/515autofluorescence and fluorescence of microalgae stained by different concentrations of BODIPY505/515

由圖 2可以看出, 藻細(xì)胞經(jīng)BODIPY505/515染色后, 在5—10min時(shí), 熒光值隨染色時(shí)間的增加而升高; 染色時(shí)間達(dá)到10min后, 藻細(xì)胞熒光值基本穩(wěn)定。因此, 本實(shí)驗(yàn)確定的針對(duì)海洋微擬球藻富油藻株的最佳篩選條件為: BODIPY505/515濃度為0.87 μg/ mL, 染色時(shí)間10min。

2.2 誘變?cè)逯晟L情況和生物量

由圖 3和表 1可以看出, 野生型藻株與誘變?cè)逯?MT-1、MT-2、MT-3、MT-4)生長趨勢(shì)一致, 但誘變?cè)逯甑纳L速率高于野生型藻株。MT-1、MT-2、MT-3、MT-4的終生物量分別為397.11、410.11、442.14和494.04 mg/L, 均顯著高于野生型藻株。

圖 2 BODIPY染色時(shí)間對(duì)海洋微擬球藻熒光值的影響

2.3 葉綠素a含量及Fv/Fm

如圖 4所示, 除MT-1外, 其他3株誘變?cè)逯甑娜~綠素a含量(μg/mL)顯著高于野生型藻株。由圖 5可以看出, 誘變?cè)逯昱c野生型藻株的Fv/Fm在培養(yǎng)過程中變化趨勢(shì)基本一致: 在第4天達(dá)到最大值, 隨后逐漸降低, 在指數(shù)生長末期不同藻株之間Fv/Fm差異顯著。

2.4 總脂含量和油脂產(chǎn)率

5株藻經(jīng)柱狀光生物反應(yīng)器通氣培養(yǎng)后, 總脂含量均達(dá)到了60%以上, 誘變?cè)逯甑目傊亢陀椭a(chǎn)率均顯著高于野生型藻株(表 1), 其中, 藻株MT-4的油脂產(chǎn)率較野生型藻株提高了45%。

2.5 甘油三酯(TAG)分析

圖 6中TAG標(biāo)準(zhǔn)品經(jīng)層析染色后結(jié)果標(biāo)示了TAG層析后的位置。通過對(duì)比硅膠板中部顯現(xiàn)的圓形斑點(diǎn)的大小可以比較不同藻株總脂中TAG的相對(duì)含量。由結(jié)果可知, 4株誘變?cè)逯甑腡AG含量均高于野生型藻株, 說明誘變?cè)逯暝赥AG含量方面相對(duì)于野生型藻株更適合生物柴油的生產(chǎn)。

2.6 脂肪酸組成分析

由表 2可以看出, 微擬球藻脂肪酸主要由C14、C16、C18和C20組成, C16和C18之和占總脂肪酸含量的78%以上; 飽和脂肪酸(SFA)和單不飽和脂肪酸(MUFA)含量占總脂肪酸的比例達(dá)83%以上;而多不飽和脂肪酸(PUFA)含量只有6%—8%, 主要為C20:5(EPA), 含量為總脂肪酸的4%—5%。

3 討論

流式細(xì)胞儀結(jié)合熒光染料(如BODIPY, 尼羅紅)對(duì)藻種進(jìn)行高通量篩選, 是獲得高油脂含量優(yōu)良能源微藻藻株的有力工具[19—21]。與尼羅紅相比, BODIPY505/515在抗光漂白、熒光維持時(shí)間及適用范圍上更有優(yōu)勢(shì)[22], 因此在富油微藻篩選中被廣泛應(yīng)用。由于不同種類的微藻細(xì)胞壁厚度存在差異, BODIPY505/515的使用條件(包括染料的濃度, 染色時(shí)間等)也有很大差別[20,23,24], 需要在實(shí)踐中進(jìn)行一定的探索。本實(shí)驗(yàn)通過設(shè)定不同的染色條件, 最終確定了海洋微擬球藻富油藻株的最佳篩選條件, BODIPY505/515的濃度為0.87 μg/mL, 染色時(shí)間10min,并通過流式細(xì)胞儀篩選獲得了4株產(chǎn)油性能顯著提升的優(yōu)良藻株, 本文提供的方法可為其他富油微藻藻株的篩選提供一定參考。

圖 3 微擬球藻野生株及誘變?cè)逯晟L曲線Fig. 3 Growth curves of wild and mutated N. oceanica

表 1 微擬球藻的比生長率、總脂含量、生物量和油脂產(chǎn)率Tab. 1 The specific growth rate, total lipid content, biomass and lipid productivity of N. oceanica

圖 4 葉綠素a含量變化Fig. 4 Change of Chl a content during the culture time

圖 5 培養(yǎng)過程中Fv/Fm的變化

總脂含量是微藻作為產(chǎn)油藻株的重要參考指標(biāo), 通過誘變選育的方式有望得到產(chǎn)油能力較原始藻株更為出色的藻種。本實(shí)驗(yàn)篩選得到的4株誘變株的總脂含量均顯著高于野生型藻株(表 1), 且5株藻株的總脂含量均超過了干重的60%, 極具應(yīng)用潛力。另外, 此結(jié)果與在錐形瓶中培養(yǎng)(總脂含量18%—25%)和報(bào)道[15]的吊袋光生物反應(yīng)器培養(yǎng)時(shí)的總脂含量(22%—33%)有較大差異?？赡茉蛉缦? (1)培養(yǎng)條件的不同。培養(yǎng)條件對(duì)微藻油脂的積累有很大影響, 如: 溫度[25]、光照[26,27]等。且本實(shí)驗(yàn)在柱狀反應(yīng)器培養(yǎng)時(shí), 向其中通入了CO2, 為藻細(xì)胞的生長提供了充足的碳源, 而錐形瓶中培養(yǎng)時(shí)并沒有CO2的通入; (2)朱葆華等[15]采用的是連續(xù)式的培養(yǎng)模式, 藻細(xì)胞始終穩(wěn)定在指數(shù)生長期, 而本實(shí)驗(yàn)采用的是批次培養(yǎng), 藻細(xì)胞能在較短時(shí)間內(nèi)生長至平臺(tái)期; 藻細(xì)胞胞內(nèi)油脂主要在平臺(tái)期進(jìn)行積累, 因而本實(shí)驗(yàn)中油脂積累豐富。

圖 6 微擬球藻野生株及4株誘變?cè)逯甑谋訉游鰣D譜

表 2 微擬球藻野生株及4株誘變?cè)逯甑闹舅峤M成(占總脂肪酸的百分比)Tab. 2 Fatty acid composition of wild strain and four mutant strains of N. oceanica (% of total fatty acids)

4株微擬球藻誘變株在生長速率及生物量方面與野生型藻株相較呈顯著提高, 進(jìn)而油脂產(chǎn)率也顯著高于野生型藻株(表 1)。對(duì)于生產(chǎn)生物柴油而言,僅油脂產(chǎn)率高是不夠的, 還要有較高的中性脂含量(主要為TAG)及合適的脂肪酸組成。因?yàn)門AG是生產(chǎn)生物柴油的主要原料, 而微藻的脂肪酸組成是決定生物柴油冷凝點(diǎn)、氧化穩(wěn)定性、黏度、潤滑度、點(diǎn)火溫度等的重要因素[28]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示, 4株誘變?cè)逯甑腡AG含量相比于野生型藻株更具優(yōu)勢(shì)(圖 6)。對(duì)于脂肪酸組成而言, 一般認(rèn)為由C16和C18組成的SFA及MUFA是最適合用來生產(chǎn)生物柴油的脂肪酸, 在本研究中, 5株海洋微擬球藻的SFA和MUFA之和占到了總脂肪酸含量的83%以上, 且主要以C16和C18為主, 而PUFA的含量只有6%—8%, 該脂肪酸組成能使生物柴油具有較高的十六烷值及較強(qiáng)的抗氧化性, 因此非常適合用來生產(chǎn)生物柴油。

綜上所述, 結(jié)合油脂產(chǎn)率、中性脂含量和脂肪酸組成的分析, 4株誘變株經(jīng)柱狀光生物反應(yīng)器評(píng)價(jià)后表現(xiàn)出優(yōu)良的產(chǎn)油性狀, 證實(shí)了本實(shí)驗(yàn)篩選方法的有效性。藻株MT-1、MT-2、MT-3、MT-4產(chǎn)油潛力良好, 有望用于規(guī)模化生產(chǎn)。

致謝：

感謝寧波大學(xué)海洋學(xué)院張琳在微擬球藻富油藻株篩選工作中的貢獻(xiàn)。

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SCREENING OF LIPID-RICH NANNOCHLOROPSIS OCEANICA MUTANTS AND EVALUATION USING A BUBBLE COLUMN PHOTOBIOREACTOR

HE Wen-Dong1, ZHU Bao-Hua1, FENG Lei-Li1, CHANG Ya-Qing1, YANG Guan-Pin2and PAN Ke-Hou1,3
(1. Key Laboratory of Mariculture (Ocean University of China), Ministry of Education, Qingdao 266003, China; 2. College of Marine Life Science, Ocean University of China, Qingdao 266003, China; 3. Laboratory for Marine Fisheries and Aquaculture, Qingdao National Laboratory for Marine Science and Technology, Qingdao 266003, China)

After industrialization occurred, fossil fuel reserves decreased drastically, and environmental pollution caused by fossil fuel consumption became more serious. Thus, clean and renewable energy alternatives have recently attracted increasing amounts of attention. Microalgae have many advantages, such as a high growth rate, suitable fatty acid profiles and high lipid content, which makes them one of the most promising sources for renewable energy production. However, making a profit from biodiesel production based on microalgae is difficult because of the high cost. There are various strategies to reduce the cost of biodiesel production, such as breeding the best microalgae strains through chemical mutagenesis, which is one of the most important methods. Although this method is effective, extraordinarily heavy follow-up work impedes its promotion and application. Fortunately, flow cytometry and lipophilic fluorescent dyes (BODIPY505/515) provide the opportunity to screen for the best mutants using high throughput.

In this study, multiple mutants of Nannochloropsis oceanica were obtained by using chemical mutation (nitrosoguanidine, NTG). We developed a method based on flow cytometry and BODIPY505/515, which can screen microalgal candidates using high throughput. Our results showed that the optimal concentration and staining time for BODIPY505/515were 0.87 μg/mL and 10min, respectively. Based on this method, four outstanding microalgal strains were obtained. To verify the reliability of the screening method, we further investigated the performance of these four strains cultivated in a column photobioreactor. The results showed that lipid productivity of the four mutants was remarkably higher than that of the wild type, and the highest value was 27.32 mg/(L·d), demonstrating that this method is effective and feasible. To further evaluate the potential of candidates for biodiesel production, we investigated factors such as the fatty acid profiles, chlorophyll a, and PSII quantum efficiency. The results indicated that all of these four mutants possessed great potential for biodiesel production.

Biodiesel; Nannochloropsis oceanica; BODIPY505/515; Mutants screening; Photobioreactor

10.7541/2017.139

2016-11-01;

2017-02-16

國家重點(diǎn)基礎(chǔ)研究發(fā)展計(jì)劃項(xiàng)目(2011CB200901和2011CB200904); 國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(31372518); 寧波大學(xué)“水產(chǎn)”浙江省重中之重學(xué)科開放基金(xkzsc1517)資助 [Supported by Major State Basic Research Development Program of China (2011CB200901, 2011CB200904); National Natural Science Foundation of China (31372518); Ningbo University “Fisheries”Priority Subject Open Fund of Zhejiang Province]

何文棟(1993—), 男, 河南南陽人; 碩士研究生; 主要從事微藻誘變育種研究。E-mail: wd_he2010@163.com

潘克厚, 博士; 主要從事海洋生態(tài)學(xué)研究。E-mail: qdkhpan@126.com

S968.4

A

1000-3207(2017)05-1112-06