黃春秀 徐國(guó)雙 李 揚(yáng)

(華南師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院, 廣州市亞熱帶生物多樣性與環(huán)境生物監(jiān)測(cè)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 廣州 510631)

大亞灣水域并基擬菱形藻的種類鑒定和產(chǎn)毒特征分析

黃春秀 徐國(guó)雙 李 揚(yáng)

(華南師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院, 廣州市亞熱帶生物多樣性與環(huán)境生物監(jiān)測(cè)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 廣州 510631)

為了豐富我國(guó)海域擬菱形藻(Pseudo-nitzschia Peragallo)的物種多樣性, 并澄清其產(chǎn)毒特征, 研究從廣東大亞灣海域分離并建立了一株擬菱形藻的單克隆培養(yǎng)株系MC298, 通過(guò)光學(xué)顯微鏡下的群體特征和透射電鏡下的超微形態(tài)特征觀察, 結(jié)合基于核糖體轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)(Internal Transcribed Spacer, ITS)的分子系統(tǒng)學(xué)數(shù)據(jù), 以及基于ITS2轉(zhuǎn)錄RNA的二級(jí)結(jié)構(gòu)分析, 鑒定到我國(guó)擬菱形藻屬的1個(gè)新記錄種: 并基擬菱形藻P. decipiens Lundholm & Moestrup。研究對(duì)其形態(tài)學(xué)特征進(jìn)行了較為詳細(xì)地描述, 并與相似種進(jìn)行了比較, 還對(duì)其ITS2-RNA的特有標(biāo)志結(jié)構(gòu)進(jìn)行了闡述。同時(shí), 利用高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法(Liquid chromatography tandem mass spectrometry, LC-MS/MS)對(duì)該藻株的產(chǎn)毒特征進(jìn)行了檢測(cè), 結(jié)果未檢測(cè)到DA的存在。研究不僅豐富了我國(guó)擬菱形藻屬的物種多樣性, 也可為擬菱形藻的產(chǎn)毒特征研究提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

并基擬菱形藻; 分類學(xué); 形態(tài); 核糖體轉(zhuǎn)錄間隔區(qū); ITS2-RNA二級(jí)結(jié)構(gòu); 多莫酸

擬菱形藻(Pseudo nitzschia Peragallo)是一類常見的海洋浮游硅藻, 廣泛分布于全球近岸水體[1,2]。人們對(duì)于擬菱形藻的高度關(guān)注始于1987年的一次中毒事件。當(dāng)年11月, 在加拿大愛德華王子島發(fā)生了一起由于食用紫貽貝(Mutilus edulis Linnaeus)而引起的中毒事件, 造成100多人中毒, 其中3人死亡[3]。后經(jīng)充分研究, 確認(rèn)引發(fā)中毒的物質(zhì)是多莫酸(Domoic acid, DA), 而產(chǎn)生DA的肇事生物是一種擬菱形藻: 多列擬菱形藻P. multiseries (Hasle) Hasle。此后, 能夠產(chǎn)生DA的擬菱形藻種類又陸續(xù)在歐洲、大洋洲被報(bào)道[1,2], 人們開始意識(shí)到硅藻種類也可以產(chǎn)生毒素, 擬菱形藻也由此受到人們的廣泛關(guān)注,并成為研究熱點(diǎn)[4—9]。

隨著研究的深入, 以及物種多樣性的快速增加,擬菱形藻種類的準(zhǔn)確鑒定越來(lái)越困難, 對(duì)鑒定技術(shù)和人員素養(yǎng)均提出了較高的要求。不同種類之間的形態(tài)學(xué)差異非常細(xì)微, 需要應(yīng)用透射電鏡進(jìn)行觀察, 但是以超微形態(tài)學(xué)特征對(duì)擬菱形藻進(jìn)行鑒定仍存在著許多困難和爭(zhēng)議[10]。近十幾年來(lái), 分子標(biāo)記技術(shù)在擬菱形藻屬的分類學(xué)中得到廣泛應(yīng)用, 并取得了顯著成果, 證實(shí)了該屬中隱形種(Cryptic species)和擬隱形種(Pseudo cryptic species)的普遍存在[4,11,12], 這也極大增加了擬菱形藻種類鑒定的難度。目前已有多種分子標(biāo)記應(yīng)用于擬菱形藻屬的分類學(xué)研究中, 其中轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)序列(Internal Transcribed Spacer, ITS)被認(rèn)為是針對(duì)擬菱形藻屬的最適標(biāo)記[4,11]。另外, 近年來(lái)依據(jù)ITS2轉(zhuǎn)錄RNA二級(jí)結(jié)構(gòu)的分析工作, 也對(duì)擬菱形藻的分類學(xué)研究起到了促進(jìn)作用[6—8,13]。截止目前, 國(guó)際上報(bào)道的擬菱形藻種類已有48個(gè)[6—8,13], 而我國(guó)的相關(guān)研究還相對(duì)滯后, 只報(bào)道了17種[9,10,14,15], 而且多數(shù)工作都是僅基于透射電鏡下的形態(tài)特征進(jìn)行物種鑒定。相對(duì)于我國(guó)綿長(zhǎng)的海岸線和遼闊水域而言, 目前報(bào)道的擬菱形藻物種多樣性明顯偏低, 或許還有未被認(rèn)知的種類存在。

另一方面, 全球記錄的48種擬菱形藻中, 有24種可產(chǎn)生DA的報(bào)道[1,2,8], 其中有些種類在我國(guó)也有分布[9,10,14,15], 但截至目前, 我國(guó)尚未有擬菱形藻產(chǎn)生DA的直接報(bào)道。在以往的研究中, 我國(guó)學(xué)者曾嘗試檢測(cè)中國(guó)海域擬菱形藻株系的DA毒素,均未檢測(cè)到DA的存在[9,14]。然而近年來(lái), 我國(guó)一些海產(chǎn)品中已有DA檢出的報(bào)道[16—18], 證實(shí)了DA在我國(guó)沿海的分布, 但其真正的生物來(lái)源尚不明確, 這也影響到了DA中毒事件的預(yù)警預(yù)報(bào)。

基于上述原因, 本文嘗試建立中國(guó)的擬菱形藻單克隆培養(yǎng)株系, 結(jié)合形態(tài)學(xué)和分子分類學(xué)技術(shù),開展物種多樣性的工作。本文報(bào)道了我國(guó)的1個(gè)新記錄種: 并基擬菱形藻P. decipiens Lundholm & Moestrup。同時(shí)利用高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法(LC-MS/MS)開展DA的檢測(cè)工作。以期能夠豐富我國(guó)擬菱形藻屬的物種多樣性, 并為其毒理研究提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 單克隆藻株的建立

利用浮游植物網(wǎng)(孔徑10 μm)進(jìn)行水平拖網(wǎng), 以采集活體浮游植物樣品, 并盡快帶回實(shí)驗(yàn)室。利用毛細(xì)管法在倒置顯微鏡下挑取目標(biāo)藻細(xì)胞, 轉(zhuǎn)移至盛有f/2培養(yǎng)液的載玻片上, 經(jīng)過(guò)多洗水洗和轉(zhuǎn)移,以確保目標(biāo)藻的純化, 然后再轉(zhuǎn)移至滴有f/2培養(yǎng)液的96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中[9], 放置在室溫20℃、光周期12h:12h的條件下培養(yǎng)。待其存活并繁殖達(dá)到約100個(gè)藻細(xì)胞之后, 轉(zhuǎn)移到盛有f/2培養(yǎng)液的100 mL錐形瓶中擴(kuò)大培養(yǎng), 以MC (Marine collection)序列進(jìn)行編號(hào), 本文從廣東大亞灣海域分離并建立了一株并基擬菱形藻MC298。

1.2 形態(tài)學(xué)觀察

光鏡觀察: 取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的藻液0.1 mL,滴在0.1 mL浮游植物計(jì)數(shù)框中, 加上蓋玻片后在Olympus BX53光學(xué)顯微鏡下進(jìn)行微分干涉(Differential interference contract, DIC)觀察, 并利用Olympus DP27數(shù)碼相機(jī)拍照。

透射電鏡觀察: 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的藻液10 mL, 靜置沉淀濃縮至2—5 mL, 加入等量濃硫酸(＞95%)以去除有機(jī)質(zhì), 然后用蒸餾水多次水洗至中性[9]。用微量進(jìn)樣器吸取5—10 μL酸化后的水樣, 滴加在噴鍍碳膜的銅網(wǎng)上, 自然晾干后, 即可在JEM-1010 TEM下觀察和拍照。

1.3 分子系統(tǒng)學(xué)分析

用0.22 μm醋酸纖維濾膜過(guò)濾對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期藻液10 mL, 收集濾膜上的藻細(xì)胞, 進(jìn)行總DNA的提取[19]。利用引物1380F和ITS4進(jìn)行核糖體轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)(ITS)的擴(kuò)增和測(cè)序[19]。從NCBI下載擬菱形藻屬各個(gè)種類的ITS序列, 使用BioEdit軟件進(jìn)行序列的比對(duì)和矩陣[5], 基于MrModeltest 2.3計(jì)算的最適模型[19], 然后分別用RAxML-HPC2[20]和MrBayes 3.2[21]構(gòu)建最大似然樹(Maximum likelihood, ML)和貝葉斯推理樹(Bayesian inference, BI)。其中ML分析的自檢值(Bootstrap test)設(shè)定為1000。

1.4 ITS2二級(jí)結(jié)構(gòu)的預(yù)測(cè)及CBCs分析

從GenBank下載P. sabit的ITSrDNA序列, 參考序列標(biāo)注, 將其ITS2片段截下。使用Mfold[13]在線預(yù)測(cè)P. sabit ITS2的二級(jí)結(jié)構(gòu), 所得二級(jí)結(jié)構(gòu)含4個(gè)環(huán)和一個(gè)擬菱形藻屬環(huán)。以P. sabit二級(jí)結(jié)構(gòu)同源模板, 使用ITS2 Database[13]在線預(yù)測(cè)目標(biāo)藻株的RNA二級(jí)結(jié)構(gòu)。使用VARNA[13]觀察并下載二級(jí)結(jié)構(gòu)。同時(shí)使用4SALE v.1.7[8]軟件中自帶的補(bǔ)償堿基變化(CBCs)Table觀察CBC情況, 分析生殖隔離情況。

1.5 LC-MS/MS法檢測(cè)藻毒素

取處于生長(zhǎng)穩(wěn)定期中后期的藻液5 mL, 經(jīng)0.22 μm醋酸纖維濾膜過(guò)濾, 收集濾液于離心管中, 用于分析胞外DA量; 另外用5 mL滅菌海水將濾膜上的藻細(xì)胞重懸, 轉(zhuǎn)移到另一個(gè)離心管中。將藻液用超聲波破碎儀冰浴破碎3—5min, 經(jīng)0.22 μm濾膜過(guò)濾,濾液于–20℃下保存?zhèn)溆没蛑苯舆M(jìn)樣分析。

采用Prominence UFLC超快速液相色譜(Shimadzu公司)和5500 QTRAP四極桿-線性離子阱復(fù)合質(zhì)譜檢測(cè)系統(tǒng)(SCIEX公司)對(duì)預(yù)處理的樣品進(jìn)行DA檢測(cè), 參見Wu等[22]方法進(jìn)行分析。DA標(biāo)準(zhǔn)品購(gòu)自德國(guó)Sigma公司。

2 結(jié)果

2.1 擬菱形藻的分類學(xué)研究

基于形態(tài)學(xué)和分子系統(tǒng)學(xué)的數(shù)據(jù), 以及ITS2-RNA二級(jí)結(jié)構(gòu)的分析結(jié)論, 本文鑒定到我國(guó)擬菱形藻屬的一個(gè)新記錄種: 并基擬菱形藻P. decipiens。

形態(tài)學(xué)描述 并基擬菱形藻 Pseudo nitzschia decipiens Lundholm & Moestrup(圖 1A—G)

細(xì)胞具有兩個(gè)黃褐色的色素體, 對(duì)稱分布在中節(jié)兩側(cè), 可單個(gè)細(xì)胞生活, 也可形成2—4個(gè)細(xì)胞的鏈狀群體(圖 1A), 重疊部為殼面全長(zhǎng)的1/5—1/6。細(xì)胞殼面縱軸呈現(xiàn)披針形(圖 1B), 殼端鈍圓(圖1C), 兩殼端形狀相似。殼面長(zhǎng)45—47 μm, 寬1.4—1.6 μm。管殼縫強(qiáng)烈偏心(圖 1D, E)。有中央較大船骨點(diǎn)(圖 1E)。肋突分布在殼緣, 排列不規(guī)則(圖 1D), 密度為20—27個(gè)/10 μm。點(diǎn)條紋由兩排孔紋組成, 密度為46—50條/10 μm?？准y為不規(guī)則的六邊形, 密度1 μm內(nèi)9—13個(gè)。觀察到3條環(huán)帶(圖1F), 殼環(huán)帶寬2個(gè)孔紋, 高2—3個(gè)孔紋, 點(diǎn)條紋密度50—53個(gè)/10 μm, 孔紋內(nèi)部由六角形的篩孔構(gòu)成(圖 1G); 第二條環(huán)帶一側(cè)有孔紋, 另一側(cè)為無(wú)紋區(qū);第三條環(huán)帶未見孔紋。

圖 1 并基擬菱形藻

本研究建立了1個(gè)培養(yǎng)株系MC298, 主要形態(tài)學(xué)特征與以往報(bào)道基本相符。

毒性: 本種尚未有產(chǎn)生多莫酸的報(bào)道[4], 本文亦未檢測(cè)到。

生態(tài): 海水浮游生活。

分布: 標(biāo)本采自大亞灣海域(4月)。本種曾報(bào)道于黑海、加那利群島、墨西哥灣、意大利第勒尼安海[4, 23]。

基于ITS序列分析的分子系統(tǒng)學(xué)分析 利用RAxML對(duì)ITS1-5.8S-ITS2序列的733個(gè)堿基進(jìn)行了比對(duì)分析, 建立了分子系統(tǒng)樹(圖 2)。MC298與已報(bào)道的三株并基擬菱形藻聚在同一個(gè)分支上, 且具有較高的置信值(BPP＞95, ML＞90), 這表明分子分類的結(jié)果也支持形態(tài)鑒定的結(jié)論。同時(shí), MC298與其他海域的并基擬菱形藻也存在少許遺傳差異, 與墨西哥圖斯潘海域株系(Mex13)具有完全相同的ITS序列, 與馬來(lái)西亞株系(PnKk38)有3個(gè)堿基的差異, 與西班牙加那利群島株系(GranCan4-1)的遺傳差異最大, 有9個(gè)堿基的差異。

圖 2 基于核糖體轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)ITS1-5.8S-ITS2的分子系統(tǒng)樹(以N. bizertensis為外類群)Fig. 2 The phylogenetic tree based on ITS1-5.8S-ITS2 rDNA with N. bizertensis as outgroup

ITS2二級(jí)結(jié)構(gòu)分析 并基擬菱形藻ITS2二級(jí)結(jié)構(gòu)模型顯示了ITS2結(jié)構(gòu)的普遍特征, 有4個(gè)單環(huán)和1個(gè)擬環(huán)IIa(圖 3), 與其他擬菱形藻種類的ITS2二級(jí)結(jié)構(gòu)基本一致[6,23]。MC298與以往報(bào)道的并基擬菱形藻株系(Mex13、PnKk38)具有完全一致的ITS2二級(jí)結(jié)構(gòu), 但GranCan4-1在helixⅢ有兩個(gè)HCBCs (半補(bǔ)償性堿基變化)(G:U ? G:C; C:G ?U:G; 1 SNP)的差異, 而且分子系統(tǒng)樹上GranCan4-1與其他兩個(gè)株系處在不同的分支上(圖 2), 基于P. mannii和P. calliantha只有一個(gè)HCBCs的差異[23], 因此GranCan4-1是否為并基擬菱形藻有待后續(xù)的研究。將MC298與系統(tǒng)發(fā)育樹上親緣關(guān)系最近的P. sabit相比較, 發(fā)現(xiàn)有2—3個(gè)HCBCs的差異, 還有3—4 SNPs(單核苷酸多態(tài)性)差異。并基擬菱形藻ITS2-RNA的特有分子特征主要在helix III, 31 bp信號(hào)區(qū)域: 5′-UUGUUACUAGCUGUUUGAACGA CUACUAAAA-3′?；贛C298具有與以往報(bào)道的其它并基擬菱形藻株系(Mex13和PnKk38)的完全一致的ITS2二級(jí)結(jié)構(gòu), 亦支持了形態(tài)學(xué)與ITS分子鑒定的結(jié)果。

圖 3 并基擬菱形藻ITS2二級(jí)結(jié)構(gòu)圖Fig. 3 The secondary structure of ITS2-RNA in Pseudo-nitzschia decipiens strain MC298

2.2 多莫酸產(chǎn)毒特征的LC-MS檢測(cè)

以DA標(biāo)準(zhǔn)品濃度(μg/mL)為橫坐標(biāo), 峰面積為縱坐標(biāo), 建立多莫酸LC-MS檢測(cè)的標(biāo)準(zhǔn)曲線, 多莫酸濃度為0.1—16 μg/mL時(shí), 其峰面積與質(zhì)量濃度有良好的線性關(guān)系(R2=0.9999), 回歸方程為: y= 87.1875x。本方法的檢測(cè)下限為10 ng/mL。多莫酸的出峰保留時(shí)間為13.613min。對(duì)常規(guī)培養(yǎng)的并基擬菱形藻進(jìn)行LC-MS檢測(cè), 結(jié)果在預(yù)定的保留時(shí)間內(nèi)都未出現(xiàn)樣品峰。表明本藻株未檢出DA。

3 討論

3.1 并基擬菱形藻與相似種的比較

2006年Lundholm等[4]對(duì)分離自不同海域的多個(gè)“柔弱擬菱形藻P. delicatissima Cleve”株系進(jìn)行了形態(tài)學(xué)和分子數(shù)據(jù)的研究, 發(fā)現(xiàn)它們?cè)谛螒B(tài)學(xué)特征上相似, 但在ITS序列構(gòu)建的系統(tǒng)樹中存在較大遺傳學(xué)差異, 推測(cè)柔弱擬菱形藻中存在(擬)隱形種,并根據(jù)形態(tài)學(xué)、ITS系統(tǒng)發(fā)育的數(shù)據(jù), 報(bào)道了2個(gè)新種: 并基擬菱形藻和疑難擬菱形藻P. dolorosa Lundholm & Moestrup, 繼而提出了柔弱擬菱形藻復(fù)合群P. delicatissima complex的概念, 并基擬菱形藻正是該復(fù)合群的種類之一。2009年Quijano-Scheggia等[24]利用形態(tài)學(xué)與ITS系統(tǒng)發(fā)育分析, 研究了地中海西北部的柔弱擬菱形藻株系, 并測(cè)試了一些株系的有性繁殖和生殖隔離, 發(fā)現(xiàn)這些株系呈現(xiàn)兩個(gè)截然不同的遺傳分支, 而且出現(xiàn)了生殖隔離, 以此為依據(jù)報(bào)道了1個(gè)新種: 阿雷擬菱形藻P. arenysensis Quijiao-Scheggia, Garcés & Lundholm。該研究也認(rèn)為以往報(bào)道的柔弱擬菱形藻應(yīng)該是一個(gè)復(fù)合群, 包含有多個(gè)(擬)隱形種, 這也驗(yàn)證了Lundholm等[7]的觀點(diǎn)。截止目前, 柔弱擬菱形藻復(fù)合群包含有6個(gè)種: 柔弱擬菱形藻、并基擬菱形藻、疑難擬菱形藻、亞太平洋擬菱形藻P. subpacifia (Hasle) Hasle、腫脹擬菱形藻P. turgidula (Hustedt) Hasle和阿雷擬菱形藻。

柔弱擬菱形藻復(fù)合群的種類具有較為相似的形態(tài)學(xué)特征: (1)殼面披針形; (2)點(diǎn)條紋由兩排孔紋組成; (3)具有中央較大船骨點(diǎn)。同時(shí), 它們之間也存在細(xì)微的區(qū)別, 主要體現(xiàn)在肋突、點(diǎn)條紋和孔紋的密度上。并基擬菱形藻的肋突密度(20—26 μm)、點(diǎn)條紋密度(41—46 μm)、孔紋密度(9—13 μm)明顯高于疑難擬菱形藻(18—22 μm, 30—36 μm, 5—8 μm)[4]和腫脹擬菱形藻(13—18 μm, 23—28 μm, 7—9 μm)[25], 而且環(huán)帶上的孔紋密度(48—55 μm)也明顯高于疑難擬菱形藻(40—44 μm)[4]。腫脹擬菱形藻和亞太平洋擬菱形藻的殼面橫軸明顯較寬(1.4—2.4 vs. 2.5—3.5 μm; 1.4—2.4 vs. 3—5 μm)[4,25]。并基擬菱形藻與柔弱擬菱形藻的區(qū)別在于, 前者點(diǎn)條紋密度(41—46 μm)、孔紋密度(9—13 μm)和環(huán)帶上孔紋密度(48—55 μm)都略高于后者(35—40 μm, 8—12 /μm, 43—48 μm)[4]。并基擬菱形藻與阿雷擬菱形藻最為相似, 只在點(diǎn)條紋密度(41—46 vs. 34—43 μm)和環(huán)帶上孔紋密度(48—55 vs. 40—50 μm)較高于后者[4,24]。

分子系統(tǒng)學(xué)的研究已經(jīng)證實(shí), 擬菱形藻屬內(nèi)的多個(gè)復(fù)合群, 如柔弱擬菱形藻復(fù)合群、偽柔弱擬菱形藻復(fù)合群等, 都是基于相似形態(tài)學(xué)特征而建立的種類集群, 并不能反映各個(gè)種類之間的系統(tǒng)學(xué)關(guān)系[4,7,8,24]。在分子系統(tǒng)樹中, 柔弱擬菱形藻復(fù)合群的各個(gè)種類分別位于不同的分支上, 只有疑難擬菱形藻與并基擬菱形藻的親緣關(guān)系比較接近(圖 2)。并基擬菱形藻的遺傳相似種類主要有3個(gè): 鐮刀擬菱形藻P. sabit Teng, Lim, Lim & Leaw、銀河擬菱形藻P. galaxiae Lundholm & Moestrup和疑難擬菱形藻。除了疑難擬菱形藻之外, 并基擬菱形藻與其他遺傳相似種在形態(tài)學(xué)上都有明顯區(qū)別。并基擬菱形藻與鐮刀擬菱形藻的親緣關(guān)系最為接近, 但兩者形態(tài)上存在明顯差異, 最大的區(qū)別在于后者的殼面呈獨(dú)特的鐮刀狀[7]。并基擬菱形藻與銀河擬菱形藻在形態(tài)學(xué)上最明顯的區(qū)別是: 前者的點(diǎn)條紋由明顯的兩排孔紋構(gòu)成, 而后者點(diǎn)條紋中未見明顯的孔紋[4]。并基擬菱形藻與疑難擬菱形藻的形態(tài)學(xué)特征較為相似, 除了前面已經(jīng)比較過(guò)的肋突、點(diǎn)條紋、孔紋密度區(qū)別之外, 后者殼面點(diǎn)條紋會(huì)出現(xiàn)單排孔紋的情況, 而前者則未見單排孔紋[7]。

在以往關(guān)于擬菱形藻的分類學(xué)或生態(tài)學(xué)研究中, 柔弱擬菱形藻是我國(guó)沿海的常見種類, 在多個(gè)海域均有報(bào)道[26—28]。但是基于最新的國(guó)際研究動(dòng)態(tài), 并基擬菱形藻與柔弱擬菱形藻具有極為相似的形態(tài)特征, 單純依據(jù)形態(tài)特征的觀察, 缺少分子數(shù)據(jù)支持, 難以進(jìn)行準(zhǔn)確的物種鑒定。因此, 在我國(guó)海域廣泛分布的, 究竟是柔弱擬菱形藻, 還是并基擬菱形藻, 亦或是其他相似種類, 還需后續(xù)研究加以澄清。

3.2 擬菱形藻屬DA產(chǎn)毒特征分析

并基擬菱形藻首先報(bào)道于墨西哥灣[4], 之后在意大利第勒尼安海也有記錄[23], 均未檢測(cè)到多莫酸的存在。本研究從中國(guó)海域分離并建立了并基擬菱形藻的室內(nèi)培養(yǎng)株系, 利用LC-MS技術(shù)檢測(cè)DA,結(jié)果也沒有檢測(cè)到DA的存在。

截至目前, 全球已報(bào)道能夠產(chǎn)生DA的擬菱形藻種類達(dá)到24種[1,8], 其中7種在我國(guó)也有分布[9]。但是我國(guó)并未有擬菱形藻產(chǎn)毒的直接報(bào)道。擬菱形藻的產(chǎn)毒是一個(gè)復(fù)雜的生理學(xué)現(xiàn)象, 有著地域、環(huán)境和種源的差異。如采自馬來(lái)西亞波德申(Port Dickson)的5株柯氏擬菱形藻P. kodamae Teng, Lim, Leaw & Lim可產(chǎn)生DA, 但采自東馬來(lái)西亞美里(Miri coast)海岸的3株柯氏擬菱形藻卻沒有檢測(cè)到DA[8]。同樣的情況也出現(xiàn)在尖刺擬菱形藻P. pungens Hasle、多紋擬菱形藻P. multistriata Takano等[9]種類。隨著研究的深入, 發(fā)現(xiàn)擬菱形藻不同株系間產(chǎn)毒性能存在很大的差異, 這可能與不同地理環(huán)境有關(guān), 如物理因素, 生物因素及營(yíng)養(yǎng)參數(shù)[1]。

另一方面, 除了擬菱形藻以外, 咖啡雙眉藻(Amphora coffaeiformis)可產(chǎn)生低濃度的DA[29]。近年來(lái)有報(bào)道稱在越南蝦池內(nèi)采集到一種底棲菱形藻(Nitzschia navis-varingica)可產(chǎn)生大量的DA[30]。隨后日本、泰國(guó)、越南和菲律賓等地都有發(fā)現(xiàn)產(chǎn)生DA的Nitzschia navis-varingica[31,32]。2014年Smida等[33]在突尼斯分離出的Nitzschia bizertensis也檢測(cè)到低濃度的DA。上述研究表明DA的生物來(lái)源應(yīng)該是多樣性的。

雖然中國(guó)沿海至今未有擬菱形藻產(chǎn)生DA的直接報(bào)道, 但是水產(chǎn)品中已有DA的檢出報(bào)道。陳西平等[34]在采自我國(guó)渤海等海域部分海產(chǎn)品中檢測(cè)出DA, 檢出率為50%, 其中象牙蚌、珍珠貝等含量最高, 為8.14 μg/g。李大志等[35]在采自大連海域黑石礁的扇貝中也檢測(cè)到DA。宋俐俐等[16]在浙江沿海的水產(chǎn)品中檢測(cè)到DA。吉薇等[17]在湛江、北海等地多種貝類中均檢測(cè)出DA, 其中, 鈍齒短漿蟹和扇貝的含量最高, 可達(dá)18.2 μg/g。王恒[18]在舟山海域出產(chǎn)的貝類中也檢測(cè)到DA的存在, 檢出率大于64%。那么存在于這些貝類中的DA從何而來(lái)?來(lái)自于擬菱形藻, 還是有其他生物來(lái)源?因此, 對(duì)中國(guó)沿海DA來(lái)源的排查應(yīng)該引起重視, 除了加大對(duì)中國(guó)沿海擬菱形藻的產(chǎn)毒檢測(cè)力度之外, 還需關(guān)注其他已報(bào)道的產(chǎn)毒硅藻種類。

[1]Lelong A, Hégaret H, Soudant P, et al. Pseudo-nitzschia (Bacillariophyceae) species, domoic acid and amnesic shellfish poisoning: revisiting previous paradigms [J]. Phycologia, 2012, 51(2): 168—216

[2]Trainer V L, Bates S S, Lundholm N, et al. Pseudo-nitzschia physiological ecology, phylogeny, toxicity, monitoring and impacts on ecosystem health [J]. Harmful Algae, 2012, 14(1): 271—300

[3]Bates S S, Bird C J, deFreitas A S W, et al. Pennate diatom Nitzschia pungens as the primary source of domoic acid, a toxin in shellfish from eastern Prince Edward Island, Canand [J]. Canadian Journal of Fisheries and Aquatic Sciences, 1989, 46(7): 1203—1215

[4]Lundholm N, Moestrup ?, Kotaki Y, et al. Inter- and intraspecific variation of the Pseudo-nitzschia delicatissima complex (Bacillariophyceae) illustrated by rRNA probes, morphological data and phylogenetic analyses [J]. Phycologia, 2006, 42(2): 464—481

[5]Lundholm N, Bates S S, Baugh K A, et al. Cryptic and pseudo-cryptic diversity in diatoms—with descriptions of Pseudo-nitzschia hasleana sp. nov. and P. fryxelliana sp. nov. 1 [J]. Journal of Phycology, 2012, 48(2): 436—454

[6]Teng S T, Lim H C, Lim P T, et al. Pseudo-nitzschiakodamae sp. nov. (Bacillariophyceae), a toxigenic species from the Strait of Malacca, Malaysia [J]. Harmful Algae, 2014, 34(1): 17—28

[7]Teng S T, Lim P T, Lim H C, et al. A non-toxigenic but morphologically distinct new species of Pseudo-nitzschia, P. sabit sp. nov. (Bacillariophyceae) [J]. Journal of Phycology, 2015, 51(4): 706—725

[8]Teng S T, Tan S N, Lim H C, et al. High diversity of Pseudo-nitzschia along the northern coast of Sarawak (Malaysian Borneo), with description of P. bipertita sp. nov. and P. limii sp. nov. (Bacillariophyceae) [J]. Journal of Phycology, 2016, doi: 10.1111/jpy.12448-15-095

[9]Xu G S, Li Y. Two new records of diatom genus Pseudonitzschia from Chinese waters and analysis of their domoic acid production [J]. Journal of Tropical and Subtropical Botany, 2015, 23(6): 614—624 [徐國(guó)雙, 李揚(yáng). 我國(guó)沿海擬菱形藻屬的2新記錄種及其產(chǎn)毒特征分析. 熱帶亞熱帶植物學(xué)報(bào), 2015, 23(6): 614—624]

[10]Li Y, He L N, Ma Y Y, et al. The study on morphological taxonomy of Pseudo-nitzschia pseudodelicatissima complex [J]. Acta Hydrobiologica Sinica, 2010, 34(2): 302—311 [李揚(yáng), 何利娜, 馬艷艷, 等. 偽柔弱擬菱形藻復(fù)合群的形態(tài)分類學(xué)研究. 水生生物學(xué)報(bào), 2010, 34(2): 302—311]

[11]Amato A, Kooistra W H C F, Levialdi G J H, et al. Reproductive isolation among sympatric cryptic species in marine diatoms [J]. Protist, 2007, 158(2): 193—207

[12]Lundholm N, Moestrup ?, Hasle G R, et al. A study of the Pseudo-nitzschia pseudodelicatissima/cuspidata complex (Bacillariophyceae): what is P. pseudodelicatissima [J]? Journal of Phycology, 2003, 39(4): 797—813

[13]Percopo I, Ruggiero M V, Balzano S, et al. Pseudo-nitzschia arctica sp. nov., a new cold-water cryptic Pseudonitzschia species within the P. pseudodelicatissima complex [J]. Journal of Phycology, 2016, 52(2): 184—199

[14]Xing X L, Yang J X, Kang Y Y, et al. Morphological study and toxic analysis for two Pseudo-nitzschia species isolated from Daya Bay [J]. Journal of Oceanography in Taiwan Strait, 2007, 26(4): 576—582 [邢小麗, 楊軍霞,康燕玉, 等. 大亞灣水域兩種擬菱形藻的形態(tài)學(xué)鑒定及毒素分析. 臺(tái)灣海峽, 2007, 26(4): 576—582]

[15]Lü S H, Li Y, Lundholm N, et al. Diversity, taxonomy and biogeographical distribution of the genus Pseudonitzschia (Bacillariophyceae) in Guangdong coastal waters, South China Sea [J]. Nova Hedwigia, 2012, 95(1-2): 123—152

[16]Song L L, Zhang H Q, Hou J D, et al. High-performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry for the determination of residue of domoic acid in shellfish [J]. Journal of Fisheries of China, 2008, 32(6): 950—956 [宋琍琍, 張海琪, 侯鏡德, 等. 液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定貝類毒素軟骨藻酸的殘留. 水產(chǎn)學(xué)報(bào), 2008, 32(6): 950—956]

[17]Ji W, Zheng J Y, Zeng X P, et al. HPLC analysis of domoic acid poisoning in South China Sea [J]. Modern Food Science and Technology, 2011, 27(1): 120—122 [吉薇, 鄭潔瑩, 曾雪萍, 等. 南海海域軟骨藻酸(DA)貝類毒素的HPLC方法檢測(cè). 現(xiàn)代食品科技, 2011, 27(1): 120—122]

[18]Wang H. An investigation of domoic acid content in shellfish in Zhoushan islands [J]. Chinese Journal of Health Laboratory Technology, 2011, 21(12): 2986—2988 [王恒. 舟山海域貝類海產(chǎn)品中軟骨藻酸含量調(diào)查. 中國(guó)衛(wèi)生檢驗(yàn)雜志, 2011, 21(12): 2986—2988]

[19]Lim H C, Teng S T, Leaw C P, et al. Three novel species in the Pseudo-nitzschia pseudodelicatissima complex: P. batesiana sp. nov., P. lundholmiae sp. nov., and P. fukuyoi sp. nov.(Bacillariophyceae) from the Strait of Malacca, Malaysia [J]. Journal of Phycology, 2013, 49(5): 902—916

[20]Miller M A, Pfeiffer W, Schwartz T. Creating the CIPRES Science Gateway for inference of large phylogenetic trees [C]. Gateway Computing Environments Workshop (GCE). IEEE, 2010, 1—8

[21]Ronquist F, Teslenko M, Mark P, et al. MrBayes 3.2: efficient Bayesian phylogenetic inference and model choice across a large model space [J]. Oxford Journals, 2012, 61(3): 539—542

[22]Wu H, Guo M, Tan Z, et al. Liquid chromatography quadrupole linear ion trap mass spectrometry for multiclass screening and identification of lipophilic marine biotoxins in bivalve mollusks [J]. Journal of Chromatography A, 2014, 1358: 172—180

[23]Amato A, Montresor M. Morphology, phylogeny, and sexual cycle of Pseudo-nitzschia mannii sp. nov. (Bacillariophyceae): a pseudo-cryptic species within the P. pseudodelicatissima complex [J]. Phycologia, 2008, 47(5): 487—497

[24]Quijano-Scheggia S I, Garcés E, Lundholm N, et al. Morphology, physiology, molecular phylogeny and sexual compatibility of the cryptic Pseudo-nitzschia delicatissima complex (Bacillariophyta), including the description of P. arenysensis sp. nov [J]. Phycologia, 2009, 48(6): 492—509

[25]Hasle G R. Nitzschia and Fragilariopsis species studied in the light and electron microscopes. II. The group Pseudo-nitzschia. Skrifter Utgitt av Det Norske Videnskaps-Akademi i Oslo I. Mat.-Naturv [J]. Klasse Ny serie, 1965, 18: 1—45

[26]Gao Y H, Yu Q B, Qi Y Z, et al. Speries composition and ecological distribution of planktnic diatoms in the Changjiang river estuary during spring [J]. Chinese Journal of Applied Ecology, 2003, 14(7): 1044—1048 [高亞輝, 虞秋波, 齊雨藻, 等. 長(zhǎng)江口附近海域春季浮游硅藻的種類組成和生態(tài)分布. 應(yīng)用生態(tài)學(xué)報(bào), 2003, 14(7): 1044—1048]

[27]Gao Y H, Xie W L, Li Y, et al. Pseudo-nitzschia: taxonomy and biogeographic distribution in the estuary of Changjiang River, China [C]. Witkowski A. Proceedings of 18th International Diatom Symposium. Bristol: Biopress Limited. 2006, 75—90

[28]Wang Y, Lin M, Lin G M, et al. Yearly changes of phytoplankton in the ecological monitoring zone of Daya Bay [J]. Marine Science, 2012, 36(4): 86—94 [王雨, 林茂, 林更銘, 等. 大亞灣生態(tài)監(jiān)控區(qū)的浮游植物年際變化. 海洋科學(xué), 2012, 36(4): 86—94]

[29]Shimizu Y, Gupta S, Masuda K, et al. Dinoflagellate and other microalgal toxins: chemistry and biochemistry [J]. Pure and Applied Chemistry, 1989, 61(3): 513—516

[30]Kotaki Y, Koike K, Yoshida M, et al. Domoic acid production in Nitzschia sp. (bacillariophyceae) isolated from a shrimp culture pond in do son, Vietnam [J]. Journal of Phycology, 2000, 36(6): 1057—1060

[31]Kotaki Y, Lundholm N, Katayama T, et al. ASP toxins of pennate diatoms and bacterial effects on the variation in toxin composition. In: ?. Moestrup (Eds.), Proceedings of the 12th International Conference on Harmful Algae. 2008, 300—302

[32]Romero M L J, Lirdwitayaprasit T, Kotaki Y, et al. Isolation of ASP toxin-producing Nitzschia from Thailand [J]. Marine Research Indonesia, 2008, 33(2): 225—228

[33]Smida D B, Lundholm N, Kooistra W H, et al. Morphology and molecular phylogeny of Nitzschia bizertensis sp. nov.-A new domoic acid-producer [J]. Harmful Algae, 2014, 32: 49—63

[34]Chen X P, Wang C B, Hu J M , et al. Determination of domoic acid in water and aquatic animals by high performance liquid chromatography [J]. Journal of Hygiene Research, 2001, 30(4): 247—248 [陳西平, 王成斌, 胡俊明, 等. HPLC方法檢測(cè)水及水生動(dòng)物中軟骨藻酸. 衛(wèi)生研究, 2001, 30(4): 247—248]

[35]Li D Z, Zhu W J, Song W B, et al. Capillary electrophoretic analysis of amnesic shellfish toxin-domoic acid [J]. Chinese Journal of Chromatography, 2002, 20(2): 125—128 [李大志, 祝文君, 宋文斌, 等. 記憶缺失性貝類毒素的主要成分-軟骨藻酸的毛細(xì)管電泳分析. 色譜, 2002, 20(2): 125—128]

THE IDENTIFICATION OF PSEUDO-NITZSCHIA DECIPIENS FROM DAYA BAY AND ANALYSIS OF ITS DOMOIC ACID PRODUCTION

HUANG Chun-Xiu, XU Guo-Shuang and LI Yang
(Guangzhou Key Laboratory of Subtropical Biodiversity and Biomonitoring, College of Life Science, South China Normal University, Guangzhou 510631, China)

The marine diatom genus Pseudo-nitzschia Peragallo, the main biological source of Amnesic Shellfish Poisoning (ASP) - domoic acid (DA), has attracted great attention worldwide, and has became the hotspot in the research field of phycology and environmental toxins. Lots of progress has been made in the past two decades with 48 newly described taxa and 24 species that can produce DA. In China, a total of 17 taxa has been reported without any detectable DA from Chinese Pseudo-nitzschia strains. To investigate the species diversity of Pseudo-nitzschia in Chinese coast and the ability of DA production for Chinese Pseudo-nitzschia, monoclonal strains were isolated and established from Daya Bay, the South China Sea. These strains were identified based on the morphological characteristics by light microscopy and transmission electron microscopy and molecular analysis using the internal transcribed spacer region of ribosomal rRNA encoding gene, and the secondary structure of ITS2 RNA transcripts. We reported one newly recorded species for China, P. decipiens Lundholm & Moestrup. Its morphology was described and compared with both morphology-similar and molecule-close taxa, and the unique molecular feature of the secondary structure of ITS2-RNA was analyzed. No detectable DA was observed from this species using a single liquid chromatography tandem mass spectrometry (LC-MS/MS) injection. This study enriches the diversity of the genus Pseudo-nitzschia in China, and may provide detail information for the further studies about DA production of Chinese Pseudo-nitzschia strains.

Pseudo-nitzschia decipiens; Taxonomy; Morphology; Internal transcribed spacer; ITS2-RNA secondary structure; Domoic acid

10.7541/2017.140

2016-08-05;

2016-11-20

國(guó)家自然科學(xué)基金(31570205, 31370235); 廣東省科技計(jì)劃項(xiàng)目(2015A030401084)資助 [Supported by the National Natural Science Foundation of China (31570205, 31370235); Science and Technology Program Guangdong Province (2015A030401084)]

黃春秀(1989—), 女, 廣東茂名人; 碩士研究生; 主要從事藻類學(xué)研究。E-mail: 3127166788@qq.com

李揚(yáng), E-mail: liyang@scnu.edu.cn

Q949.27

A

1000-3207(2017)05-1118-08