黃永梅楊曉紅蘭柳波詹靜婷羅 輝江黎明,

(1. 廣東醫(yī)科大學(xué)化學(xué)教研室, 湛江 524023; 2. 廣東醫(yī)科大學(xué)湛江市環(huán)北部灣海洋微生物研究開發(fā)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 湛江 524023; 3. 廣東醫(yī)科大學(xué)生物化學(xué)與分子生物學(xué)研究所, 湛江 524023)

湛江沿海海洋微藻及其多糖、脂類和蛋白藻株多樣性研究

黃永梅1,2楊曉紅1,2蘭柳波3詹靜婷1,2羅 輝1,2江黎明2,3

(1. 廣東醫(yī)科大學(xué)化學(xué)教研室, 湛江 524023; 2. 廣東醫(yī)科大學(xué)湛江市環(huán)北部灣海洋微生物研究開發(fā)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 湛江 524023; 3. 廣東醫(yī)科大學(xué)生物化學(xué)與分子生物學(xué)研究所, 湛江 524023)

從硇洲島和徐聞珊瑚礁自然保護(hù)區(qū)潮間帶采集的海水和沉積物樣品中分離培養(yǎng)海洋微藻, 篩選其中富含多糖、脂類或蛋白質(zhì)的藻株。采用形態(tài)學(xué)觀察、18S rDNA序列比較及其系統(tǒng)發(fā)育分析法, 對分離培養(yǎng)的海洋微藻及其富含多糖、脂類或蛋白質(zhì)的藻株進(jìn)行分類鑒定和生物多樣性分析。分離、培養(yǎng)、鑒定并儲藏了189株海洋微藻, 歸屬于65個(gè)種, 分布于硅藻門(Bacillariophyta)、綠藻門(Chlorophyta)、定鞭藻門(Haptophyta)和紅藻門(Rhodophyta)的9綱、25目、30個(gè)科、38個(gè)屬; 其中多糖含量較高的46株海洋微藻, 分布于25個(gè)種, 20個(gè)屬; 脂類含量較高的46株海洋微藻, 分布于32個(gè)種, 15個(gè)屬; 蛋白含量較高的46株海洋微藻, 分布于28個(gè)種, 18個(gè)屬。結(jié)果表明硇洲島和徐聞珊瑚礁自然保護(hù)區(qū)潮間帶可培養(yǎng)的海洋微藻及其富含多糖、脂類和蛋白質(zhì)藻株的物種多樣性豐富, 在新型藥物、活性天然產(chǎn)物、功能食品和飼料及其添加劑的發(fā)掘等方面具有良好前景。

硇洲島; 徐聞珊瑚礁自然保護(hù)區(qū); 海洋微藻; 多糖; 脂類; 蛋白質(zhì); 多樣性

海洋微藻是生活在海洋環(huán)境中的一大類原核或真核微生物。它們可利用太陽能將水和CO2經(jīng)光合作用轉(zhuǎn)變成多糖、蛋白質(zhì)和脂類等生物大分子。已知的物種有30000多種, 據(jù)估算總數(shù)約為200000種[1]。一些在東亞和亞太部分地區(qū)長期食用的海洋微藻含有豐富的蛋白質(zhì)[2]、脂類[3]和多糖[4]等營養(yǎng)物質(zhì), 已經(jīng)或正在被廣泛用于新型保健食品、飼料、食品和飼料添加劑及生物能源等的產(chǎn)品的研究和開發(fā)[5,6]; 另有一些海洋微藻含有豐富的活性多肽、包括二十二碳六烯酸(DHA)和二十碳五烯酸(EPA)在內(nèi)的多不飽和脂肪酸、硫酸酯多糖等活性次級代謝產(chǎn)物, 被認(rèn)為在新型活性天然產(chǎn)物、藥物或藥物先導(dǎo)物、食品和飼料添加劑、化妝品等的發(fā)掘中有巨大潛力[7,8]。

微藻是單細(xì)胞或簡單的多細(xì)胞光合自養(yǎng)微生物, 只要是有陽光和少量營養(yǎng)鹽的地方就能夠生長繁殖, 可在海水、鹽田和營養(yǎng)貧瘠等不利環(huán)境下快速生長[9]。獲取適合當(dāng)?shù)丨h(huán)境和氣候條件的優(yōu)良藻種是海洋微藻培養(yǎng)和使用的前提條件[10]。雖然國內(nèi)外已建有了一些保存微藻種質(zhì)資源的培養(yǎng)物保藏中心, 但目前公認(rèn)的24000多種微藻物種中大約只有10%的微藻物種被成功地長期保存[8,11], 而許多自然環(huán)境中則存在著很多具有優(yōu)良生物學(xué)特性的藻種有待發(fā)掘, 且使用當(dāng)?shù)卦宸N已被證明對當(dāng)?shù)丨h(huán)境和氣候條件等具有適應(yīng)性強(qiáng)等明顯的優(yōu)勢并可避免非當(dāng)?shù)匚锓N入侵[12]。因此, 分析探討特定區(qū)域特定生態(tài)環(huán)境中海洋微藻, 尤其是富含多糖、脂類和蛋白質(zhì)藻株的多樣性, 不僅有重要的生態(tài)學(xué)意義而且有良好的應(yīng)用前景[6,8,13]。

硇洲島和徐聞珊瑚礁國家級自然保護(hù)區(qū)地處湛江沿海, 是目前國內(nèi)受人類活動(dòng)影響較小的熱帶、亞熱帶海島和珊瑚礁自然保護(hù)區(qū), 其潮間帶蘊(yùn)藏著豐富的海洋微生物資源[11,14]。研究的目的是篩選和分析硇洲島和徐聞珊瑚礁自然保護(hù)區(qū)潮間帶可培養(yǎng)的富含多糖、脂類或蛋白質(zhì)的海洋藻微的多樣性, 為熱帶和亞熱帶海洋微藻資源的開發(fā)利用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

用于富含多糖、脂類和蛋白質(zhì)藻株篩選及其物種多樣性分析的海洋微藻共189株, 其中118株為本研究組之前從徐聞珊瑚礁國家自然保護(hù)區(qū)(20°10′—20°27′N, 109°50′—109°24′E)潮間帶分離藻株(GenBank登錄號KU561102-KU561219)[11], 70株由本研究從徐聞珊瑚礁自然保護(hù)區(qū)和硇洲島(20°52′—20°56′N, 110°33′— 110°38′E)潮間帶采樣、分離和鑒定(GenBank登錄號為KY054925-KY054994), 紫球藻由廣東恒興飼料實(shí)業(yè)股份有限公司饋贈(zèng)(GenBank登錄號為KY054995, 已在本地作為餌料養(yǎng)殖多年)。

1.2 研究方法

海洋微藻的富集、分離純化 采用本研究組之前報(bào)道的方法[11]進(jìn)行。簡單說就是取2 g泥沙樣品懸浮于20 mL滅菌天然海水, 其上清液和海水樣品分別用100 μm的濾網(wǎng)過濾去除懸浮顆粒和浮游動(dòng)物后, 取5 mL濾液轉(zhuǎn)移到裝有15 mL f/2-medium液體培養(yǎng)基[15](將f/2-medium營養(yǎng)液[15]與經(jīng)0.45 μm濾膜過濾的自然海水1∶1000混合, 120℃, 20min高壓滅菌后冷卻至室溫)60 mL的錐形瓶中, 置于光照培養(yǎng)箱中, 在溫度(25±2)℃、光照強(qiáng)度3000 lx、光暗比12h∶12h條件下富集培養(yǎng)約7—10d。

富集培養(yǎng)液經(jīng)細(xì)胞計(jì)數(shù)后分別稀釋成1個(gè)活細(xì)胞/μL, 取1 μL置于96孔培養(yǎng)板各孔的中央, 在倒置顯微鏡(10×10倍)下觀察, 找出并標(biāo)記僅含有一個(gè)藻細(xì)胞的孔; 向含2個(gè)或2個(gè)以上藻細(xì)胞的孔中滴加10 μL f/2-medium液體培養(yǎng)基[15], 用微吸管將多余的細(xì)胞剔除或轉(zhuǎn)移到無細(xì)胞的小孔并標(biāo)記為僅含1個(gè)藻細(xì)胞的孔; 各孔加入200 μL f/2-medium液體培養(yǎng)基[15]后, 將96孔板放置于光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng), 溫度為(25±2)℃, 光照強(qiáng)度3000 lx, 光暗比12h∶12h條件下培養(yǎng)約1周; 鏡檢確認(rèn)單一藻細(xì)胞生長的孔, 并將孔中藻液轉(zhuǎn)移至裝有40 mL f/2-medium液體培養(yǎng)基[15]的100 mL錐形瓶中, 置入光照培養(yǎng)搖床, 在溫度(25±2)℃、光照強(qiáng)度3000 lx、光暗比12h∶12h、搖床轉(zhuǎn)速130 r/min的條件下培養(yǎng)7—10d。

微藻保存 取f/2-medium海水固體培養(yǎng)基[15]倒成試管斜面, 再向斜面內(nèi)加入f/2-medium海水液體培養(yǎng)基[15](每1000 mL加入2.5 mL的2 mL 8萬單位的硫酸慶大霉素注射液), 使其漫過固體斜面形成固液雙相斜面培養(yǎng)基。取擴(kuò)大培養(yǎng)約7d的藻種樣品, 8000×g離心5min棄上清, 將沉淀的藻細(xì)胞用少量液體培養(yǎng)基吹打均勻, 轉(zhuǎn)移至固液雙相斜面培養(yǎng)基中, 于光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7—10d, 待長成一定量后放入4℃冰箱保存。4℃冰箱要定期開弱光以保證在低溫弱光的條件, 半年復(fù)蘇繼代一次[11]。

富含多糖藻株的篩選 采用硫酸蒽酮法[16],以葡萄糖為標(biāo)準(zhǔn), 以已知多糖含量為12.55%的NZmm2w1藻株為陽性對照, 對所獲得的海洋微藻的多糖進(jìn)行定量分析。取50 μL的新鮮藻液, 加入到96孔板中, 測定OD680值, 然后加入150 μL的0.2%硫酸蒽酮試劑, 在沸水浴中加熱3min, 冷卻到室溫, 用酶標(biāo)儀在630 nm處測定OD值, 根據(jù)標(biāo)以葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液制作的準(zhǔn)曲線計(jì)算出多糖的相對濃度。

富含脂類藻株的篩選 采用一種基于96孔板的尼羅紅染色法進(jìn)行。8000×g離心10min收集處于對數(shù)生長中晚期的海洋微藻, 用生理鹽水洗3次后再懸浮于生理鹽水; 測OD680后將微藻懸液調(diào)整至A680=0.8; 取各種微藻懸液100 μL, 一式3份, 加入到96孔板的孔中與400 μL 20% DMSO混勻; 各孔加入12 μL 100 μg/mL尼羅紅丙酮溶液, 混勻后置暗處35℃溫育6min; 微藻細(xì)胞中被尼羅紅染色的脂質(zhì)可采用倒置熒光顯微鏡(Nikon eclipse TE2000-E inverted microscope)進(jìn)行觀察并攝影記錄; 各孔的熒光強(qiáng)度采用酶標(biāo)儀(Varioskan Flash Multimode Reader; Thermo-Fisher, USA), 選用530 nm激發(fā)波長和590 nm發(fā)射波長進(jìn)行測定。

富含蛋白藻株的篩選 準(zhǔn)確稱取2 mg冷凍干燥的微藻藻粉, 于玻璃勻漿器中, 加入100 μL 0.1 mol/L的PBS, 充分研磨藻粉, 使其細(xì)胞壁破碎完全后, 吸出置于2 mLEP管, 用900 μL 0.1 mol/L的PBS分3次洗滌玻璃勻漿器, 并吸出置于上述的EP管。在5000 r/min轉(zhuǎn)速下離心10min, 上清液按照BCA法蛋白定量試劑盒的說明進(jìn)行蛋白質(zhì)定量分析; 在562 nm波長下用紫外分光光度計(jì)測其吸光度值, 并根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線換算蛋白質(zhì)的含量[13]。

微藻種屬鑒定及多樣性分析 取少量藻液滴于載波片并用盧戈式碘液固定, 于50i智能型正置顯微鏡上用100倍油鏡觀察微藻細(xì)胞的形態(tài)學(xué)特征并拍照記錄。

收集100 mg濕重對數(shù)生長中晚期的微藻, 用植物基因組DNA提取試劑盒提取基因組DNA作為模板, 用微藻18S rDNA特異性通用PCR引物對[17]擴(kuò)增藻株18S rDNA序列, 擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳分離后送至上海生工生物工程股份有限公司測序, 測序結(jié)果提交GenBank; 采用ClustalW2對測序結(jié)果進(jìn)行兩兩比對, 排除相同序列; 采用Blast搜索軟件(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)從GenBank公共數(shù)據(jù)庫中搜索出18S rDNA序列一致性最大的物種從而對藻株做出初步的鑒定; 用MEGA5.10軟件按照鄰接法聚類法[18](選擇Bootstrap檢驗(yàn)值≥50%, 1000次重復(fù)) 構(gòu)建藻株18S rDNA序列系統(tǒng)發(fā)育樹[11]。

2 結(jié)果

2.1 海洋微藻的分離純化

之前研究組已從徐聞珊瑚礁自然保護(hù)區(qū)潮間帶分離鑒定了118株海洋微藻[11], 本研究從徐文珊瑚礁自然保護(hù)區(qū)采集的樣品中分離出了56株微藻,從硇洲島分離的樣品中分離出了14株海洋微藻, 共分離、鑒定和收藏了188株海洋微藻, 加上紫球藻,共收藏了189株海洋微藻。

2.2 海洋微藻的鑒定及多樣性分析

各藻株的18S rDNA序列分析比對的結(jié)果顯示:獲得的189株海洋微藻歸屬微藻的4門, 9綱, 25目, 30科, 38屬, 65種; 優(yōu)勢屬為雙眉藻屬(Amphora), 含39株, 占被分離藻種的20.6%, 與研究組之前的報(bào)道[11]一致; 其次為褶盤藻屬(Entomoneis), 含22株,占被分離藻株的11.6%(表 1)。微藻硅藻門(Bacillariophyta)海洋微藻共有154株45種22屬; 其中歸屬硅藻綱(Bacillariophyceae)的微藻134株, 占分離培養(yǎng)微藻的70.9%, 中鼓藻綱(Mediophyceae)微藻19株, 約占10.1%。綠藻門(Chlorophyta)海洋微藻共有29株15種12屬; 其中, 歸屬共球藻綱(Trebouxiophyceae)的微藻22株, 約占11.6%。定鞭藻門(Haptophyta) 海洋微藻共有5株4種3屬。紅藻門(Rhodophyta)只有1株(表 1)。65種海洋微藻的代表株在100倍油鏡下形態(tài)觀察見圖 1。

2.3 富含多糖海洋微藻分類及多樣性

采用硫酸蒽酮法[16]對獲得的藻株多糖含量進(jìn)行分析和對藻株18S rDNA序列進(jìn)行比對分析及系統(tǒng)進(jìn)化樹構(gòu)建(圖 2)的結(jié)果顯示: 189株海洋微藻中多糖含量較高(高于作為陽性對照的微擬球藻NZmm2W1的總糖量, 即高于藻體干重的12.55%,相當(dāng)于0.45 μg/104cells)的46株高產(chǎn)多糖藻株(表1)歸屬25種, 分布于硅藻門(Bacillariophyta)、綠藻門(Chlorophyta)、定鞭藻門(Haptophyta)和紅藻門(Rhodophyta)的6綱、14目、16科、20屬; 其中優(yōu)勢屬為褶盤藻/翼繭形藻屬(Entomoneis), 共8株, 占高產(chǎn)多糖藻株的17.4%; 其次為雙眉藻屬(Amphora),共7株, 占高產(chǎn)多糖藻株的15.2%。

多糖含量最高的3株微藻為Xmm16W4(克里格輻節(jié)藻: Stauroneis kriegeri)、Xmm16S2(小頭端菱形藻: Nitzschia capitellata)和DHmm1S3(俄克拉何馬綠藻: Picochlorum oklahomensis), 多糖含量依次為(2.57±0.01)、(1.94±0.03)和(1.59±0.03) μg/104cells。

2.4 富含脂類海洋微藻的分類及多樣性

采用基于96孔板的尼羅紅染色法對獲得的藻株脂類含量進(jìn)行分析和對藻株18S rDNA序列進(jìn)行比較及系統(tǒng)進(jìn)化樹構(gòu)建(圖 3)的分析結(jié)果顯示: 在189株海洋微藻中, 中性脂含量較高(高于作為陽性對照的小球藻NZmm3W1的脂含量, 即GC-MS測定值為藻體干重的11.74%, 相當(dāng)于0.72 μg/104cells)的46株高產(chǎn)脂類藻株(表 1)歸屬32個(gè)種, 分布于硅藻門(Bacillariophyta)、綠藻門(Chlorophyta)和定鞭藻門(Haptophyta)的5綱，14目，11科，15個(gè)屬; 優(yōu)勢屬為雙眉藻屬(Amphora), 含10株, 占富脂藻株的21.7%。

中性脂含量最高的8株微藻為Xmm16W4、Xmm19W1、Xmm10S2(克里格輻節(jié)藻: Stauroneis kriegeri)、Xmm19W2(劍形輻節(jié)藻: Stauroneis anceps)、Xmm20S4(纖細(xì)輻節(jié)藻: Stauroneis gracilior)、 Xmm18W1(新月細(xì)柱藻; Cylindrotheca closterium)、Xmm37W1(–: Nanochlorum eucaryotum)和Xmm16W1(–: Dickieia ulvacea)、中性脂含量為(2.11±0.01)—(3.61±0.03) μg/104cells。

2.5 富含蛋白海洋微藻分類及多樣性

采用BCA蛋白定量法[13]對獲得的藻株蛋白含量進(jìn)行定量和對藻株18S rDNA序列進(jìn)行比較及系統(tǒng)進(jìn)化樹構(gòu)建(圖 4)的分析結(jié)果顯示: 189株海洋微藻中蛋白含量較高(高于作為陽性對照的微擬球藻NZmm2W1的蛋白含量, 即高于藻體干重的10%)的46株高產(chǎn)蛋白藻株(表 1)歸屬于28個(gè)種, 分布于硅藻門(Bacillariophyta)、綠藻門(Chlorophyta)、定鞭藻門(Haptophyta)和紅藻門(Rhodophyta)的6綱，14目，15科，18個(gè)屬; 優(yōu)勢屬為雙眉藻屬(Amphora), 含10株, 占富蛋白質(zhì)藻株的21.7%。

蛋白含量最高的3株微藻為DHmm1W2(新月細(xì)柱藻; Cylindrotheca closterium)、Xmm30W2和DHmm2S4(咖啡型雙眉藻; Amphora coffeaeformis),蛋白含量依次為藻體干重的(20.47±0.41)%、(20.38±0.14)%和(19.82±0.20)%。

2.6 富含多糖、脂類和蛋白的海洋微藻

所獲得的189株海洋微藻中, 多糖、脂類物質(zhì)和蛋白質(zhì)含量相對都較高(同一藻株的多糖、脂肪酸和蛋白質(zhì)分別高于藻體干重的12.55%、11.74%和10%)的藻株有8株(表 2); 舟形藻屬(Navicula)海洋微藻3株, 菱形藻屬(Nitzschia)海洋微藻有2株, 輻節(jié)藻屬(Stauroneis)、微眼藻屬(Minutocellus)和-(Nanochlorum)屬海洋微藻各1株(表 2)。其中, 藻株

Xmm16W4(克里格輻節(jié)藻: Stauroneis kriegeri)不僅蛋白質(zhì)含量相對較高, 而且多糖和脂類的含量是所獲得的微藻中最高的。

表 1 硇洲島和徐文珊瑚礁自然保護(hù)區(qū)可培養(yǎng)海洋微藻及其高糖、脂和蛋白藻株的類群分布Tab. 1 Groups distribution of the cultivated marine microalgae and the strains with higher polysaccharide, lipid and protein from Nao Zhou Island and Xuwen coral reef nature reserve

圖 1 湛江沿海潮間帶可培養(yǎng)海洋微藻Fig. 1 Light microscopic images of the marine microalgae from the intertidal zone along Zhanjiang coast

3 討論

湛江地區(qū)地處熱帶亞熱帶地區(qū), 全年日照充足、氣溫適宜, 并擁有大量的灘涂濕地和適合海洋微藻生長的海水, 具備開展大規(guī)模培養(yǎng)海洋微藻進(jìn)而研發(fā)微藻餌料和飼料、保健食品、飼料和食品添加劑、活性天然產(chǎn)物和藥物或藥物先導(dǎo)物、化妝品及生物燃料等的良好環(huán)境。研究表明, 獲取適合當(dāng)?shù)丨h(huán)境和氣候條件的優(yōu)良藻種是海洋微藻培養(yǎng)和使用的前提條件之一[10]。本研究通過分析源自硇洲島和徐聞珊瑚礁自然保護(hù)區(qū)潮間帶的189株可培養(yǎng)的海洋微藻及其中富含多糖、脂類和蛋白質(zhì)藻株的多樣性, 篩選出了一批富含多糖、脂類和蛋白的海洋微藻。在篩選出多糖含量最高的3株海洋微藻中, 克里格輻節(jié)藻(Stauroneis kriegeri)為輻節(jié)藻屬(Stauroneis)硅藻, 該屬已知藻種或藻株的適鹽性和適溫性都比較高, 多為能生長在鹽度和溫度變化幅度較大的高中潮區(qū)的底棲種類, 已有從中找到一些富含多糖和蛋白聚糖的藻種或藻株的報(bào)道[19]; 小頭端菱形藻(Nitzschia capitellata)為菱形藻屬(Nitzschia)硅藻, 一些藻株已被作為水產(chǎn)養(yǎng)殖的優(yōu)質(zhì)餌料使用, 或作為生物能源生產(chǎn)資源的候選藻種加以研發(fā)[4]; 俄克拉何馬綠藻 (Picochlorum oklahomensis)是一種適鹽性很強(qiáng)的單細(xì)胞綠藻, 最早是從美國俄克拉何馬州西北部的鹽平原國家野生動(dòng)物保護(hù)區(qū)淺蒸發(fā)池的高鹽及營養(yǎng)貧瘠的環(huán)境分離得到[20], 后來發(fā)現(xiàn)一些藻株不僅包括多不飽和脂肪酸在內(nèi)的脂類和蛋白含量較高, 而且生長快產(chǎn)量高, 已被用于生物能源和其他海洋微藻生物產(chǎn)品的研發(fā)[10]。大量研究表明, 海洋微藻多糖具有免疫增強(qiáng)和抗腫瘤、抗病毒、抗凝血、抗衰老、抗輻射及等多生物活性[4]。因此, 分離、培養(yǎng)、鑒定和貯藏這些適鹽性和適溫性都比較高的富糖海洋微藻, 預(yù)期在新型多糖類功能食品、藥品和抗輻射化妝品領(lǐng)域都有很好的應(yīng)用前景。

其次, 在篩選出脂類含量最高的8株海洋微藻中, 3株克里格輻節(jié)藻(Stauroneis kriegeri)不僅脂類含量高, 多糖和蛋白質(zhì)的含量也比較高; 新月細(xì)柱藻(Cylindrotheca closterium)是一種底棲硅藻, 其中一些藻株因被發(fā)現(xiàn)富含多糖, 包括胞外多糖和胞內(nèi)多糖而被選用于海洋微藻多糖產(chǎn)品的研發(fā)[21,22], 但迄今未見有富脂新月細(xì)柱藻藻株的文獻(xiàn)報(bào)道; 劍形輻節(jié)藻(Stauroneis anceps)、纖細(xì)輻節(jié)藻(Stauroneis gracilior)和Dickieia ulvacea藻也都是硅藻, 但及至投稿前我們都沒能檢索到有關(guān)它們的文獻(xiàn)報(bào)道。目前, DHA和EPA等ω-3多不飽和脂肪酸已被世界各國批準(zhǔn)作為飲料和食品添加劑、功能食品和藥物而廣泛用于預(yù)防和治療一些慢性疾病[8], 而富脂海洋微藻不僅被普遍認(rèn)為是替代魚油作為ω-3多不飽和脂肪酸生產(chǎn)的理想資源, 而且也是替代油料植物用于生物燃料生產(chǎn)的重要資源。

圖 2 高產(chǎn)多糖藻株與GenBank數(shù)據(jù)庫中相應(yīng)藻種的18S rDNA序列系統(tǒng)進(jìn)化樹

圖 3 富含脂藻株與GenBank數(shù)據(jù)庫中相應(yīng)藻種的18S rDNA序列系統(tǒng)進(jìn)化樹

圖 4 富含蛋白藻株與GenBank數(shù)據(jù)庫中相應(yīng)藻種的18S rDNA序列系統(tǒng)進(jìn)化樹

此外, 在篩選出蛋白含量最高的3株海洋微藻中, 除新月細(xì)柱藻(Cylindrotheca closterium)外, 2株咖啡型雙眉藻(Amphora coffeaeformis)為雙眉藻屬(Amphora)硅藻, 已發(fā)現(xiàn)該屬的一些藻種或藻株富含脂類物質(zhì), 已被作為熱帶海參餌料而展開培養(yǎng)技術(shù)和營養(yǎng)價(jià)值分析, 另一些則作為抗氧化劑活性天然產(chǎn)物資源開展研究[23]。在篩選出多糖、脂類物質(zhì)和蛋白質(zhì)含量相對都較高的8株微藻中, 除克里格輻節(jié)藻(Stauroneis kriegeri)和小頭端菱形藻(Nitzschia capitellata)外, 舟形藻屬(Navicula)海洋微藻中的一些藻種或藻株, 如薩利娜舟形藻(Navicula salinarum), 有被作為海洋微藻多糖和抗氧化劑活性天然產(chǎn)物資源研究的報(bào)道[4,22,23]; 微眼藻屬(Minutocellus)微藻是在渤海海域褐潮期分離到的微型浮游生物之一, 也是在藻類毒性試驗(yàn)中常使用的一種硅藻, 并有作為抗氧化劑活性天然產(chǎn)物資源研究的報(bào)道[24]; Nanochlorum eucaryotum藻是19世紀(jì)80年代發(fā)現(xiàn)的, 在海洋綠藻綱中少見并具有最小真核生物特性的球菌樣的物種, 在氮缺乏條件下通氣培養(yǎng)可檢測到類胡蘿卜素、角黃素和蝦青素[25]。本研究分離、培養(yǎng)、鑒定和貯藏的這類海洋微藻, 預(yù)期不僅可以作用海水水產(chǎn)養(yǎng)殖的優(yōu)質(zhì)餌料和飼料添加劑, 而且還可能在功能食品、食品和飼料添加劑、抗氧化劑活性等活性天然產(chǎn)物研發(fā)領(lǐng)域有良好的應(yīng)用前景。

表 2 多糖、脂類和蛋白質(zhì)含量都較高的海洋微藻藻株Tab. 2 The isolated microalgal strains with higher contents of polysaccharide, lipid and protein

[1]Barra L, Chandrasekaran R, Corato F, et al. The challenge of ecophysiological biodiversity for biotechnological applications of marine microalgae [J]. Marine Drugs, 2014, 12(3): 1641—1675

[2]Samarakoon K, Jeon Y J. Bio-functionalities of proteins derived from marine algae: A review [J]. Food Research International, 2012, 48(2): 948—960

[3]D’Alessandro E B, Antoniosi Filho N R. Concepts and studies on lipid and pigments of microalgae: A review [J]. Renewable and Sustainable Energy Reviews, 2016, 58(11): 832—841

[4]Raposo M F, de Morais R M, Bernardo de Morais A M. Bioactivity and applications of sulphated polysaccharides from marine microalgae [J]. Marine Drugs, 2013, 11(1): 233—252

[5]Suganya T, Varman M, Masjuki H H, et al. Macroalgae and microalgae as a potential source for commercial applications along with biofuels production: A biorefinery approach [J]. Renewable and Sustainable Energy Reviews, 2016, 55(2): 909—941

[6]Pulz O, Gross W. Valuable products from biotechnology of microalgae [J]. Applied Microbiology and Biotechnology, 2004, 65(6): 635—648

[7]Lauritano C, Andersen J H, Hansen E, et al. Bioactivity screening of microalgae for antioxidant, anti-inflammatory, anticancer, anti-diabetes, and antibacterial activities [J]. Frontiers in Marine Science, 2016, 68(3): 68—79

[8]Varfolomeev S D, Wasserman L A. Microalgae as source of biofuel, food, fodder, and medicines [J]. Applied Biochemistry and Microbiology, 2011, 47(9): 789—807

[9]Acreman J. Algae and cyanobacteria: isolation, culture and long-term maintenance [J]. Journal of Industrial Microbiology, 1994, 13(3): 193—194

[10]Zhu Y, Dunford N T. Growth and biomass characteristics of Picochlorum oklahomensis and Nannochloropsis oculata [J]. Journal of the American Oil Chemists’ Society, 2013, 90(6): 841—849

[11]Yiao X H, Huang Y M, Lan L B, et al. The biodiversity of culturable lipid-rich microalgae from Xuwen coral reef nature reserve [J]. Ecological Science, 2016, 35(4): 52—61 [楊曉紅, 黃永梅, 蘭柳波, 等. 徐聞珊瑚礁自然保護(hù)區(qū)可培養(yǎng)富脂海洋微藻的生物多樣性. 生態(tài)科學(xué), 2016, 35(4): 52—61]

[12]Mata T M, Martins A A, Caetano N S. Microalgae for biodiesel production and other applications: A review [J]. Renewable and Sustainable Energy Reviews, 2010, 14(1): 217—232

[13]Duong V T, Ahmed F, Thomas-Hall S R, et al. High protein-and high lipid-producing microalgae from northern australia as potential feedstock for animal feed and biodiesel [J]. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology, 2015, 53(3): 1—10

[14]Cui L J, W J, Lü Y N, et al. Biodiversity analysis of marine fungi producing extracellular fibrinolytic activity enzymes from the intertidal zone along Zhanjiang coast [J]. Microbiology China, 2016, 43(7): 1448—1461 [崔麗嬌,王潔, 呂應(yīng)年, 等. 湛江沿海潮間帶產(chǎn)胞外纖溶活性酶類海洋真菌的生物多樣性分析. 微生物學(xué)通報(bào), 2016, 43(7): 1448—1461]

[15]Harrison P J, Berges J A. Marine Culture Media [M]. In: Andersen R A (Eds.), Algal Culture Techniques. London: Elsevier Academic Press. 2005, 21—34

[16]Leyva A, Quintana A, Sanchez M, et al. Rapid and sensitive anthrone-sulfuric acid assay in microplate format to quantify carbohydrate in biopharmaceutical products: method development and validation [J]. Journal of the International Association of Biological Standardization, 2008, 36(2): 134—141

[17]Zhang S, Liu P H, Yang X, et al. Isolation and identification by 18S rDNA sequence of high lipid potential microalgal species for fuel production in Hainan Dao [J]. Biomass and Bioenergy, 2014, 66(7): 197—203

[18]Saitou N, Nei A M. The neighbor-joining method: a new method for reconstructing phylogenetic trees [J]. Molecular Biology and Evolution, 1987, 4(4): 406—425

[19]McConville M J, Wetherbee R, Bacic A. Subcellular location and composition of the wall and secreted extracellular sulphated polysaccharides/proteoglycans of the diatom Stauroneis amphioxys Gregory [J]. Protoplasma, 1999, 206(1—3): 188—200

[20]Annan J N. Growth and photosynthesis response of the green alga, Picochlorum oklahomensis to iron limitation and salinity stress [J]. International Journal of Plant Physiology and Biochemistry, 2014, 6(1): 7—18

[21]Staats N, Stal L J, Mur L R. Exopolysaccharide production by the epipelic diatom Cylindrotheca closterium: effects of nutrient conditions [J]. Journal of Experimental Marine Biology and Ecology, 2000, 249(1): 13—27

[22]Staats N, De Winder B, Stal L, et al. Isolation and characterization of extracellular polysaccharides from the epipelic diatoms Cylindrotheca closterium and Navicula salinarum [J]. European Journal of Phycology, 1999, 34(2): 161—169

[23]Lee S H, Karawita R, Affan A, et al. Potential of benthic diatoms Achnanthes longipes, Amphora coffeaeformis and Navicula sp. (Bacillariophyceae) as antioxidant sources [J]. Journal of Food Science and Nutrition, 2008, 13(3): 166—175

[24]Walsh G E, McLaughlin L L, Yoder M J, et al. Minutocellus polymorphus: A new marine diatom for use in algal toxicity tests [J]. Environmental Toxicology and Chemistry, 1988, 7(11): 925—929

[25]Geisert M, Rose T, Bauer W, et al. Occurrence of carotenoids and sporopollenin in Nanochlorum eucaryotum: a novel marine alga with unusual characteristics [J]. BioSystems, 1987, 20(2): 133—142

STUDIES ON THE DIVERSITY OF MARINE MICROALGAE AND THE STRAINS WITH HIGH POLYSACCHARIDES, LIPIDS AND PROTEINS ALONG ZHANJIANG COASTAL AREAS

HUANG Yong-Mei1,2, YANG Xiao-Hong1,2, LAN Liu-Bo3, ZHAN Jing-Ting1,2, LUO Hui1,2and JIANG Li-Ming2,3
(1. Chemistry Teaching and Research Section, Guangdong Medical University, Zhanjiang 524023, China; 2. The Key Lab of Zhanjiang for R&D Marine Microbial Resources in the Beibu Gulf Rim, Zhanjiang 524023, China; 3. Institute of Biochemistry and Molecular Biology, Guangdong Medical University, Zhanjiang 524023, China)

Marine microalgae were isolated from seawater and sediment samples collected from the intertidal zone of NaoZhou Island and Xuwen Coral Reef Nature Reserve, and identification and diversity of their strains with high contents of polysaccharides, lipids and proteins were analyzed by microalgal morphological observation, and sequence comparison and phylogeny analysis based on microalgal 18S rDNA sequences. A total of 189 strains of marine microalgae were isolated, cultured and identified, which represent 66 species distributed in 38 genera, 30 families, 25 orders, 9 classes, and belong to Bacillariophyta, Chlorophyta, Haptophyta and Rhodophyta of microalgae. Amongst, 46 strains with higher polysaccharide content belong to 25 species, and 20 genera, and 46 strains with higher lipid content represent 32 species belonging to 15 genera; and another 46 strains with higher protein content represent 28 species from 18 genera. It is concluded that the diversity of cultivable marine microalgae species and their strains with high content of polysaccharides, lipids and proteins is high from NaoZhou Island and Xuwen Coral Reef Nature Reserve, which possessed huge potential for exploring new drug or active natural products, functional food and fodder, and additives for food and fodder.

Naozhou Island; Xuwen coral reef nature reserve; Marine microalgae; Polysaccharide; Lipid; Protein; Biodiversity

10.7541/2017.135

2016-10-25;

2017-04-16

湛江市環(huán)北部灣海岸特色微藻生物資源產(chǎn)品研發(fā)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(2012E02)資助 [Supported by the Key Lab of Zhanjiang for R&D Marine Microbial Resources in the Beibu Gulf Rim (2012E02)]

黃永梅(1988—), 女, 廣東羅定人; 碩士研究生; 研究方向?yàn)楹Ｑ笪⒃宓拈_發(fā)利用。E-mail: 727148105@qq.com

羅輝, 男, 教授, 研究方向?yàn)楹Ｑ笪⑸镔Y源開發(fā)與利用。E-mail: gdmuluohui@139.com; 江黎明, 男, 主任技師; 研究方向?yàn)楹Ｑ笪⑸镔Y源開發(fā)與利用; E-mail: lmjiang@gdmc.edu.cn

Q949.2

A

1000-3207(2017)05-1080-11