王沈同 張 猛 黨云飛 李立森 黃文吉 方 圓 王 豐 沈玉幫 李家樂

(上海海洋大學(xué)省部共建水產(chǎn)種質(zhì)資源發(fā)掘與利用教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 上海 201306)

草魚野生與選育群體線粒體DNA控制區(qū)D-loop遺傳變異分析

王沈同 張 猛 黨云飛 李立森 黃文吉 方 圓 王 豐 沈玉幫 李家樂

(上海海洋大學(xué)省部共建水產(chǎn)種質(zhì)資源發(fā)掘與利用教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 上海 201306)

為探究經(jīng)過2個(gè)選育世代后選育群體遺傳多樣性和遺傳結(jié)構(gòu)的變化, 研究對(duì)4個(gè)野生群體(邗江、九江、石首和吳江)和2個(gè)選育世代(F1和F2)進(jìn)行了線粒體DNA控制區(qū)(D-loop)序列的遺傳變異分析。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明, 4個(gè)野生群體在單倍型數(shù)目(H)、單倍型多樣性(Hd)、核苷酸多樣性(π)、平均核苷酸差異數(shù)(K)水平上均高于2個(gè)選育世代, 在2個(gè)選育世代內(nèi)表現(xiàn)為F1代群體的核苷酸多樣性(π)和平均核苷酸差異數(shù)(K)大于F2代群體, 但單倍型多樣性(Hd)小于F2代群體; 單倍型分析結(jié)果表明, 6個(gè)群體間無共享單倍型, 4個(gè)野生群體間共發(fā)現(xiàn)2種共享單倍型(Hap1和Hap3), 石首群體和2個(gè)選育世代共享1種單倍型(Hap15); 遺傳分化指數(shù)(Fst)分析結(jié)果表明,邗江、九江、吳江3個(gè)野生群體和2個(gè)選育世代間存在較大的遺傳分化(Fst范圍為0.41475—0.55128), 石首群體與F1代群體之間存在較小的遺傳分化, 與F2代群體之間存在中等水平的遺傳分化, 同時(shí)F1代群體與F2代群體之間存在較小的遺傳分化; 基于6個(gè)群體276個(gè)個(gè)體構(gòu)建的鄰接(Neighbor-Joining, NJ)進(jìn)化樹和基于27種單倍型構(gòu)建的單倍型網(wǎng)絡(luò)圖也得到了相似的結(jié)論, 即邗江、九江、吳江3個(gè)野生群體和2個(gè)選育世代間的親緣關(guān)系較遠(yuǎn), 石首群體和2個(gè)選育世代兩兩之間的親緣關(guān)系較近。以上結(jié)果表明, 經(jīng)過2個(gè)世代的選擇育種, 選育群體的遺傳結(jié)構(gòu)已發(fā)生了變化, 并且隨著選育的進(jìn)行, 選育世代的遺傳多樣性下降的較為明顯, 這警示著我們?cè)诮窈蟮挠N工作中應(yīng)適當(dāng)改變現(xiàn)有的選育方案, 并實(shí)時(shí)監(jiān)測選育群體的遺傳多樣性, 以便為今后進(jìn)一步的選育工作打下堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。

草魚; 選育群體; 野生群體; mt DNA; D-loop; 遺傳變異

草魚(Ctenopharyngodon idella)是我國重要的淡水養(yǎng)殖魚類之一, 主要分布于長江、珠江、黑龍江三大水系, 自1958年草魚人工繁育成功以來, 年產(chǎn)量逐年增長[1], 據(jù)FAO統(tǒng)計(jì), 草魚年產(chǎn)量在2012年位于世界水品種產(chǎn)量的第三位[2], 但是近幾年草魚的種質(zhì)資源日益衰減, 主要表現(xiàn)為性成熟年齡提前,生長速度變慢, 繁殖率低, 疾病發(fā)生率變高等, 主要原因歸結(jié)為草魚種質(zhì)資源的退化, 人工繁殖管理的不規(guī)范導(dǎo)致草魚的近交系數(shù)變高, 群體的遺傳多樣性下降[3]。鑒于上述現(xiàn)象, 開展草魚選擇育種的工作迫在眉睫。

在開展遺傳育種工作過程中群體遺傳多樣性的高低顯得尤為重要, 較高水平的遺傳多樣性能確保每一代在育種過程中可以獲得更可觀的遺傳進(jìn)展、提高育種的效率, 并能提高群體的適應(yīng)能力和抗病能力[4,5], 然而在一些物種的育種過程中其后代的遺傳多樣性表現(xiàn)為明顯的下降[6,7], 這將不利于后續(xù)育種工作的進(jìn)行, 因此在開展育種工作過程中, 有必要對(duì)選育群體進(jìn)行遺傳多樣性和遺傳結(jié)構(gòu)評(píng)估, 以便為育種工作提供一些指導(dǎo)性的意見、提高育種的效率, 進(jìn)而加快育種工作的進(jìn)展。

線粒體DNA具有嚴(yán)格的母系遺傳特點(diǎn), 同時(shí)具有拷貝數(shù)高、DNA分子量小、缺乏重組、結(jié)構(gòu)和組織簡單而高度保守、DNA突變率高等一系列優(yōu)點(diǎn)[8]?？刂茀^(qū)(D-loop)是線粒體DNA上的一段非編碼區(qū), 受進(jìn)化壓力小、遺傳變異程度高[9,10], 并且進(jìn)化速率快, 是其他區(qū)段的5倍[10,11], 常被用于群體水平的遺傳變異分析。由于草魚個(gè)體大、性成熟周期長、繁殖和測量性狀不易操作等特點(diǎn), 至今仍沒有選育出新的品種, 而且對(duì)于草魚選育過程中選育群體遺傳多樣性評(píng)價(jià)及比較的工作相對(duì)較少。本研究采用PCR擴(kuò)增和DNA測序技術(shù)對(duì)草魚4個(gè)野生群體和2個(gè)選育世代的線粒體D-loop區(qū)域部分片段進(jìn)行了遺傳變異檢測, 初步分析草魚在經(jīng)過2個(gè)世代的選育工作后, 其選育群體遺傳多樣性和遺傳結(jié)構(gòu)的變化, 為今后制定出更加合理有效的選育方案提供參考。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料與DNA提取

本研究所用的F1代和F2代長江水系選育群體和4個(gè)野生群體(邗江、九江、石首和吳江)從蘇州市申航生態(tài)科技發(fā)展股份有限公司采集(表 1)。2007—2008年收集了4個(gè)長江水系野生群體(邗江、九江、石首和吳江), 經(jīng)過遺傳分析后構(gòu)建了長江水系基礎(chǔ)群體。2010年從基礎(chǔ)群體中隨機(jī)選取88尾親本采用隨機(jī)交配和定向交配(個(gè)體的遺傳距離設(shè)計(jì))結(jié)合的方式繁殖產(chǎn)生了F1代[12]。經(jīng)過5年的培育, 2015年選取來自于不同家系的106尾親本采用隨機(jī)交配的方法繁殖產(chǎn)生了F2代。剪取6個(gè)群體的草魚胸鰭組織, 保存于無水乙醇中以便于之后的DNA提取, 本實(shí)驗(yàn)中所有樣品采用海洋動(dòng)物組織基因組DNA提取試劑盒(天根生化科技有限公司)提取基因組DNA, 通過1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測其完整性, 經(jīng)NanoDrop 2000C分光光度計(jì)(賽默飛世爾科技有限公司)檢測其純度及濃度, 并將DNA樣品稀釋成20 ng/μL, 于–20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 PCR擴(kuò)增及測序

根據(jù)草魚現(xiàn)有線粒體D-loop區(qū)域區(qū)段引物[13]完成PCR擴(kuò)增, 上游引物和下游引物序列分別為: DLF: 5′-CCTAGCGCCCAGAAAAGGGAGATT-3′; DLR: 5′-GCGGGGGATTGAGGGCATACTC-3′, PCR反應(yīng)體系總體積為50 μL: Taq PCR Mastermix 13 μL [成分為0.1 U Taq Polymerase/μL、500 μmol/L dNTP each、20 mmol/L Tris-HCl (pH 8.3)、100 mmol/ L KCl、3 mmol/L MgCl2、其他穩(wěn)定劑和增強(qiáng)劑],上下游引物各1 μL (10 μmol/L), 模板DNA 40 ng, ddH2O 33 μL。該試劑購自天根生化科技(北京)有限公司。PCR擴(kuò)增程序?yàn)? 94℃預(yù)變性3min; 94℃變性30s, 50℃復(fù)性30s, 72℃延伸2min, 擴(kuò)增35個(gè)循環(huán); 72℃延伸10min。擴(kuò)增反應(yīng)在Eppendorf梯度PCR儀上完成, 反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測, 合格的PCR產(chǎn)物由上海生工生物工程股份有限公司進(jìn)行測序。

1.3 序列整理與數(shù)據(jù)分析

采用Mega5.1[14]進(jìn)行序列間的同源對(duì)比和序列編輯, 統(tǒng)計(jì)各群體的突變位點(diǎn)數(shù)、突變類型和核苷酸組成, 并基于Kimura雙參數(shù)模型(Kimura 2-Parameter, K2P)構(gòu)建6個(gè)群體276個(gè)個(gè)體的鄰接(Neighbor-Joining, NJ)進(jìn)化樹, 系統(tǒng)發(fā)育樹中節(jié)點(diǎn)的自舉置信水平應(yīng)用自引導(dǎo)估計(jì), 循環(huán)次數(shù)為1000次。采用DNASP 5.0軟件[15]統(tǒng)計(jì)各單倍型分布情況、單倍型數(shù)(H)、單倍型多樣性(Hd)、核苷酸多樣性(π)、平均核苷酸差異數(shù)(K)、Tajima’s D值。采用Arlequin3.5軟件進(jìn)行6個(gè)群體的分子方差分析(AMOVA), 并計(jì)算6個(gè)群體兩兩之間的遺傳分化指數(shù)(Fst)。采用Network軟件構(gòu)建單倍型網(wǎng)絡(luò)圖, 用以檢測單倍型之間的進(jìn)化關(guān)系。

2 結(jié)果

2.1 線粒體控制區(qū)(D-loop)序列分析

對(duì)野生群體和選育世代線粒體控制區(qū)(D-loop)序列進(jìn)行同源對(duì)比后, 得到894 bp的同源序列。6個(gè)群體位點(diǎn)變異情況如表 1所示, 除石首群體存在2個(gè)顛換類型, 其他群體堿基突變類型均為轉(zhuǎn)換類型。堿基組成分析表示各群體堿基組成大致相同, T、C、A、G 4種堿基平均值分別為32.17%、21.03%、34.45%和12.36%, A+T (66.62%)所占比值明顯高于G+C (33.38%), 表現(xiàn)出明顯的AT偏好, 這與其他脊椎動(dòng)物線粒體控制區(qū)(D-loop)核苷酸的組成特點(diǎn)相一致[16]。

表 1 草魚線粒體DNA控制區(qū)(D-loop)序列突變位點(diǎn)數(shù)目Tab. 1 The number of mutation sites of mt DNA D-loop region in grass carp

2.2 草魚6個(gè)群體的遺傳多樣性及單倍型分析

6個(gè)群體線粒體DNA控制區(qū)(D-loop)遺傳多樣性參數(shù)如表 2所示, 無論是在單倍型數(shù)目(H)、單倍型多樣性(Hd)、核苷酸多樣性(π)還是平均核苷酸差異數(shù)(K)水平上, 野生群體的遺傳多樣性均比2個(gè)選育世代的要高。對(duì)4個(gè)野生群體而言, 石首群體的單倍型多樣性(Hd)最高(0.637), 吳江群體表現(xiàn)為最低(0.506); 邗江群體的核苷酸多樣性(π)和平均核苷酸差異數(shù)(K)最高(π=0.00232, K=2.063), 吳江群體表現(xiàn)為最低(π=0.00142, K=1.271); 2個(gè)選育世代相互比較發(fā)現(xiàn), 兩者單倍型數(shù)目(H)一致, F1代選育群體的核苷酸多樣性(π)和平均核苷酸差異數(shù)(K)均高于F2代選育群體, 但單倍型多樣性(Hd)表現(xiàn)為前者小于后者; 草魚6個(gè)群體的Tajima’s D 值為負(fù)值,且均未顯著偏離中性(P＞0.1)。

其單倍型分布如表 3所示, 6個(gè)群體共檢測出27種單倍型, 沒有發(fā)現(xiàn)共同享有的單倍型, 其中Hap15、Hap1為優(yōu)勢單倍型, 分別占6個(gè)群體總個(gè)體數(shù)的39%和32%。4個(gè)野生群體間存在2種共享單倍型Hap1和Hap3, 2個(gè)選育群體間存在1種共享單倍型Hap15。

2.3 草魚6個(gè)群體的遺傳結(jié)構(gòu)

對(duì)草魚6個(gè)群體兩兩之間遺傳分化情況進(jìn)行分析, 分析結(jié)果如表 4所示, F1代和F2代群體間的遺傳分化指數(shù)(Fst)為0.05741(P＜0.01), 結(jié)果表明2個(gè)世代間遺傳分化程度較低, 邗江、九江、吳江3個(gè)野生群體與2個(gè)選育世代之間的遺傳分化指數(shù)(Fst)均大于0.25(P值均小于0.01), 說明這3個(gè)野生群體與2個(gè)選育世代間存在著較大的遺傳分化, 并發(fā)現(xiàn)石首群體與F1代群體的遺傳分化指數(shù)Fst值為0.04861,與F2代群體的遺傳分化指數(shù)Fst值為0.13205, 結(jié)果表明石首群體和F1代群體間幾乎不存在著遺傳分化, 而和F2代群體之間存在著中等水平的分化程度。

以遺傳分化指數(shù)(Fst)為依據(jù)進(jìn)一步對(duì)草魚6個(gè)群體的核苷酸序列變異做分子方差分析, 6個(gè)群體分為2組(1組為HJ+JJ+WJ; 2組為SS+F1+F2), 總的方差剖分為組間方差(Va)、組內(nèi)群體間方差(Vb)和群體內(nèi)方差(Vc)3個(gè)部分, 并進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)。結(jié)果如表 5所示, 組間方差(Va)占總變異的38.11%, 組內(nèi)群體間的方差組分(Vb)占總變異的2.21%, 群體內(nèi)的方差組分(Vc)占總變異的59.69%, Fst=0.40312 (P＜0.01)。

2.4 草魚6個(gè)群體的系統(tǒng)發(fā)育樹和單倍型簡約網(wǎng)絡(luò)圖

根據(jù)草魚4個(gè)野生群體和2個(gè)選育世代共276個(gè)個(gè)體構(gòu)建的NJ系統(tǒng)發(fā)育樹發(fā)現(xiàn)6個(gè)群體在系統(tǒng)發(fā)育樹上基本被分成兩大分支, 3個(gè)野生群體(邗江、九江、吳江)構(gòu)成一大分支, 2個(gè)選育世代(F1和F2)和石首群體構(gòu)成另外一個(gè)分支, 不同分支內(nèi)個(gè)體間存在相互交叉, 其結(jié)果表明F1代、F2代和石首群體三者之間的親緣關(guān)系較近, 而這3個(gè)群體和另外3個(gè)野生群體(邗江、九江、吳江)的親緣關(guān)系較遠(yuǎn)?；?個(gè)群體27種單倍型的單倍型網(wǎng)絡(luò)圖如圖 2所示, F1代、F2代和石首群體3個(gè)群體間的親緣關(guān)系較近, 而2個(gè)選育群體和邗江、九江、吳江3個(gè)野生群體的親緣關(guān)系較遠(yuǎn), 與NJ系統(tǒng)發(fā)育樹的分析的結(jié)果基本一致, 并且從圖中可以看出享有Hap15和Hap1單倍型的個(gè)體數(shù)在種群中所占比例明顯高于其他單倍型所占比例。

3 討論

3.1 草魚野生與選育群體的遺傳多樣性分析

核苷酸多樣性(π)和單倍型多樣性(Hd)是衡量一個(gè)群體mt DNA變異程度的重要指標(biāo)。其中核苷酸多樣性(π)表示各種mt DNA單倍型在群體中所占的比例[17], 是評(píng)價(jià)群體遺傳多樣性的靈敏指標(biāo)。本研究中6個(gè)群體的核苷酸多樣性(0.00065—0.00232), 平均核苷酸差異數(shù)(0.578—2.063)在群體間的變化趨勢一致, 均為野生群體＞F1＞F2, 以上數(shù)據(jù)表明野生群體的遺傳多樣性高于2個(gè)選育世代,并且隨著選育的進(jìn)行, F2代選育群體的遺傳多樣性低于F1代選育群體, 2個(gè)選育世代的遺傳多樣性較野生群體下降的較為明顯, 這類現(xiàn)象在其他研究中也曾發(fā)生過, Eric等[18]發(fā)現(xiàn)在大西洋鮭(Salmo salar)選育過程中, 其第一代選育群體的遺傳多樣性下降的較為明顯, 其推測原因可能為參與繁育的親本數(shù)目較少所導(dǎo)致的, 頡曉勇等[19]對(duì)吉富品系尼羅羅非魚(Oreochromis niloticus)不同世代選育群體D-loop序列進(jìn)行測定和分析, 發(fā)現(xiàn)隨著選育的發(fā)展,選育群體遺傳多樣性逐步降低, 基礎(chǔ)群體和選育群體的遺傳距離逐步增大, 趙廣泰等[20]利用微衛(wèi)星標(biāo)記對(duì)大黃魚(Larimichthys crocea)4個(gè)選育群體進(jìn)行了遺傳變異分析, 結(jié)果表明, 連續(xù)四代的選育, 選育群體的遺傳基礎(chǔ)逐步純化, 遺傳多樣性逐步下降。本文通過2代選育群體遺傳變異的分析, 發(fā)現(xiàn)其遺傳多樣性下降地較為明顯, 推測原因可能有以下幾點(diǎn):

表 2 草魚線粒體DNA控制區(qū)(D-loop)遺傳多樣性參數(shù)Tab. 2 Genetic diversity parameters of mt DNA D-loop region in grass carp

表 3 草魚6個(gè)群體單倍型分布情況Tab. 3 Distribution of the haplotypes among six grass carp populations

首先, 選育方案中各世代參與的親本數(shù)較少,有研究表明, 當(dāng)群體有效親本數(shù)量小于100時(shí), 會(huì)導(dǎo)致遺傳漂變的加劇, 降低群體的遺傳多樣性[21—23];其二, 有學(xué)者指出, 后代群體遺傳多樣性的下降不僅和有限的親本數(shù)有關(guān), 親本隨機(jī)交配這種交配方案本身會(huì)造成后代各家系數(shù)目的不均衡[24], Fu等[12]也發(fā)現(xiàn)草魚存在后代各家系數(shù)目比例失衡的問題,究其原因, Dewoody和Avise[25]認(rèn)為雄性之間在繁育時(shí)具有競爭性會(huì)導(dǎo)致個(gè)別雄性后代個(gè)數(shù)的增加, 而且研究表明個(gè)頭越大, 體重越重, 肥滿度越高的個(gè)體在競爭時(shí)更具有優(yōu)勢, 往往后代越多[26—28], 以上觀點(diǎn)可以從邏輯上解釋在一個(gè)密閉環(huán)境進(jìn)行隨機(jī)交配會(huì)發(fā)現(xiàn)后代各家系數(shù)目不均衡的現(xiàn)象, 并且隨機(jī)交配的交配方案對(duì)于后代各家系數(shù)目不均衡的這種現(xiàn)象在其他物種中也曾發(fā)現(xiàn)過[24,28,29]。在本實(shí)驗(yàn)中, 我們推測在親本繁殖過程中, 由于隨機(jī)交配的交配方式, 親本群體的有效群體數(shù)目下降得較為明顯, 導(dǎo)致遺傳漂變的發(fā)生, 遺傳漂變的發(fā)生進(jìn)而會(huì)導(dǎo)致后代群體遺傳多樣性的下降[30], 并且隨著選育的進(jìn)程這種現(xiàn)象越發(fā)明顯; 其三, 有研究發(fā)現(xiàn),較強(qiáng)的人工選擇會(huì)導(dǎo)致后代遺傳多樣性的下降[31],本選育方案中只有較理想的個(gè)體(體重較高)會(huì)被選擇當(dāng)做候選親本, 其他不理想的個(gè)體將會(huì)被淘汰掉,而這種較高強(qiáng)度的選擇壓力可能會(huì)影響后代群體的遺傳多樣性; 其四, 本實(shí)驗(yàn)繁育的子代是在養(yǎng)殖桶內(nèi)隨機(jī)采集的樣品, 有研究表明不同的飼養(yǎng)環(huán)境對(duì)于后代群體的遺傳多樣性也具有影響[32], 在養(yǎng)殖桶內(nèi)開始養(yǎng)殖由于缺乏養(yǎng)殖經(jīng)驗(yàn), 魚苗早期成活率不高, 推測可能由于養(yǎng)殖桶內(nèi)早期惡劣的生存環(huán)境導(dǎo)致群體經(jīng)歷了瓶頸效應(yīng), 只有適應(yīng)力強(qiáng)的家系和個(gè)體保存了下來, 以此降低了后代群體的遺傳多樣性; 其五, 線粒體DNA具有母系無性遺傳特點(diǎn), 對(duì)于遺傳漂變的影響會(huì)更為敏感, 因此不排除利用線粒體DNA部分片斷分析群體遺傳漂變現(xiàn)象過分夸大的可能性[33], 其他學(xué)者也指出, 當(dāng)對(duì)一個(gè)物種運(yùn)用不同的標(biāo)記進(jìn)行遺傳多樣性分析時(shí), 可能會(huì)產(chǎn)生不同的結(jié)果, 因此我們認(rèn)為有必要在今后運(yùn)用不同的分子標(biāo)記對(duì)后代群體的遺傳多樣性進(jìn)行進(jìn)一步的分析, 以檢驗(yàn)當(dāng)前線粒體DNA部分片斷分析時(shí)得出的結(jié)果[34]。

表 4 草魚6個(gè)群體間遺傳分化Fst值Tab. 4 Genetic differentiation Fstvalues among six populations of grass carp

表 5 草魚6個(gè)群體間遺傳差異的分子方差分析(AMOVA)Tab. 5 Analysis of molecular variance (AMOVA) of six populations of grass carp

圖 1 基于Kimura 2-Parameter模型構(gòu)建的線粒體控制區(qū)序列的NJ聚類Fig. 1 The NJ clustering diagram of the mitochondrial control region sequences constructed based on Kimura 2-Parameter model

本研究發(fā)現(xiàn)單倍型多樣性(Hd)參數(shù)在群體間的變化趨勢與上述遺傳多樣性參數(shù)變化趨勢有所不同, 表現(xiàn)為野生群體＞F2＞F1, F2代群體的核苷酸多樣性(π)和平均核苷酸差異數(shù)(K)雖小于F1代群體,但單倍型多樣性(Hd)高于F1代群體, 這種現(xiàn)象在其余物種中也曾發(fā)現(xiàn)過[35,36]。這可能是因?yàn)闃O少量的堿基突變就會(huì)導(dǎo)致單倍型數(shù)目的增長, 而核苷酸多樣性的增長是需要時(shí)間的積累所影響的[37]。本研究發(fā)現(xiàn)F2代選育群體的單倍型多樣性(Hd)大于F1代選育群體, 但由于各個(gè)單倍型之間的序列差異不大, 所以其核苷酸多樣性(π)會(huì)相對(duì)較小, 那么就會(huì)導(dǎo)致單倍型多樣性(Hd)和其他遺傳多樣性參數(shù)變化趨勢不一致的現(xiàn)象, 但終歸來看, 我們可以認(rèn)為隨著選育的進(jìn)程, 選育世代(F1代和F2代)的遺傳多樣性下降的較為明顯, 且F2代群體的遺傳多樣性低于F1代。

圖 2 基于mt DNA控制區(qū)構(gòu)建的草魚單倍型網(wǎng)絡(luò)關(guān)系圖Fig. 2 The haploid types network diagram constructed based on mt DNA D-loop of grass carp

3.2 草魚野生與選育群體的遺傳結(jié)構(gòu)分析

根據(jù)Wright[38]關(guān)于遺傳分化程度的理論認(rèn)為Fst值在0—0.05表示低度遺傳分化, Fst值在0.05—0.15表示中度遺傳分化, Fst在0.15—0.25表示遺傳分化比較大。遺傳分化分析發(fā)現(xiàn)F1代與F2代群體之間Fst值為0.05741, 結(jié)果表明選育群體之間存在較小的遺傳分化, 邗江、九江和吳江3個(gè)野生群體與2個(gè)選育世代間的Fst在0.41475—0.55128, 表明這3個(gè)野生群體和2個(gè)選育世代間已發(fā)生了明顯的遺傳分化, 而石首群體與F1代群體的遺傳分化指數(shù)Fst值為0.04861, 與F2代群體的遺傳分化指數(shù)Fst值為0.13205, 結(jié)果表明石首群體和F1代選育群體間幾乎不存在明顯的遺傳分化, 而和F2代選育群體之間存在著中等水平的分化程度, 進(jìn)一步對(duì)6個(gè)群體進(jìn)行分子方差分析(AMOVA), 其中組間方差組分(Va)占總變異的38.11%, 組內(nèi)群體間的方差組分(Vb)占總變異的2.21%, 群體內(nèi)的方差組分(Vc)占總變異的59.69%, 遺傳分化指數(shù)(Fst)為0.40312, 且差異極顯著(P＜0.01), 結(jié)果表明石首群體、F1代、F2代群體和其余3個(gè)野生群體已發(fā)生了較高程度的遺傳分化, 而石首群體, F1代和F2代之間的遺傳分化不太明顯, 符合分析遺傳分化指數(shù)(Fst)得出的結(jié)果。

從單倍型分布角度來看, 邗江、九江和吳江3個(gè)野生群體與2個(gè)選育世代之間不存在共享單倍型, 石首群體與2個(gè)選育群體之間共享單倍型為一種(Hap15), 其結(jié)果也能從側(cè)面說明2個(gè)選育世代和邗江、九江、吳江這3個(gè)野生群體之間親緣關(guān)系較遠(yuǎn), 而和石首群體的親緣關(guān)系較近, 符合上述分析得出的結(jié)論。

從6個(gè)群體276個(gè)個(gè)體構(gòu)建的NJ系統(tǒng)發(fā)育樹角度來看, 系統(tǒng)發(fā)育樹基本被分成2大分支, 2個(gè)選育世代(F1代和F2代)與石首群體為一大分支, 邗江、九江、吳江群體為另一分支, 石首群體與2個(gè)選育世代(F1代和F2代)在系統(tǒng)發(fā)育樹上表現(xiàn)為相互交叉; 27種單倍型的單倍型網(wǎng)絡(luò)圖分析結(jié)果顯示, 4個(gè)野生群體以Hap1單倍型為中心呈發(fā)散狀態(tài)勢, 2個(gè)選育世代及石首群體以Hap15單倍型為中心呈發(fā)散狀態(tài)勢, 以上數(shù)據(jù)都能說明邗江、九江、吳江3個(gè)野生群體和2個(gè)選育世代(F1代和F2代)之間的親緣關(guān)系較遠(yuǎn), 而石首群體和2個(gè)選育世代之間的親緣關(guān)系較近, 符合上述分析得出的結(jié)果。

因此從總體來看, 2個(gè)選育世代與邗江、九江、吳江3個(gè)野生群體之間產(chǎn)生了較明顯的遺傳分化, 而石首群體和2個(gè)選育世代(F1代和F2代)兩兩之間存在著較小或中等水平的遺傳分化, 我們推測原因如下: 其一, 在親本交配繁殖過程中由于草魚本身存在后代各家系數(shù)目不均等問題[12], 因此可能發(fā)生少數(shù)親本的子代占據(jù)了大部分后代數(shù)目的現(xiàn)象, 這種遺傳漂變現(xiàn)象可能會(huì)導(dǎo)致2個(gè)選育世代與邗江、九江、吳江3個(gè)野生群體之間產(chǎn)生較明顯的遺傳分化, 而石首群體可能占據(jù)了這少數(shù)親本中的大多數(shù), 因此在檢測遺傳結(jié)構(gòu)時(shí), 石首群體和2個(gè)選育世代(F1代和F2代)之間并沒有存在較大的遺傳分化; 其二, 在養(yǎng)殖過程中可能由于管理不善, 惡劣的池塘環(huán)境導(dǎo)致后代經(jīng)歷了瓶頸效應(yīng), 群體數(shù)目的大量減少, 強(qiáng)行的加大了后代群體遺傳結(jié)構(gòu)的分化; 其三, 人工選擇在一定程度上可能改變了選育群體的遺傳結(jié)構(gòu), 使之往一個(gè)方向變化, 并逐步趨向穩(wěn)定, 而這種現(xiàn)象正是我們選擇育種想要看到的結(jié)果; 其四, 有研究發(fā)現(xiàn), mtDNA D-loop序列分析技術(shù)在檢測遺傳差異水平上可能具有更高的靈敏性[39], 因此不排除用mtDNA D-loop序列分析技術(shù)分析得出的遺傳分化指數(shù)(Fst)有過分夸大的可能性。

綜上所述, 經(jīng)過2個(gè)世代的人工選擇, 無論是從遺傳分化指數(shù)(Fst), NJ系統(tǒng)發(fā)育樹還是單倍型分析的角度來看, 其結(jié)果都表明選育群體的遺傳結(jié)構(gòu)已發(fā)生了改變, 說明我們的選育方案是有成效的, 但從另一個(gè)角度來看, 隨著選育的進(jìn)行, 其選育群體的遺傳多樣性下降地較為明顯, 因此這警示著我們?cè)诮窈蟮挠N過程中, 應(yīng)盡量保持較大的親本繁殖數(shù)量, 盡量避免隨機(jī)交配這種交配方案, 減少遺傳漂變的發(fā)生, 或者增加交配親本的組數(shù), 分配多組親本在不同的孵化環(huán)道封閉繁殖, 這樣既能保證讓不同的親本都參與到交配當(dāng)中去, 又能減少親本定向交配時(shí)對(duì)于魚體的物理損傷, 同時(shí)在幼苗培育時(shí)每組取相同的幼體合并培養(yǎng), 盡可能的使選育群體保持較高的遺傳多樣性[40]。本實(shí)驗(yàn)也反映了在育種過程中實(shí)時(shí)檢測和監(jiān)控后代遺傳多樣性的重要性, 啟示著我們?cè)诮窈蟮倪x育過程中應(yīng)及時(shí)運(yùn)用不同的分子標(biāo)記檢驗(yàn)和監(jiān)控選育群體遺傳多樣性和遺傳結(jié)構(gòu)的變化, 方可有利于今后進(jìn)一步的育種工作, 為接下來的選育工作打下堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。

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GENETIC VARIATION OF MITOCHONDRIAL DNA D-LOOP REGION IN WILD AND BREEDING POPULATIONS OF GRASS CARP

WANG Shen-Tong, ZHANG Meng, DANG Yun-Fei, LI Li-Sen, HUANG Wen-Ji, FANG Yuan, WANG Feng, SHEN Yu-Bang and LI Jia-Le
(Key Laboratory of Exploration and Utilization of Aquatic Genetic Resources, Ministry of Education, Shanghai Ocean University, Shanghai 201306, China)

To evaluate the genetic diversity and genetic structure of grass carp (Ctenopharyngodon idella), we analyzed the genetic variation of mitochondrial DNA D-loop region among four wild populations (Hanjiang, Jiujiang, Shishou, Wujiang) and two domesticated populations after two generations (F1 and F2) of selective breeding. The results showed that the wild populations had higher number of haplotype (H), haplotype diversity (Hd), nucleotide diversity (π) and average number of nucleotide differences (K) compared with the domesticated populations. Between the bred populations, F1 generation was higher than F2 generation in the aspects of nucleotide diversity (π) and average number of nucleotide differences (K), but haplotype diversity (Hd) in F1 generation was lower than F2 generation. Haplotype analysis showed that all six populations did not share a haplotype. By contrast, the four wild populations shared two haplotypes (Hap1 and Hap3). The Shishou population and two domesticated populations shared one haplotype (Hap15). Genetic differentiation index (Fst) analysis showed that there was great genetic differences between wild (Hanjiang, Jiujiang, Wujiang) and domesticated populations (range Fstfrom were 0.41475 to 0.55128). Genetically, Shishou population was closely related with F1 population, but its relationship with F2 was only moderate. Moreover, the genetic differentiation level between two breeding populations was small (Fst=0.05741). The analysis of neighbor-joining phylogenetic trees based on 276 individuals among six populations and haplotype network graph based on 27 haplotypes indicated the wild populations (Hanjiang, Jiujiang, Wujiang) had a distant relationship with those domesticated populations. Although Shishou population and two breeding populations were more closely related. The above results showed that among the two domesticated populations, the genetic structure has already changed after two generations of selective breeding, and the genetic diversity also decreased with the development of the breeding program. The results also urge us that the current breeding strategy should be improved in order to maintain the genetic diversity of the breeding populations and reduce the risk of inbreeding.

Grass carp; Breeding population; Wild population; mt DNA; D-loop; Genetic variation

Q349+.1

A

1000-3207(2017)05-0947-09

10.7541/2017.118

2016-11-07;

2017-04-25

現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系(CARS-46-04); 上海市工程中心提升項(xiàng)目(16DZ2281200); 通威產(chǎn)學(xué)研項(xiàng)目(TW2014F003)資助[Supported by the the China’s Agricultural Research System (CARS-46-04); the Project of Shanghai Engineering and Technology Center for Promoting Ability (16DZ2281200); Tongwei Industry-university-research Project (TW2014F003)]

王沈同(1993—), 男, 山東青島人; 碩士; 研究方向?yàn)樗a(chǎn)動(dòng)物種質(zhì)資源與遺傳育種。E-mail: 2317011197@qq.com

李家樂, 教授, 博士生導(dǎo)師; 研究方向?yàn)樗a(chǎn)動(dòng)物種質(zhì)資源與遺傳育種。E-mail: jlli2009@126.com