楊雅楠

（河北省廊坊市第四人民醫(yī)院，河北 廊坊 065700）

大蒜素對慢性腎衰大鼠腎組織細胞凋亡的抑制作用與機制研究*

楊雅楠

（河北省廊坊市第四人民醫(yī)院，河北 廊坊 065700）

目的 觀察大蒜素對慢性腎衰（CRF）大鼠腎臟組織細胞凋亡的影響并初探其機制。方法 100只實驗用大鼠隨機分為正常對照組、模型對照組、大蒜素［5、10、20 mg/（kg·d）］組，采用腺嘌呤溶液［250 mg/（kg·d）］灌胃21 d的方法建立CRF大鼠模型，大蒜素［5、10、20 mg/（kg·d）］組腹腔注射給藥治療，療程28 d。測定24 h尿量、24 h尿蛋白量及血清腎功能指標（BUN、SCr、UA含量），H&E染色法觀察腎臟組織病理變化；TUNEL染色法觀察腎臟組織細胞凋亡狀況，Western blotting法檢測Bcl-2、Bax、NF-кB表達并進行半定量分析，化學(xué)比色法檢測腎臟組織抗氧化酶活性和丙二醛（MDA）含量。結(jié)果 與模型對照組比較，大蒜素10、20 mg/（kg·d）組24 h尿量顯著減少，24 h尿蛋白量顯著降低（P<0.05或P<0.01），血清BUN、SCr、UA含量顯著降低（P< 0.05或P<0.01）；經(jīng)大蒜素治療28 d能夠明顯改善CRF大鼠腎臟組織病變及細胞凋亡狀況，大蒜素10、20 mg/（kg·d）組凋亡指數(shù)（AI）顯著降低（P<0.01），Bcl-2蛋白表達顯著上調(diào)、Bax顯著下調(diào)且Bcl-2/Bax表達比值顯著升高（P<0.05或P<0.01），NF-κB表達顯著下調(diào)（P<0.05或P<0.01），抗氧化酶［超氧化物歧化酶（SOD）］活性顯著升高且MDA含量顯著降低（P<0.05或P<0.01），其中大蒜素20 mg/（kg·d）組過氧化氫酶（CAT）活性顯著升高（P<0.05）。結(jié)論 大蒜素可能通過抑制腎臟組織細胞凋亡而對CRF大鼠起到一定的保護作用，可能與其調(diào)節(jié)凋亡相關(guān)蛋白表達及抑制氧化應(yīng)激損傷有關(guān)。

大蒜素 慢性腎衰 腎臟組織 細胞凋亡 NF-κB

大蒜素是一種具有抗氧化、抗凋亡、抑制炎癥反應(yīng)等多種生物學(xué)活性的二烯丙基三硫化物［1-2］，既往研究發(fā)現(xiàn)大蒜素通過抑制細胞凋亡而對糖尿病腎病和腎缺血再灌注損傷均具有一定的保護作用［3-4］，但大蒜素是否對CRF大鼠腎臟組織細胞凋亡是否具有抑制作用尚未見文獻報道。本研究通過制備CRF大鼠模型并給予大蒜素進行干預(yù)治療，觀察大蒜素對CRF大鼠腎臟組織細胞凋亡的影響，并探討其機制。現(xiàn)報告如下。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 SD大鼠，清潔級，雄性，體質(zhì)量180～220 g，河北省實驗動物中心提供，許可證號：SCXK（冀）2013-1-003。

1.2 試藥與儀器 大蒜素注射液（黑龍江江世藥業(yè)有限公司，規(guī)格：2 mL∶30 mg）；H＆E、TUNEL試劑盒和SOD、CAT、MDA試劑盒 （北京博奧森生物技術(shù)有限公司）；BUN、SCr、UA試劑盒 （深圳邁瑞生物醫(yī)療電子股份有限公司）；Bcl-2、Bax、NF-κB多克隆抗體（上海碧云天生物技術(shù)有限公司）；腺嘌呤（國藥集團化學(xué)試劑有限公司）。

1.3 分組與造模 100只實驗用大鼠隨機分為正常對照組、模型對照組、大蒜素（5、10、20 mg/kg）組，每組20只。參照杜卉蓮等［5］研究報道的實驗方法制備CRF大鼠模型：25%腺嘌呤溶液［250 mg/（kg·d）］連續(xù)灌胃21 d制備CRF大鼠模型，正常對照組正常飲食與飲水。

1.4 給藥方法 造模完成后，大蒜素組按5、10、20mg/（kg·d）腹腔注射治療大蒜素，正常對照組與模型對照組腹腔注射0.9%氯化鈉注射液，療程28 d。

1.5 標本采集與檢測 1）收集24 h尿量并通過生化分析儀測定24 h尿蛋白量。2）血清腎功能指標檢測：腹主動脈取血（不做抗凝處理），離心取血清，通過生化分析儀測定血清BUN、SCr、UA含量。3）腎臟組織病變和細胞凋亡的觀察：取稱量后左側(cè)腎臟置于4%多聚甲醛溶液固定72 h，然后行石蠟包埋、切片、展片和脫蠟水化處理，行常規(guī)HE染色后通過倒置光學(xué)顯微鏡觀察腎臟組織形態(tài)結(jié)構(gòu)變化；行TUNEL染色觀察腎臟細胞凋亡狀況，每張圖片隨機選取互不重疊的5個視野并分別計數(shù)細胞總數(shù)和凋亡細胞數(shù)，然后計算凋亡指數(shù)（AI），AI（%）＝（凋亡細胞數(shù)/細胞總數(shù)）×100%。4）Western blotting法檢測凋亡相關(guān)蛋白：取右側(cè)腎臟組織，加入適量冷裂解液后行研磨勻漿，離心（12000 r/min，10 min）取上清液，沸水浴5 min行蛋白變性，行電泳、轉(zhuǎn)膜、麗春紅染色、5%脫脂奶粉封閉2 h后，一抗（1∶500）Bcl-2、Bax、NF-κB、β-actin恒溫4℃過夜；洗膜3次后二抗（1∶100）室溫震蕩孵育1 h后經(jīng)ECL顯色；然后以β-actin為內(nèi)參，以條帶灰度值半定量分析腦組織Bcl-2、Bax、NF-κB表達并計算Bax/Bcl-2比值。5）腎臟組織抗氧化酶活性和MDA含量測定：取右側(cè)腎臟、加入適量冷裂解液行研磨勻漿，離心（3000 r/min，10 min）取上清液，按試劑盒說明通過化學(xué)比色法測定腎臟組織SOD、CAT活性和MDA含量。

1.6 統(tǒng)計學(xué)處理 應(yīng)用SPSS13.0統(tǒng)計軟件。計量資料以（±s）表示，組間兩兩比較采用t檢驗，計數(shù)資料采用χ2檢驗。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠24 h尿量、24 h尿蛋白量的比較 見表1。與正常對照組比較，模型對照組大鼠24 h尿量顯著增加，24 h尿蛋白量顯著升高（P<0.01）。經(jīng)大蒜素［10、20 mg/（kg·d）］治療28 d能夠顯著降低CRF大鼠24 h尿量和24 h尿蛋白量（P<0.05或P<0.01）。

表1 各組大鼠24 h尿量、24 h尿蛋白量、體質(zhì)量、腎臟指數(shù)比較（±s）

表1 各組大鼠24 h尿量、24 h尿蛋白量、體質(zhì)量、腎臟指數(shù)比較（±s）

與正常對照組比較，**P＜0.01；與模型對照組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01。下同。

24 h尿量（mL）24 h尿蛋白量（mg） 體質(zhì)量（g） 腎臟指數(shù)（×10-3）10.50±2.80 5.40±1.60 311.50±34.20 3.90±0.60 38.70±6.90**36.10±7.80**208.30±31.70**17.30±2.10**35.60±7.10 32.00±7.40 215.40±28.60 15.80±1.90大蒜素10 mg/（kg·d）組 20 31.40±5.80△18.40±4.90△△223.50±29.00 13.20±1.60△△大蒜素20 mg/（kg·d）組 20 27.20±5.30△△11.50±3.30△△241.70±28.20△10.30±1.20△△組別 n正常對照組 20模型對照組 20大蒜素5 mg/（kg·d）組 20

2.2 各組大鼠體質(zhì)量、腎臟指數(shù)的比較 見表1。與正常對照組比較，模型對照組大鼠體質(zhì)量和腎臟指數(shù)均顯著升高（P<0.01）；經(jīng)大蒜素［10、20 mg/（kg·d）］治療28 d能夠顯著升高體質(zhì)量（P<0.05），顯著降低腎臟指數(shù)（P<0.01）。

2.3 各組大鼠血清腎功能指標的比較 見表2。與正常對照組比較，模型對照組大鼠血清腎功能監(jiān)測指標（BUN、SCr、UA含量）顯著升高（P<0.01）；經(jīng)大蒜素［10、20 mg/（kg·d）］治療28 d能夠顯著降低各腎功能監(jiān)測指標（P<0.05或P<0.01）。

表2 各組大鼠血清腎功能監(jiān)測指標比較（±s）

表2 各組大鼠血清腎功能監(jiān)測指標比較（±s）

組別 n正常對照組 20模型對照組 20大蒜素5 mg/（kg·d）組 20 BUN（mmol/L）SCr（μmol/L） UA（mmol/L）5.90±1.40 70.20±9.30 65.70±9.80 24.40±3.80**136.10±35.00**113.20±17.50**19.70±4.20 127.30±36.80 99.10±23.00大蒜素10 mg/（kg·d）組 20 14.50±2.90△△115.70±27.40△83.60±16.40大蒜素20 mg/（kg·d）組 20 11.60±2.50△△106.50±24.30△78.20±13.90△

2.4 各組大鼠腎臟組織病變的比較 見圖1。觀察各組大鼠腎臟HE染色病理切片：正常對照組大鼠腎小球、腎小管及間質(zhì)區(qū)組織結(jié)構(gòu)和細胞形態(tài)均未見異常；模型對照組呈現(xiàn)腎小球變性、數(shù)量減少、球囊粘連、囊腔和管腔擴大，腎小管內(nèi)結(jié)晶、壞死出可見大量炎癥細胞和少量中性粒細胞浸潤；與模型對照組比較，經(jīng)大蒜素［5、10、20 mg/（kg·d）］治療28 d能夠明顯改善CRF大鼠腎臟組織病變，以20 mg/（kg·d）組最為顯著。

圖1 各組大鼠腎臟組織病變（HE染色，400倍）

2.5 各組大鼠腎臟組織細胞凋亡情況比較 見圖2。觀察各組大鼠腎臟TUNEL染色切片：正常對照組大鼠腎臟組織凋亡細胞檢出率極低；模型對照組凋亡細胞數(shù)量較正常對照組明顯增多，腎小管和腎小球均有凋亡細胞檢出；經(jīng)5、10、20 mg/（kg·d）大蒜素治療28 d能夠明顯減少CRF大鼠凋亡細胞數(shù)量，以20 mg/（kg·d）組最為顯著。比較各組細胞AI，模型對照組AI［（67.4± 19.3）%］較正常對照組AI［（3.2±1.4）%］顯著升高（P< 0.01），大蒜素［5、10、20 mg/（kg·d）］組AI分別為（53.6± 17.5）%、（33.4±10.8）%、（17.2±5.3）%，其中大蒜素［10、20 mg/（kg·d）］組AI較模型對照組顯著降低（P<0.01）。

圖2 各組大鼠腎臟組織細胞凋亡（TUNEL，400倍）

2.6 各組大鼠腎臟組織Bcl-2、Bax、NF-κB表達的比較 見圖3，表3。與正常對照組比較，模型對照組大鼠Bcl-2、Bax、NF-κB表達表達顯著上調(diào) （P<0.05或P< 0.01）；經(jīng)大蒜素［10、20 mg/（kg·d）］治療28 d能夠顯著上調(diào)CRF大鼠腎臟組織Bcl-2表達并下調(diào)Bax、NF-κB表達（P<0.05或P<0.01），提高Bax/bcl-2比值（P<0.01）。

圖3 各組大鼠腎臟組織Bcl-2、Bax、NF-κB表達（Western blotting）

表3 各組大鼠腎臟組織Bcl-2、Bax、NF-κB表達比較（±s）

組別 n正常對照組 20模型對照組 20大蒜素5 mg/（kg·d）組 20 Bcl-2 Bax Bcl-2/Bax NF-κB 0.27±0.08 0.18±0.06 1.50±0.30 0.11±0.04 0.42±0.09*0.76±0.28**0.60±0.20 0.53±0.17**0.46±0.13 0.63±0.22 0.80±0.30 0.46±0.20大蒜素10 mg/（kg·d）組 20 0.57±0.19△0.45±0.17△△1.30±0.40△△0.40±0.15△大蒜素20 mg/（kg·d）組 20 0.72±0.26△△0.28±0.13△△2.60±0.90△△0.27±0.08△△

2.7 各組大鼠腎臟組織抗氧化酶活性和MDA含量的比較 見表4。與正常對照組比較，模型對照組大鼠抗氧化酶活性顯著降低且MDA含量顯著升高（P<0.01）；經(jīng)大蒜素［10、20 mg/（kg·d）］治療28 d能夠顯著升高CRF大鼠SOD活性并降低MDA含量（P<0.05或P<0.01），經(jīng)20 mg/（kg·d）治療能夠顯著升高CAT活性（P<0.01）。

表4 各組大鼠腎臟組織抗氧化酶活性和MDA含量比較（±s）

組別 n正常對照組 20模型對照組 20大蒜素5 mg/（kg·d）組 20 SOD（U/mg）CAT（U/mg）MDA（nmol/mg）13.10±1.80 2.50±0.60 4.60±1.10 6.40±1.00**1.20±0.40**15.20±2.30**7.10±1.30 1.50±0.30 13.00±2.70大蒜素10 mg/（kg·d）組 20 8.90±1.50△1.60±0.40 8.10±1.60△△大蒜素20 mg/（kg·d）組 20 11.20±1.60△△1.90±0.60△△6.30±1.20△△

3 討 論

CRF是各種腎臟疾?。–KD）終末期的共同表現(xiàn)，病程不可逆且進行性加重［6］，目前尚無法治愈，臨床上主要采取透析、降脂、抗聚、抗凝等治療措施以緩解CRF癥狀并延緩病情發(fā)展［7-8］，因此CRF一直是醫(yī)藥研究者關(guān)注的熱點與難點。近年來，病理生理學(xué)研究發(fā)現(xiàn)繼發(fā)性腎組織細胞凋亡是CRF病情進展的重要病理通路［9］。

大蒜素是一種具有抗凋亡等多種生物學(xué)活性的二烯丙基三硫化物［1-2］。本研究發(fā)現(xiàn)大蒜素治療28 d能夠有效減少CRF大鼠排尿量并降低尿蛋白量，降低血清BUN、SCr、UA含量，抑制CRF大鼠腎臟組織病變，提示大蒜素對CRF大鼠腎臟具有一定的保護作用。

細胞凋亡是一種由多種基因參與調(diào)控的細胞程序化死亡過程，其中B細胞淋巴瘤/Bcl-2為抑凋亡基因，而Bcl-2相關(guān)Bax為促凋亡基因，二者間相互作用、共同參與調(diào)控細胞凋亡過程［10］；Bcl-2不僅對線粒體損傷具有直接的保護作用，還間接抑制促凋亡調(diào)控蛋白Caspase-3激活［11］、抑制Bax細胞毒性作用，從而表現(xiàn)出對細胞凋亡的抑制作用［12］；Bax能夠破壞線粒體滲透性而導(dǎo)致細胞色素C釋放增加、激活Caspase-9，表現(xiàn)出對細胞凋亡的促進作用；因此Bax/Bcl-2值更加能夠體現(xiàn) Bax和 Bcl-2對細胞凋亡的調(diào)控作用［13］。NF-κB是一種多效能核轉(zhuǎn)錄因子。Zhang Q等［14］研究發(fā)現(xiàn)，活化的NF-κB能夠促進巨噬細胞活化和浸潤，誘導(dǎo)促凋亡信號釋放而導(dǎo)致細胞凋亡；但是常態(tài)下NF-κB存于細胞質(zhì)中且無活性，當(dāng)NF-κB受到氧自由基（ROS）攻擊時，NF-κB將被活化并暴露出核定位信號而進入胞核內(nèi)，促進基因轉(zhuǎn)錄并誘導(dǎo)細胞凋亡；此外，活化的NF-κB蛋白還能夠促進巨噬細胞活化和浸潤、誘導(dǎo)促凋亡信號釋放而導(dǎo)致細胞凋亡。機體組織抗氧化酶活性降低是導(dǎo)致氧自由基（ROS）過剩的主要原因，腎臟組織超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化氫酶（CAT）含量豐富，是清除ROS而抑制氧化應(yīng)激損傷的重要屏障［15］。韓海燕等研究發(fā)現(xiàn)抗氧化酶活性降低將導(dǎo)致ROS蓄積而引發(fā)脂質(zhì)過氧化損傷，MDA含量升高［16］。本研究發(fā)現(xiàn)，大蒜素治療28 d能夠有效改善CRF大鼠腎臟組織凋亡狀況，能夠顯著上調(diào)腎臟組織Bcl-2表達、下調(diào)Bax表達而顯著提高Bcl-2/Bax表達比值，顯著降低NF-κB表達，明顯改善抗氧化酶活性、降低氧化應(yīng)激損傷。

綜上所述，大蒜素能夠有效改善CRF大鼠腎功能、抑制腎臟組織病變、抑制細胞凋亡、上調(diào)Bcl-2表達、下調(diào)Bax和NF-κB表達、提高Bcl-2/Bax表達比值、改善抗氧化酶活性、降低氧化應(yīng)激損傷，提示大蒜素可能通過抑制細胞凋亡而對CRF大鼠起到一定的保護作用，其機制可能與大蒜素能夠調(diào)節(jié)凋亡相關(guān)蛋白表達及抑制氧化應(yīng)激損傷有關(guān)。

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Inhibitory Effect and Mechanism of Allicin on Apoptosis of Renal Tissue in Rats with Chronic Renal Failure

YANG Yanan.The Fourth People′s Hospital of Langfang，Hebei，Langfang 065700，China.

Objective：To study the effect of allicin on the apoptosis of renal tissue in chronic renal failure（CRF）rats and to explore its mechanism.Methods：100 rats were randomly divided into the normal control group，the model control group and allicin［5，10，20 mg/（kg·d）］groups.The CRF rat model was established by intragastric administration with adenine solution［250 mg/（kg·d）］for 21 days，and then intraperitoneal injection of allicin［5，10，20 mg/（kg·d）］for 28 d.24 h urine volume，24 h urinary protein volume and serum renal function indexes（BUN，SCr and UA）were measured.Pathological changes of kidney were observed by H&E staining，and the apoptosis of renal tissue was observed by TUNEL staining.Western blotting was used to detect the expression of Bcl-2，Bax and NF-кB.Semi-quantitative analysis was carried out，and the activities of antioxidant enzymes and malondialdehyde（MDA）in kidney tissues were detected by chemical colorimetry.Results：Compared with the model group，the 24 h urine output and 24 h urinary protein in allicin［10，20 mg/（kg·d）］groups reduced significantly（P<0.05 or P<0.01）；the content of BUN，SCr，UA in serum reduced significantly（P<0.05 or P< 0.01）.Allicin treatment for 28 days could obviously improve the pathological changes and apoptosis of kidney tissue in CRF rats.The poptosis index（AI）decreased significantly in allicin［10，20 mg/（kg·d）］groups（P<0.01）；the expression of Bcl-2 increased significantly；the expression of Bax decreased significantly and the Bcl-2/Bax increased significantly（P<0.05 or P<0.01）；the expression of NF-кB decreased significantly（P<0.05 or P< 0.01）；the activities of antioxidant enzymes（SOD）increased significantly in the kidney tissues and the content of MDA decreased significantly（P<0.05 or P<0.01），and the activities of catalase（CAT）increased significantly in 20 mg/kg·d group（P<0.05）.Conclusion：Allicin may play a protective role in CRF rats by inhibiting the apoptosis of renal tissue，which may be related to regulating the expression of apoptosis related proteins and inhibitingoxidative stress damage.

Allicin；Chronic renal failure；Renal tissue；Apoptosis；NF-κB

R285.5

A

1004-745X（2017）08-1364-04

10.3969/j.issn.1004-745X.2017.08.015

2017-04-23）

河北省廊坊市科技支撐計劃項目（2016013136）