鐘望濤陳建雅方健斌彭堯群劉思序李友崔理立趙斌

·論 著·

基質(zhì)金屬蛋白酶-9基因多態(tài)性與缺血性腦卒中的相關(guān)性☆

鐘望濤*陳建雅*方健斌*彭堯群*劉思序*李友**崔理立**趙斌**

目的探討基質(zhì)金屬蛋白酶-9（matrix metalloproteinases-9,MMP-9）基因多態(tài)性與缺血性腦卒中的相關(guān)性。方法運(yùn)用多重小測(cè)序技術(shù)（multiplex SNaPshot）分析粵西地區(qū)251例缺血性腦卒中患者和96例健康對(duì)照組MMP-9基因（rs3787268、rs3918241、rs3918242）的多態(tài)性分布，并分析與缺血性腦卒中的相關(guān)性。結(jié)果①與對(duì)照組相比，病例組rs3787268基因型頻率有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P=0.042），在隱性模型中A/A基因型的個(gè)體患病風(fēng)險(xiǎn)升高（OR=2.21，P=0.046）；②rs3918242基因型頻率亦有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P=0.007），在顯性模型中，攜帶T基因型的個(gè)體患病風(fēng)險(xiǎn)升高（OR=2.14，P=0.009）；③其中rs3787268在大動(dòng)脈粥樣硬化（large artery atherosclerosis，LAA）亞型組的基因型分布與對(duì)照組相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P=0.039），而非LAA亞型中無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；rs3918242在LAA亞型組的基因型和等位基因頻率與對(duì)照組相比分別有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P=0.009，P=0.047），在非LAA亞型中無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。結(jié)論MMP-9基因rs3787268和rs3918242多態(tài)位點(diǎn)突變可能與中國(guó)粵西地區(qū)漢族人群缺血性腦卒中的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)；并主要可能增加了LAA型腦卒中的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)。

基質(zhì)金屬蛋白酶-9動(dòng)脈粥樣硬化 缺血性腦卒中 單核苷酸多態(tài)性

動(dòng)脈粥樣硬化（atherosclerosis，AS）是以進(jìn)行性脂質(zhì)沉積、纖維組織增生和炎性細(xì)胞浸潤(rùn)為特征的累及全身大、中型彈性和肌性動(dòng)脈的慢性疾病，是導(dǎo)致冠心病、腦梗死、腹主動(dòng)脈瘤等疾病的共同病理基礎(chǔ)[1]。近年來發(fā)現(xiàn)，基質(zhì)金屬蛋白酶（matrix metalloproteinases,MMPs）參與了AS形成機(jī)制中的細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix,ECM)降解及重構(gòu)。RAO等[2]發(fā)現(xiàn)，MMP-9 mRNA在頸動(dòng)脈斑塊平滑肌細(xì)胞中表達(dá)明顯增多。ZHANG[3]研究表明MMP-9的基因啟動(dòng)子區(qū)SNP（rs3918242）可以調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄，多個(gè)SNP如rs17576、rs3918241與AS密切相關(guān)[4]。但少見與腦卒中的相關(guān)性研究報(bào)告，基因連鎖分析顯示（rs3787268、rs3918241、rs3918242）3位點(diǎn)共存于啟動(dòng)子連鎖區(qū)，因此我們?cè)?51例缺血性腦卒中患者和96例對(duì)照組中分析了3位點(diǎn)的基因多態(tài)性與缺血性腦卒中的相關(guān)性。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象廣東醫(yī)科大學(xué)醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)本研究計(jì)劃并獲得研究對(duì)象簽署知情同意書。選擇廣東醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科住院病房的患者251例（病例組）和96例（對(duì)照組）為研究對(duì)象，研究對(duì)象來源于粵西地區(qū)的漢族人群。①病例組：入組標(biāo)準(zhǔn)：a.符合缺血性腦卒中診斷標(biāo)準(zhǔn)[5]；b.經(jīng)磁共振成像和（或）CT確診為缺血性腦卒中；c.全部患者行腦血管造影（DSA）。排除標(biāo)準(zhǔn)：a.有冠心病與外周血管疾病病史；b.合并自身免疫疾病；c.合并嚴(yán)重感染性疾病；d.顱內(nèi)感染、癲癇等中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病；e.嚴(yán)重肝腎功能不全。②對(duì)照組：均來源于廣東醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科住院病房，經(jīng)頭顱MRA與頸部CTA/頸動(dòng)脈彩超等排除腦梗死與顱腦血管狹窄性疾病，排除冠心病、外周血管疾病、肝腎疾病、自身免疫性疾病、感染、惡性腫瘤等疾病患者。

1.2 研究方法

1.2.1 一般資料收集 本實(shí)驗(yàn)研究對(duì)象所收錄的信息包括：性別、年齡、總膽固醇（total cholesterol，CHOL）、甘油三酯(triglyceride，TG)、低密度脂蛋白(low density lipoprotein，LDL-C)、高密度脂蛋白( high density lipoprotein cholesterol，HDL-C)、空腹血糖、糖化血紅蛋白、吸煙、高血壓、同型半胱氨酸(homocysteine，HCY)等。

1.2.2 血標(biāo)本采集 使用 TIANamp Blood DNA Kit按說明方案從外周血提取DNA（北京天根生物工程有限公司）。

1.2.3 病例組分型 根據(jù)中國(guó)缺血性卒中亞型（Chinese ischemic stroke subclassification，CISS）[6]分類進(jìn)行分型：①大動(dòng)脈粥樣硬化 （large artery atherosclerosis，LAA）；②心源性卒中型（cardiogenic stroke，CS）；③穿支動(dòng)脈疾病 （penetrating artery disease，PAD）；④其他病因（other etiologies，OE）；⑤病因不確定（undetermined etiology，UE）。

1.3 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）

1.3.1 PCR引物設(shè)計(jì)：在線Primer3軟件設(shè)計(jì)多重PCR擴(kuò)增的上下游引物（rs3787268：ATCCTGGGC CATAGAGGATG/TCCTCACTCAGCCTCCCTTrs3918 241：TCGTGACTGCAAAGCAGATG/AATGAGACTG TGAGATGGAG；rs3918242：CCTCCCGAGTAGCTGG TAT/CCTGGTCAACGTAGTGAAAC）。

1.3.2 多重PCR反應(yīng)體系 1.0 μL DNA模板，2.0 μL 1 U HotStarTaq polymerase(Qiagen Inc.)，2.0 μL 0.3 mM dNTP，1.0 μL多重PCR引物，2.0 μL 3.0 mM Mg2+，2.0 μL 1X HotStarTaq buffer，總體積10.0 μL。

1.3.3 PCR循環(huán)條件及程序 95℃ 2 min 11個(gè)循環(huán) (94℃ 20 s,65℃ 5 s/每循環(huán)40 s,72℃ 1.5 min)；24個(gè)循環(huán)(94℃ 20 s,59℃ 30 s,72℃ 1.5 min)；72℃ 2 min；4℃ 保存。

1.3.4 所得產(chǎn)物純化 在15 μL PCR產(chǎn)物中加入5 U蝦堿酶（SAP）和2 U Exonuclease I酶，然后37℃溫浴1 h，再75℃滅活15 min。

1.4 SNaPshot SNP分型技術(shù)

1.4.1 引物延伸 利用在線Primer 3軟件設(shè)計(jì)單堿基延伸引物（rs3787268SR：TTTTTTTTTTTTTTTTTT TTTTTTTTTTAGAGGATGTCGCTTAAAAC；rs39182 41SR：TTTTTTTTTTTTTTTTTTTCAACTTTTCTGTAA AGGAAG；rs3918242SR：TTTTTTTTTTTTTTTTTTTT TTTTTTTTTTTTTTCGAGTAGCTGGTATTATAGGCG CGTACTTGT）。

1.4.2 延伸反應(yīng)體系包括 5.0 μL SNaPshot Multiplex Kit(ABI)，2.0 μL純化后多重PCR產(chǎn)物，1.0 μL延伸引物混合物，2.0 μL超純水。

1.4.3 循環(huán)程序 96℃1 min;28個(gè)循環(huán) (96℃10 s, 52℃5 s,60℃30 s);4℃保存。

1.4.4 延伸產(chǎn)物純化 在10 μL延伸產(chǎn)物中加入1U SAP酶，37℃溫浴1 h,然后75℃滅活15 min。

1.4.5 延伸產(chǎn)物上ABI3130XL測(cè)序儀 取0.5 μL純化后的延伸產(chǎn)物，與0.5μLLiz120SIZESTANDARD，9 μL Hi-Di混勻，95℃變性 5 min后上ABI3130XL測(cè)序儀。

1.4.6 ABI3130XL測(cè)序儀上收集的原始數(shù)據(jù)用GeneMapper 4.1 (AppliedBiosystems Co.Ltd.USA)來分析。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。臨床計(jì)量資料以(±s)表示，兩組間比較采用兩樣本的t檢驗(yàn)（數(shù)據(jù)符合正態(tài)分布），數(shù)據(jù)不符合正態(tài)分布的多組間比較采用Kruskal-Wallis秩和檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料以百分比表示，兩組間比較采用Pearson’s χ2檢驗(yàn)。χ2檢驗(yàn)比較各組間的基因型、等位基因頻率差異。Logistic回歸分析缺血性腦卒中相關(guān)危險(xiǎn)因素。使用Haploview 4.1軟件構(gòu)建單體型。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 臨床資料對(duì)比病例組的相關(guān)危險(xiǎn)因素如吸煙、高血壓、血糖、TG和HCY等與對(duì)照組相比，有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；HDL-C水平作為缺血性腦卒中保護(hù)因素則有意義地低于對(duì)照組；兩組的LDLC、CHOL水平無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（表1）。

2.2 MMP-9基因多態(tài)性分析缺血性腦卒中組與對(duì)照組 MMP-9基因的 rs3787268，rs3918241，rs3918242位點(diǎn)各基因型和等位基因頻率經(jīng)Hardy-Weinberg平衡檢驗(yàn)，所有基因型和等位基因分布均符合基因分析要求。病例組251例患者進(jìn)行亞組分析分類其中LAA組210例，PAD組31例，另外10例包括3例心源性卒中，4例不明原因卒中，3例其他病因卒中，因?yàn)樵诒窘M病例組中數(shù)量太少，亞組分析中予以省略。

rs3787268各基因型頻率與對(duì)照組相比有顯著性差異（P=0.042），而在隱性模型中，與G/G+G/ A基因型的個(gè)體相比，A/A基因型的個(gè)體患病風(fēng)險(xiǎn)升高（OR=2.21，P=0.046）（表2）。

與對(duì)照組相比rs3918242各基因型與等位基因頻率分別有顯著性差異（P=0.007，P=0.038）。而在顯性模型中，與C/C基因型的個(gè)體相比，攜帶T基因型的個(gè)體患病風(fēng)險(xiǎn)升高 （OR=2.14，P=0.009）（表3）。

rs3918241三種基因型頻率 (T/T、A/T、A/A)和等位基因頻率（T，A）與對(duì)照組比較差異無顯著性（表4）故未在缺血性腦卒中亞型中比較分析。

表1 病例組與對(duì)照組的臨床資料

表2 rs3787268 SNPs基因多態(tài)性與缺血性腦卒中及亞型相關(guān)性分析

2.3MMP-9基因的 SNPs單體型分析使用Haploview軟件對(duì)rs3787268，rs3918241，rs3918242位點(diǎn)進(jìn)行連鎖不平衡分析，計(jì)算連鎖不平衡系數(shù)D':0.14,r:0.002。以連鎖不平衡 （linkage disequilibrium，LD）系數(shù)D'＞0.8為強(qiáng)連鎖標(biāo)準(zhǔn)，結(jié)果表明三位點(diǎn)不存在連鎖不平衡，無法獲得有效的單倍體重構(gòu)。

2.4 Logistic回歸矯正危險(xiǎn)因素后分析在對(duì)缺血性腦卒中的相關(guān)的危險(xiǎn)因素如：年齡、性別、吸煙史、高血壓病史、血糖、糖化血紅蛋白、TG、CHOL、HDL-C、LDL-C、HCY、rs3787268、rs3918241 和rs3918242，采用逐步Logistic回歸法，按a入=0.05，а出=0.10原則，將上述入選的危險(xiǎn)因素引入多因素Logistic回歸模型。結(jié)果提示吸煙、高血壓、血糖、高HCY是缺血性腦卒中的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，s3787268、rs3918241和rs3918242并未顯示出有意義相關(guān)性。

2.5 MMP-9基因rs3787268、rs3918242與CISS亞型相關(guān)性分析根據(jù)CISS標(biāo)準(zhǔn)將缺血性腦卒中分型后，rs3787268多態(tài)在LAA亞型組的基因型分布與對(duì)照組相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P=0.039），同樣在隱性模型中，與G/G+G/A基因型的個(gè)體相比，A/A基因型的個(gè)體患病風(fēng)險(xiǎn)升高 （OR=3.47，P= 0.042）；等位基因頻率與對(duì)照組相比無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。而其他亞型的基因型、等位基因頻率與對(duì)照組比較均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，心源性卒中型（cardiogenic stroke，CS）與病因不確定型（undetermined etiology，UE）病例數(shù)太少未予列出（表2）。rs3918242多態(tài)在LAA亞型組的基因型、等位基因頻率與對(duì)照組相比分別均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P=0.009，P=0.047），而在顯性模型中，與C/C基因型的個(gè)體相比，攜帶T基因型的個(gè)體患病風(fēng)險(xiǎn)升高（OR=6.44，P=0.011）。而其他亞型的基因型分布、等位基因頻率與對(duì)照組比較均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（表3）。

3 討論

表3 rs3918242 SNPs基因多態(tài)性與缺血性腦卒中及亞型相關(guān)性分析

表4 rs3918241 SNPs基因多態(tài)性與缺血性腦卒中及亞型相關(guān)性分析

MMP-9主要參與細(xì)胞外基質(zhì) （ECM）的降解及重構(gòu)，對(duì)保持血管內(nèi)皮的穩(wěn)定性和完整性起著重要作用[7]。腦梗死發(fā)病時(shí)組織缺血缺氧作為一種信號(hào)刺激內(nèi)皮細(xì)胞、炎癥細(xì)胞、神經(jīng)元和膠質(zhì)細(xì)胞等激活MMPs系統(tǒng)，可致MMPs表達(dá)增加，尤其是MMP-9在缺血腦組織中明顯增高且與梗死體積相關(guān)[8-9]。ZHANG等[3]發(fā)現(xiàn)，rs3918242（-1562C/T）位點(diǎn)C→T后，產(chǎn)出低活性（C/C）和高活性（C/T、T/ T）的啟動(dòng)子基因型，而高活性型可致MMP-9表達(dá)增高。本研究顯示，缺血性腦卒中組rs3918242的各基因型頻率、等位基因頻率與對(duì)照組相比有顯著性差異，而在顯性模型中，與CC純合子相比，攜帶T基因型的個(gè)體患病風(fēng)險(xiǎn)顯著升高（OR= 2.14，P=0.009）；進(jìn)一步亦在LAA亞型中顯示出明顯相關(guān)性，提示rs3918242位點(diǎn)與大動(dòng)脈粥樣硬化型缺血性腦卒中遺傳易感性相關(guān)，與國(guó)內(nèi)其他研究報(bào)道相一致[10-11]。另一位點(diǎn)rs3787268位于內(nèi)含子區(qū)。本研究發(fā)現(xiàn)，缺血性腦卒中組rs3787268的各基因型頻率與對(duì)照組相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，進(jìn)一步在隱性模型中，與G/G+G/A基因型個(gè)體相比，A/A純合子患病風(fēng)險(xiǎn)升高 （OR=2.21，P=0.046），同樣在LAA亞型中這種趨勢(shì)更為明顯 （OR=3.47，P= 0.042），提示rs3787268多態(tài)亦與大動(dòng)脈粥樣硬化型缺血性腦卒中遺傳易感性相關(guān)。SNPs單體型分析發(fā)現(xiàn)三位點(diǎn)不存在連鎖不平衡，無法獲得有效的單倍體重構(gòu)；同時(shí)，多因素Logistic回歸模型結(jié)果提示吸煙、高血壓、血糖、高HCY仍是缺血性腦卒中傳統(tǒng)上的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，rs3787268、rs3918241和rs3918242并未顯示出有意義相關(guān)性，提示MMP-9基因可能只是一定程度上微弱增加了缺血性腦卒中的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)。本研究病例組患者全部經(jīng)DSA造影確認(rèn)并根據(jù)CISS分類進(jìn)行分型，發(fā)現(xiàn)rs3787268和rs3918242的陽性結(jié)果僅表現(xiàn)在LAA亞型中，提示兩者可能調(diào)控組織MMP-9表達(dá)并影響細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）降解及重構(gòu)，參與顱腦大動(dòng)脈粥樣硬化病理進(jìn)程，RAO等[2]發(fā)現(xiàn)證實(shí)這一假說，具體機(jī)制有待深入探索。另外盡管兩組人群存在明顯性別比例差異，但在性別分層比較后可以消除這一偏倚?？傊?，本研究進(jìn)一步證實(shí)MMP-9基因rs3787268和rs3918242多態(tài)位點(diǎn)與中國(guó)粵西地區(qū)漢族人群缺血性腦卒中的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)，并主要可能增加大動(dòng)脈粥樣硬化型腦卒中的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)。同時(shí)由于本研究局限于中國(guó)南方漢族人群，樣本量偏小，有必要擴(kuò)大樣本量或在其他種族人群中進(jìn)一步研究。

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An association study between matrix metalloproteinase-9 gene polymorphisms and ischemic stroke.

ZHONG Wangtao,CHEN Jianya,FANG Jianbin,PENG Yaoqun,LIU Sixu,LI You,CUI Lili,ZHAO Bin.The Affiliated Hospital of Guangdong Medical University,Zhanjiang,524001,China.Tel:0759-2387322.

ObjectiveObjective TO investigate the potential association between matrix metalloproteinase-9 (MMP-9)gene polymorphisms and risk of ischemic stroke in Western Guangdong population.MethodsThis hospitalbased case-control study recruited 251 patients with ischemic stroke and 96 controls.Using Multiplex SNaPshot method was used to detect the genotype of MMP-9 gene rs3787268、rs3918241 and rs3918242 polymorphisms.The association between MMP-9 gene polymorphisms and risk of ischemic stroke was analyzed.Results① There were significant differences in the genotype distribution of rs3787268 between ischemic stroke group and the controls(P= 0.042).In the recessive model,the individual risk of A/A genotype was higher(OR=2.21,P=0.046)than that of the G/G+G/A genotype.② Compared with the controls,the genotype and allele distribution of rs3918242 in the ischemic stroke group were significantly different(P=0.007,P=0.038).In the dominant model,the risk of individuals carrying the T genotype was significantly elevated(OR=2.14,P=0.009)compared with individuals with the C/C genotype.③The genotype distribution of rs3787268 polymorphisms in the LAA but not in no-LAA subgroup was significantly different from that in the controls (P=0.039).The genotype distribution and allele frequency of rs3918242polymorphisms in the LAA subgroup were significantly different from that of the control group (P=0.009,P=0.047). There was no significant difference in the genotype distribution and allele frequency between no-LAA subtype and the control group.ConclusionsThe MMP-9 gene rs3918242 and rs3787268 polymorphisms may be the risk factors of ischemic stroke in Han population in the western part of Guangdong province，China.The MMP-9 gene rs3918242 and rs3787268 polymorphisms may be the risk factors of large-artery atherosclerotic stroke.

Matrix metalloproteinases-9 Atherosclerosis Ischemic stroke Single nucleotide polymorphism

R743.31

A

2016-12-16）

（責(zé)任編輯：李立）

10.3969/j.issn.1002-0152.2017.07.006

☆國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（編號(hào)：81404061）

* 廣東醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科（湛江 524001）

**廣東醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院神經(jīng)病學(xué)研究所