楊慧萍，李軒

（1．新疆伊犁哈薩克自治州伊寧市友誼醫(yī)院藥劑科，新疆 伊寧 835000；2．新疆伊犁哈薩克自治州中醫(yī)院藥劑科，新疆 伊寧 835000）

HPLC測(cè)定雙向固體發(fā)酵過(guò)程中人參皂苷成分的變化

楊慧萍1，李軒2

（1．新疆伊犁哈薩克自治州伊寧市友誼醫(yī)院藥劑科，新疆 伊寧 835000；2．新疆伊犁哈薩克自治州中醫(yī)院藥劑科，新疆 伊寧 835000）

目的：研究人參在雙向固體發(fā)酵過(guò)程中，不同發(fā)酵時(shí)間下人參菌質(zhì)中人參皂苷Re、Rg1、Rh1、Rb1、Rf、Rd及人參總皂苷的含量變化情況。方法：采用高效液相色譜法測(cè)定各發(fā)酵時(shí)間下人參菌質(zhì)中人參總皂苷以及上述6種人參皂苷的含量。結(jié)果：隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)，人參皂苷Re、Rg1、Rb1的含量總體呈降低趨勢(shì)，人參皂苷Rd、Rh1的含量總體呈上升趨勢(shì)，人參總皂苷的含量有所減少。結(jié)論：隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)，人參皂苷含量發(fā)生變化，人參皂苷發(fā)生了轉(zhuǎn)化。

人參皂苷；高效液相色譜法；雙向固體發(fā)酵

人參為五加科植物人參的干燥根和根莖，首見(jiàn)《神農(nóng)本草經(jīng)》中，列為上品，具補(bǔ)五臟、定魂魄、除邪氣、安精神、明目益智等功效[1]。人參在現(xiàn)代臨床上對(duì)疾病防預(yù)和人體滋補(bǔ)強(qiáng)壯方面具有很好效果，可用其治療四肢冰冷、心力衰竭、脈象虛弱以及休克等疾病[2]。隨著人們對(duì)人參不斷地深入研究，人參中的活性成分及其藥理作用逐漸地被發(fā)現(xiàn)[3]。研究表明，人參中主要有效成分為人參皂苷，約占4%，且到目前，已分析鑒定出的人參皂苷單體達(dá)40余種[4]。通過(guò)國(guó)內(nèi)外的學(xué)者們對(duì)人參皂苷藥理活性的研究，發(fā)現(xiàn)其藥理作用主要集中于抑制癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移、誘導(dǎo)細(xì)胞的凋亡、抗突變、保護(hù)心腦血管和增強(qiáng)免疫功能等[5]，通常對(duì)于二醇組皂苷來(lái)說(shuō)藥理活性的不同是由于皂苷分子結(jié)構(gòu)中的糖基側(cè)鏈不同所致[6]。然而，野生人參藥用資源極為稀少，采用人工栽培技術(shù)的周期較長(zhǎng)且成本高，其藥材價(jià)格不斷升高等因素極大地限制了對(duì)人參的研發(fā)和應(yīng)用[7]。近年來(lái)，采用一些新技術(shù)，如微生物轉(zhuǎn)化、化學(xué)合成、組織培養(yǎng)等，能更高更快地獲取目標(biāo)化合物，成為一種有效的獲取資源途徑[8]。對(duì)于人參皂苷來(lái)說(shuō)，利用生物體外轉(zhuǎn)化則能有效地改變其糖鏈結(jié)構(gòu)，從而提高稀有活性皂苷的含量，具有一定的經(jīng)濟(jì)價(jià)值[9]。固體發(fā)酵是人參皂苷體外轉(zhuǎn)化的一種常用方法，該過(guò)程是雙向發(fā)酵的過(guò)程，一方面人參藥材作為基質(zhì)為菌體提供營(yíng)養(yǎng)，另一方面菌體代謝產(chǎn)生的酶將原有的人參皂苷進(jìn)行結(jié)構(gòu)修飾轉(zhuǎn)化為活性更高的稀有人參皂苷，此方法工藝比較簡(jiǎn)單，質(zhì)量易控制，產(chǎn)率較高，適合于工業(yè)大生產(chǎn)[10]。

本實(shí)驗(yàn)采用高效液相色譜法測(cè)定不同發(fā)酵時(shí)間下人參菌質(zhì)中人參皂苷Re、Rg1、Rh1、Rb1、Rd、Rf及人參總皂苷的含量。此方法測(cè)定人參皂苷含量具有快速、簡(jiǎn)單、特征性良好等特點(diǎn)[11]，可作為人參藥材質(zhì)量控制的重要指標(biāo)[12]。為人參藥材生物轉(zhuǎn)化的質(zhì)量控制提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)和參考。

1 材料與儀器

人參產(chǎn)自吉林長(zhǎng)白山地區(qū)，主要試劑：人參皂苷標(biāo)準(zhǔn)品（Re、Rg1、Rh1、Rb1、Rf、Rd購(gòu)于中國(guó)藥品生物制品檢定所）；甲醇、乙腈為色譜純，水為蒸餾水，其余試劑為分析純。HH-4型數(shù)顯恒溫水浴鍋（金壇市江南儀器廠）；十萬(wàn)分之一電子天平（德國(guó)Sartorius公司）；萬(wàn)分之一天平（梅特勒-托利多儀器公司）；立式壓力蒸汽菌器HYXQ-LS-50A（上海博迅實(shí)業(yè)有限公司）；KQz3200E型超聲波清洗機(jī)（天鵬電子新技術(shù)有限公司）；安捷倫-1260高效液相色譜儀（美國(guó)安捷倫公司）；色譜柱InertsilODS-SP（5 μm，4.6 mm×250 mm，GL Sciences lnc）；DIF-6090型真空干燥箱（上海一恒實(shí)驗(yàn)儀器總廠）；SZ-97型自動(dòng)純水蒸餾器（上海亞蓉儀器廠）。

2 方法與結(jié)果

2.1 溶液的制備

2.1.1 對(duì)照品溶液 精密稱取對(duì)照品人參皂苷Re、Rg1、Rh1、Rb1、Rf、Rd，加甲醇制成每1 mL各含0.2 mg的混合溶液，搖勻，即得。

2.1.2 供試品溶液 取本品粉末（過(guò)四號(hào)篩）約1 g，精密稱定，置索氏提取器中，加三氯甲烷加熱回流3 h，棄去三氯甲烷液，藥渣揮干溶劑，連同濾紙筒移入100 mL錐形瓶中，精密加水飽和正丁醇50 mL，密塞，放置過(guò)夜，超聲處理（功率250 W，頻率50 kHz）30 min，濾過(guò)，棄去初濾液，精密量取續(xù)濾液25 mL，置蒸發(fā)皿中蒸干，殘?jiān)蛹状既芙獠⑥D(zhuǎn)移至5 mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得[13]。

2.2 色譜條件

以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；以乙腈為流動(dòng)相A，以水為流動(dòng)相B，按表1中的規(guī)定進(jìn)行梯度洗脫；檢測(cè)波長(zhǎng)為203 nm；柱溫30℃；流速1.0 mL/min。理論板數(shù)按人參皂苷Rg1峰計(jì)算應(yīng)不低于6 000[13]。

2.3 線性關(guān)系試驗(yàn)

精密吸取對(duì)照品人參皂苷Rg1、Re、Rb1溶液2，5，7，10，13 μL；精密吸取對(duì)照品人參皂苷Rh1、Rf、Rd溶液2，4，8，10，12，20 μL，按上述色譜條件測(cè)定峰面積值。以峰面積的積分值為縱坐標(biāo)Y，以標(biāo)品人參皂苷Rg1、Re、Rb1、Rh1、Rf、Rd的進(jìn)樣量為橫坐標(biāo)X，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，見(jiàn)表1。

表1 人參皂苷Rg1、Re、Rb1、Rh1、Rf、Rd標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.4 精密度試驗(yàn)

精密吸取對(duì)照品溶液10 μL，按上述色譜條件重復(fù)進(jìn)樣6次，得其峰面積。結(jié)果為人參皂苷Rg1、Re、Rb1、Rh1、Rf、Rd對(duì)照品的RSD分別為0.95%，0.73%，0.98%，1.97%，1.71%，1.74%，表明精密度良好。

2.5 穩(wěn)定性試驗(yàn)

精密吸取人參皂苷Rh1、Re、Rg1、Rb1、Rf、Rd對(duì)照品溶液與供試品溶液各10 μL，按上述色譜條件，測(cè)定24 h內(nèi)峰面積值，對(duì)照品中人參皂苷Re、Rg1、Rb1、Rh1、Rf、Rd的RSD為0.87%，0.59%，1.57%，2.94%，2.42%，2.30%；供試品中人參皂苷Re、Rg1、Rh1、Rb1、Rf、Rd的RSD為0.99%，1.40%，1.70%，2.80%，2.22%，2.73%，表明穩(wěn)定性良好。

2.6 重復(fù)性試驗(yàn)

取發(fā)酵粉末6份，每份1 g，精密稱定，按供試品溶液項(xiàng)下依法測(cè)定，取10 μL，按上述色譜條件，測(cè)定峰面積，并代入相應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算人參皂苷Re、Rg1、Rh1、Rb1、Rf、Rd的含量。試驗(yàn)結(jié)果為人參皂苷Rg1、Re、Rb1、Rh1、Rf、Rd精密度的RSD為 2.71%，2.68%，2.97%，0.77%，2.30%，2.57%，表明重復(fù)性好。見(jiàn)表2。

2.7 回收率試驗(yàn)

精密稱取樣品0.5 g，加入適量人參皂苷Rh1、Re、 Rg1、Rb1、Rf、Rd對(duì)照品，依法制備及測(cè)定，并計(jì)算加樣回收率。試驗(yàn)結(jié)果為人參皂苷Re、Rg1、Rh1、Rb1、Rf、Rd平均加樣回收率的為100.4%，102.66%，96.83%，96.4%，98.94%，99.29%；其RSD%分別為2.15%，1.52%，1.01%，1.46%，2.47%，2.84%表明準(zhǔn)確性良好。見(jiàn)表3。

表2 重復(fù)性試驗(yàn)

表3 回收率試驗(yàn) （%）

2.8 人參總皂苷的含量測(cè)定

2.8.1 對(duì)照品溶液的制備 取人參皂苷Re對(duì)照品適量，精密稱定，加甲醇制成每1 mL含1 mg的溶液，即得。

2.8.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備 標(biāo)準(zhǔn)品溶液的制備：取人參皂苷Re對(duì)照品適量，精密稱定，加甲醇制成每1 mL含0.1 mg的溶液，即得。

2.8.3 人參藥材供試品溶液的制備 取人參粉末（過(guò)60目篩）約1 g，精密稱定，置索氏提取器中，加三氯甲烷回流3 h，棄去三氯甲烷液，藥渣揮干溶劑，連同濾紙筒放入錐形瓶中，精密加入50 mL水飽和正丁醇液，超聲處理30 min，冷卻，過(guò)濾，精密吸取續(xù)濾液25 mL，蒸干。殘?jiān)?0 mL水溶解，通過(guò)已處理好的D101大孔樹(shù)脂柱（12 cm×1.5 cm），吸附1 h，先用100 mL蒸餾水洗脫，棄去水液，再用70%乙醇100 mL洗脫，收集洗脫液蒸干。殘?jiān)蛹状既芙猓ㄈ萦?0 mL量瓶中，即得。

2.8.4 發(fā)酵產(chǎn)物供試品溶液的制備 取發(fā)酵產(chǎn)物粉末（過(guò)60目篩）1 g，置于索氏提取器中，加三氯甲烷回流3 h，棄去三氯甲烷液，藥渣揮干溶劑，連同濾紙筒放入錐形瓶中，精密加入50 mL水飽和正丁醇液，超聲處理30 min，冷卻，過(guò)濾，精密吸取續(xù)濾液25 mL，蒸干。殘?jiān)?0 mL水溶解，通過(guò)已處理好的D101大孔樹(shù)脂柱（12 cm×1.5 cm），吸附1 h，先用100 mL蒸餾水洗脫，棄去水液，再用70%乙醇100 mL洗脫，收集洗脫液蒸干。殘?jiān)蛹状既芙猓ㄈ萦?0 mL量瓶中，即得。

2.8.5 測(cè)定方法 精密吸取本品0.6 mL，按“2.8.2”項(xiàng)下的方法，自“置于具塞試管中”起依法操作，測(cè)定吸光度，從標(biāo)準(zhǔn)曲線上讀出供試品溶液中人參皂苷Re的量，計(jì)算結(jié)果乘以0.84，即得[13]。 2.8.6 實(shí)驗(yàn)結(jié)果 各發(fā)酵終點(diǎn)時(shí)人參皂苷Re、Rg1、Rh1、Rb1、Rf、Rd及人參總皂苷含量，見(jiàn)表4。

表4 人參皂苷及其總皂苷含量 （mg/g）

3 結(jié)論

3.1 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)表明：人參在雙向固體發(fā)酵的過(guò)程中，人參皂苷的含量發(fā)生了變化，人參皂苷Rd發(fā)酵9 d后含量明顯升高，發(fā)酵24 d時(shí)含量達(dá)到最高；人參皂苷Rh1含量總體有所升高；人參皂苷Re、Rf、Rg1、Rb1的含量總體呈下降趨勢(shì)，其中Rb1下降趨勢(shì)較明顯，Rf含量無(wú)明顯變化；人參總皂苷的含量總體有所減少；發(fā)酵過(guò)程中人參皂苷有部分發(fā)生轉(zhuǎn)化。

3.2 近年來(lái)，人參的體外轉(zhuǎn)化技術(shù)越來(lái)越受到人們的關(guān)注，然而相比細(xì)菌、酶催化的方法，使用真菌進(jìn)行發(fā)酵具有操作簡(jiǎn)單、成本低廉的優(yōu)勢(shì)[14]。本實(shí)驗(yàn)采用高效液相色譜法來(lái)測(cè)定人參在固體真菌發(fā)酵的過(guò)程中，不同發(fā)酵時(shí)間下人參菌質(zhì)中人參皂苷的含量情況，總結(jié)出人參雙向發(fā)酵后6個(gè)人參皂苷及人參總皂苷的含量變化，為人參藥材生物轉(zhuǎn)化研究的質(zhì)量控制提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)，為人參產(chǎn)品的研發(fā)和使用提供參考。

從實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)上可以看出，經(jīng)過(guò)不同的發(fā)酵時(shí)間，人參皂苷的含量發(fā)生了變化，這種轉(zhuǎn)化有利于獲取更高含量的目標(biāo)產(chǎn)物。其中值得特別關(guān)注的是人參皂苷Rd在發(fā)酵的過(guò)程中含量不斷升高，24 d時(shí)含量達(dá)到最高，這說(shuō)明在此發(fā)酵條件下有利于提高人參皂苷Rd的含量。Rd為稀有人參皂苷，其在植物體內(nèi)含量較低，腸道酶可以將Rb1代謝為Rd[15]。其藥理作用廣泛，除與其他人參皂苷相似之處之外，還具有一些獨(dú)特的藥理作用。其主要藥理作用有保護(hù)心腦血管、清除自由基、抗衰老、調(diào)節(jié)免疫、抗腫瘤等方面。

從數(shù)據(jù)還可發(fā)現(xiàn)，人參皂苷Rb1的含量明顯下降，可以推測(cè)，在此發(fā)酵過(guò)程中在菌體代謝產(chǎn)生的酶的作用下人參皂苷Rb1轉(zhuǎn)化為了Rd。

[1] 張均田.人參研究的最新進(jìn)展[J].江蘇大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版),2009,19(3):185-191.

[2] 范莎莎,王楠.人參的藥用研究[J].長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào),2014,30(5):825-826.

[3] 黎陽(yáng),張鐵軍,劉素香,等.人參化學(xué)成分和藥理研究進(jìn)展[J].中草藥,2009,40(1):164.

[4] 石楸鳴.人參皂苷的藥理作用研究進(jìn)展[J].中國(guó)藥房,2010,21(31):2967-2969.

[5] 劉欣,楊凌,崔昱.人參皂甙的活性綜述[J].中國(guó)微生態(tài)學(xué)雜志,2005,17(1):76.

[6] Chen X,Zhou QL,Wang BX. The metablisim of ginsenoside Rb1 by intestinal Bacteria[J].Acta Pharm Sin, 1999,34(6):410-414.

[7] 張瑜,陳照宇,都曉偉.真菌固體發(fā)酵提高人參藥材中皂苷含量的研究[J].中醫(yī)藥學(xué)報(bào),2015,43(2):85-87.

[8] 楊金玲,高麗麗,朱平.人參皂苷生物合成研究進(jìn)展[J].藥學(xué)學(xué)報(bào),2013,48(2):170-178.

[9] 崔玉娜,張怡軒,趙余慶.利用生物轉(zhuǎn)化法制備稀有人參皂苷的研究進(jìn)展[J].中草藥,2009,40(5):676-680.

[10] 張洋婷,郗艷麗,白春燕,等.人參皂苷體外轉(zhuǎn)化和分析方法的研究進(jìn)展[J].吉林醫(yī)藥學(xué)院學(xué)報(bào),2015,36(2):121-124.

[11] 鄭重,宋鳳瑞,劉淑瑩,等.人參、紅參皂苷類成分指紋圖譜研究[J].質(zhì)譜學(xué)報(bào),2012,33(6):327-333.

[12] 胥秀英,鄭一敏,傅善權(quán),等.HPLC同時(shí)測(cè)定人參藥材中12種人參皂苷的含量[J].中國(guó)中藥雜志,2011,36(11):1463-1465.

[13] 國(guó)家藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)藥典(2010年版)一部[S].北京:中國(guó)醫(yī)藥科技出版社,2005:20.

[14] 楊元超,王英平,閆梅霞,等.人參皂苷compound K轉(zhuǎn)化菌株的篩選[J].中國(guó)中藥雜志,2011,36(12):1596-1598.

[15] Odani T,Tanizawa H,Takino Y.Studies on the absorption,distribution, excretion and metabolism of ginseng saponins. Ⅳ.Decomposition of ginsenoside-Rgland-Rb1in the digestivetract of rats[J].Chem Pharm Bull,1983,31(10):3691-3697.

本文編輯：魯守琴

Determine Changes of Ginsenoside Components During Bidirectional Solid Fermentation Course by HPLC-ELSD

Yang Hui-ping1, Li Xuan2
(1.Department of Pharmacy, The Friendship Hospital of Yining City, Kazak Autonomous Prefecture of Yili in Xinjiang, Xinjiang Yining 835000, China; 2. Department of Pharmacy, the Chinese Medicine Hospitall of Yining City, Kazak Autonomous Prefecture of Yili in Xinjiang, Xinjiang Yining 835000,China)

Objective：Study the influence on ginsenosides Re, Rg1, Rh1, Rb1, Rf, Rd and the content of total saponins of Panax ginseng under different fermentation time during the bidirectional solid fermentation course. Methods：Using HPLC to measure the content of total saponins of panax ginseng and above 6 ginsenosides which under different fermentation time. Results：With the extension of the fermentation time, the content of ginsenosides Re, Rg1, Rb1were overall gradually decreasing, the content of ginsenoside Rd, Rh1were overall gradually increasing, and the content of total saponins of panax ginseng was decreased. Conclusion：With the prolongation of fermentation time, the content of ginsenosides was changed, and the transformation was happened.

Ginsenoside; HPLC; Bidirectional Solid Fermentation

R284.1

A

10.3969/j.issn.2096-3327.2017.07.021

2017 - 04 - 19

楊慧萍，女，主管藥師。研究方向：臨床藥學(xué)。E-mail：yhp6222@163.com

李軒，女，藥師。研究方向：臨床藥學(xué)。E-mail：yhp6222@163.com