趙明丹，周 汛

（重慶市中醫(yī)院皮膚美容科，重慶 400012）

球形孢子絲菌與孢子絲菌屬其它模式菌株的形態(tài)特征差異

趙明丹，周 汛*

（重慶市中醫(yī)院皮膚美容科，重慶 400012）

目的 比較菌絲相下球形孢子絲菌與孢子絲菌屬其它菌種的形態(tài)特征差異，探討鑒定球形孢子絲菌的形態(tài)學(xué)。方法 分別接種15株從臨床分離的中國(guó)球形孢子絲菌和6株其它孢子絲菌屬模式菌株，用光學(xué)顯微鏡從菌落、菌絲、孢子形態(tài)及生長(zhǎng)速度進(jìn)行比較。結(jié)果 球形孢子絲菌鏡下形態(tài)為球形或倒梨型，申克孢子絲菌模式菌株鏡下呈長(zhǎng)桿狀；臨床分離菌株生長(zhǎng)緩慢，環(huán)境菌株生長(zhǎng)較快。結(jié)論 球形孢子絲菌與孢子絲菌屬其他菌種在菌落顏色、生長(zhǎng)速度、鏡下菌絲、孢子均存在差異，為臨床快速有效鑒別孢子絲菌菌種奠定基礎(chǔ)。

孢子絲菌；菌落特點(diǎn)；形態(tài)學(xué)

孢子絲菌病是由申克孢子絲菌引起的一種急性或慢性皮膚及皮下組織的真菌感染性疾病，可由呼吸道、被污染的土壤及植物、患病動(dòng)物咬傷等傳染致病，臨床常表現(xiàn)為皮膚化膿、潰爛及滲出，咳嗽、發(fā)熱等，臨床分型可分為皮膚型和系統(tǒng)型，后者可累及骨、肺、眼等多個(gè)器官[1]。臨床上常需進(jìn)行全身性治療，除口服抗真菌藥物外，局部外用光動(dòng)力可縮短口服藥物療程，減少不良事件發(fā)生。我國(guó)東北地區(qū)為此病好發(fā)區(qū)域，長(zhǎng)久以來(lái)我國(guó)各地區(qū)孢子絲菌病的病原菌一直被認(rèn)為是申克孢子絲菌，近來(lái)研究表明我國(guó)孢子絲菌病的致病菌是球形孢子絲菌[2-3]。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)比較球形孢子絲菌與其它孢子絲菌的生物學(xué)形態(tài)差異，為鑒定球形孢子絲菌提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 菌株 15株從臨床分離菌株，6株購(gòu)買自荷蘭CBS真菌多樣性研究中心孢子絲菌其它模式菌株：環(huán)境分離菌種：墨西哥孢子絲菌模式菌株（CBS 120341），Sporothrix humicola（CBS 118129），Sporothrix lignivora（CBS 119148）；球形孢子絲菌的模式菌株（CBS 120340），申克孢子絲菌模式菌株（CBS 359.36），申克孢子絲菌盧艾里變種模式菌株（CBS 937.37）。

1.1.2 培養(yǎng)基 2%土豆葡萄糖瓊脂（PDA）培養(yǎng)基。

1.2 方 法

1.2.1 菌株復(fù)蘇 將實(shí)驗(yàn)菌株接種于PDA試管中，每隔7d傳代1次，連續(xù)傳代2～3次，觀察鏡下菌落形態(tài)，保證菌株的純度和生長(zhǎng)活力。

1.2.2 菌株培養(yǎng) 純化后菌株接種在PDA培養(yǎng)基平板中央，接種物直徑2mm，25℃倒置培養(yǎng)28d，每隔7d觀察菌落長(zhǎng)勢(shì)并測(cè)量菌落的生長(zhǎng)速度。每組菌落設(shè)置3個(gè)培養(yǎng)皿，重復(fù)測(cè)試3次。

1.2.3 玻片小培養(yǎng) PDA瓊脂塊置于無(wú)菌載玻片上，厚度以2～3mm為宜；將菌株接種在瓊脂塊上，置于25℃下培養(yǎng)7天，揭下蓋玻片覆蓋在新載玻片上，光鏡下(100×)進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察。

2 結(jié) 果

2.1 菌落形態(tài)

所有的孢子絲菌均呈現(xiàn)較好的生長(zhǎng)菌落生長(zhǎng)平整，圓形可見(jiàn)白色絨毛狀菌絲，培養(yǎng)21d時(shí)球形孢子絲菌菌落出現(xiàn)皺褶。CBS 359.36和CBS 937.37菌絲為白色，CBS 120341菌絲呈棕色，CBS 118129菌絲為白色，21d時(shí)菌落周圍可見(jiàn)一圈白色透明狀絨毛。CBS 119148菌落環(huán)狀，背面為黑褐色，菌絲呈墨綠色，隨菌落生長(zhǎng)顏色逐漸加深，14d前菌落邊緣可見(jiàn)白色菌絲，21d后變?yōu)槟G色菌絲，見(jiàn)圖1。

2.2 生長(zhǎng)速度

我國(guó)15株臨床分離菌株及CBS 120340及CBS 359.36，CBS 937.37生長(zhǎng)較慢；CBS 120341、CBS 118129、CBS 119148均為環(huán)境分離菌株，生長(zhǎng)速度較快，7d、14d、21d、28d時(shí)的生長(zhǎng)速度均超過(guò)臨床分離株，CBS 119148的生長(zhǎng)速度最快，21天菌落平均直徑達(dá)76mm，見(jiàn)表1、圖2。

圖1 不同菌株培養(yǎng)期間菌落形態(tài)在25℃PDA培養(yǎng)基上7天，14，21天和28天菌落形態(tài)，從上至下分別為：(a)臨床分離菌株來(lái)自北京地區(qū)，(b)臨床分離菌株來(lái)自吉林地區(qū)，(c)臨床分離菌株來(lái)自重慶地區(qū)， (d)S.globosa(CBS 120340)，(e)S.schenckii(CBS 359.36),(f)S.schenckii var.luriei(CBS 937.72)., (g) S.mexicana(CBS 120341),(h)S.humicola(CBS 118129),(i)S.lignivora(CBS 119148)。

表1 不同菌株培養(yǎng)期間菌落平均直徑（mm）

2.3 鏡下形態(tài)

球形孢子絲菌光鏡下在頂端及菌絲兩側(cè)均可見(jiàn)呈圓形或倒梨型排列的分生孢子，菌絲兩側(cè)附著較少的呈袖套樣分生孢子。CBS 359.36顯微鏡下可見(jiàn)菌絲頂端呈長(zhǎng)桿狀排列的分生孢子，在菌絲兩側(cè)未見(jiàn)孢子附著。CBS 937.37光鏡下在頂端呈桿狀樣狀排列的小分生孢子。環(huán)境菌株CBS 120341、CBS 119148和CBS 118129光鏡下在頂端可見(jiàn)呈排列的長(zhǎng)橢圓形的分生孢子。

3 討 論

本次研究發(fā)現(xiàn)，來(lái)自環(huán)境菌株的孢子絲菌比臨床分離的孢子絲菌生長(zhǎng)速度快，7d，14d，21d，28d時(shí)的生長(zhǎng)速度均超過(guò)臨床分離株，從環(huán)境分離而來(lái)的模式菌株CBS 119148的生長(zhǎng)速度最快，21天菌落平均直徑達(dá)76mm，菌落顏色呈墨綠色。而來(lái)自臨床分離菌株生長(zhǎng)速度較慢，我國(guó)臨床型孢子絲菌分離菌株21天菌落平均直徑為41mm，菌落顏色為棕色或白色，環(huán)境菌株21天菌落直徑均＞50mm，而臨床菌株21天時(shí)菌落直徑均＜50mm[4]。孢子絲菌菌落顏色越深說(shuō)明產(chǎn)生的孢子越多，致病性越強(qiáng)[5,6]。本實(shí)驗(yàn)菌落顏色較深的是我國(guó)臨床分離株和Sporothrix lignivora[7,8]，故本次研究考慮以上兩種菌株毒力最強(qiáng)；在我國(guó)三個(gè)地區(qū)分離的孢子絲菌中，來(lái)自重慶和北京地區(qū)的孢子絲菌菌落顏色棕白色，而吉林地區(qū)的孢子絲菌菌落顏色呈黑色，表面皺褶，說(shuō)明我國(guó)不同地區(qū)的球形孢子絲菌孢子形態(tài)存在差異，且吉林地區(qū)孢子絲菌致病力更強(qiáng)，與之前研究顯示我國(guó)東北地區(qū)為孢子絲菌好發(fā)區(qū)域情況相吻合，提示臨床可根據(jù)疾病發(fā)生區(qū)域推測(cè)菌種類型，從而減少檢查人員工作量，提高診斷效率。

我們發(fā)現(xiàn)球形孢子絲菌鏡下頂端孢子以圓形、倒卵圓形或梨形固著分生孢形為特點(diǎn)，而申克孢子絲菌鏡下頂端孢子以長(zhǎng)桿狀為特點(diǎn)，這也許是在鏡下區(qū)別孢子絲菌兩個(gè)種的要點(diǎn)。本次研究證明，在臨床上可以通過(guò)小培養(yǎng)觀察頂端分生孢子形態(tài)，測(cè)量菌落直徑來(lái)鑒別孢子絲菌種。

綜上所述，孢子絲菌的多樣性導(dǎo)致了孢子絲菌屬的不同特征，本實(shí)驗(yàn)通過(guò)菌株的生物學(xué)特性對(duì)孢子絲菌屬進(jìn)行區(qū)別，為孢子絲菌提供了臨床研究基礎(chǔ)，從而快速有效地鑒定菌種，從而指導(dǎo)臨床治療方案及預(yù)后判斷。

[1] 李聰慧,冉玉平,王鵬等.發(fā)生于雙側(cè)腰部的孢子絲菌病1例 [J].中國(guó)真菌學(xué)雜志,2012,07(1)∶31-32.

[2] 黃夢(mèng)雅,劉婷婷,楊致邦等.16株中國(guó)東北地區(qū)臨床孢子絲菌菌種分子生物分類學(xué)研究[J].中國(guó)人獸共患病學(xué)報(bào),2014,30(9)∶904-908.

[3] 譚靜文,劉偉,萬(wàn)喆等.來(lái)自中國(guó)北方部分地區(qū)33株孢子絲菌菌株的表型和基因型鑒定[J].菌物學(xué)報(bào),2013,32(2)∶161-167.

[4] 劉婷婷.中國(guó)地區(qū)臨床孢子絲菌的系統(tǒng)發(fā)育分析[D].重慶醫(yī)科大學(xué),2014.

[5] 畢云斐,齊琳,李福秋等.孢子絲菌病及影響申克孢子絲菌毒力因素的研究進(jìn)展[J].中國(guó)老年學(xué)雜志,2015,(8)∶2301-2303.

[6] 賀羽,黃宜進(jìn),趙秘密等.中國(guó)臨床球形孢子絲菌菌絲相藥物敏感性分析[J].中國(guó)真菌學(xué)雜志,2016,11(4)∶209-212.

[7] 賀羽,黃夢(mèng)雅,胡青碧等.中國(guó)南北方地區(qū)臨床孢子絲菌菌種鑒定[J].中國(guó)真菌學(xué)雜志,2015,10(5)∶279-282.

[8] 劉婷婷. 中國(guó)地區(qū)臨床孢子絲菌的系統(tǒng)發(fā)育分析[D]. 重慶醫(yī)科大學(xué), 2014.

The difference of morphological characteristics among Chinese clinical strains and the others of Sporothrix schenckii complex

ZHAO Ming-dan, ZHOU Xun
(Department of dermatology, Chongqing Hospital of traditional Chinese Medicine, Chongqing City, 400016, China)

Objective Comparison of morphological characteristics of spherical mycelial phase of Sporothrix schenckii and other strains of Sporothrix,to investigate the morphological identification method of spherical sporotrichosis. Methods 15 strains isolated from clinical isolates of Sporothrix China spherical bacteria and 6 strains of other Sporothrix strains were inoculated; The colony, hyphae, spore morphology and growth rate were compared by light microscopy. Results The spherical Sporothrix morphology under microscope for spherical or inverted pear, and Sporothrix schenckii strains under microscope were rod-shaped. The clinical isolates grew slowly and the environmental isolates grew rapidly. Conclusion There are differences in the color of colonies, the growth rate, the microscopic hyphae and the spores of other species, which lays the foundation for the rapid and effective identification of filamentous bacteria.

Sporothrix; Colonies Features; Morphological

圖2 不同菌株培養(yǎng)期間菌落直徑

圖3 不同菌株培養(yǎng)期間鏡下形態(tài)在25℃PDA培養(yǎng)基上7天鏡下孢子形態(tài)（100X）A∶臨床分離菌株來(lái)自北京地區(qū)，B∶臨床分離菌株來(lái)自吉林地區(qū)，C∶臨床分離菌株來(lái)自重慶地區(qū)，D∶S.globosa(CBS 120340)，E∶S.schenckii(CBS 359.36), F∶S.schenckii var.luriei(CBS 937.72).,G∶S.mexicana(CBS 120341), H∶S.humicola(CBS 118129), I∶S.lignivora(CBS 119148)。

國(guó)家自然科學(xué)基金（No. 31270062）

趙明丹（1985—），女，碩士，主治醫(yī)師，研究方向：醫(yī)學(xué)真菌學(xué)。

周汛（1970—），女，博士，教授、主任醫(yī)師，研究方向：醫(yī)學(xué)真菌學(xué)。

DOI∶ 10.19593/j.issn.2095-0721.2017.08.039