盧 昕，孟慶斌，邵永勝

(武漢市第一醫(yī)院胃腸外科 430022)

論著·基礎(chǔ)研究

CDH17調(diào)節(jié)TGF-β自分泌影響胃癌細(xì)胞侵襲作用的研究*

盧 昕，孟慶斌，邵永勝△

(武漢市第一醫(yī)院胃腸外科 430022)

目的 探討轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子(TGF)-β自分泌在鈣黏蛋白17(CDH17)調(diào)節(jié)胃癌細(xì)胞侵襲性中的作用及可能機(jī)制。方法 構(gòu)建siRNA-CDH17并轉(zhuǎn)染入胃癌細(xì)胞系MKN-45，沉默其表達(dá)。通過(guò)免疫熒光染色、Western blot、ELISA檢測(cè)CDH17沉默前后細(xì)胞TGF-β表達(dá)及培養(yǎng)上清液中TGF-β水平變化，觀察TGF-β的自分泌情況。同時(shí)采用Western blot檢測(cè)TGF-β/Smad3信號(hào)通路活化情況，并通過(guò)Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)觀察在給予信號(hào)通路抑制劑后，胃癌細(xì)胞侵襲力的變化，評(píng)價(jià)TGF-β自分泌及相關(guān)信號(hào)通路活化在CDH17調(diào)節(jié)胃癌細(xì)胞侵襲性中的作用。結(jié)果 轉(zhuǎn)染siRNA-CDH17沉默MKN-45細(xì)胞CDH17表達(dá)后，細(xì)胞TGF-β表達(dá)較未轉(zhuǎn)染組明顯下降，其培養(yǎng)上清液中TGF-β水平也顯著減少[(510±55.0)pg/mLvs.(115±20)pg/mL,P<0.05]。Western blot顯示CDH17沉默后Smad3磷酸化水平也明顯降低，而給予TGF-β/Smad3信號(hào)通路抑制劑SIS3(10 μmol/L)也可抑制CDH17高表達(dá)時(shí)的Smad3磷酸化水平。同時(shí)，沉默CDH17及抑制Smad3磷酸化均可明顯降低MKN-45細(xì)胞侵襲性(P<0.05)。結(jié)論 CDH17可能通過(guò)促進(jìn)自分泌TGF-β活化TGF-β/Smad3信號(hào)通路參與調(diào)節(jié)胃癌細(xì)胞侵襲性。

胃腫瘤；腫瘤浸潤(rùn)；轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β；CDH17；信號(hào)通路

目前研究發(fā)現(xiàn)鈣黏蛋白17(CDH17)是參與調(diào)節(jié)胃癌細(xì)胞侵襲及淋巴轉(zhuǎn)移的重要分子[1]，然而目前其確切調(diào)控機(jī)制仍不明確，筆者前期研究發(fā)現(xiàn)CDH17 可通過(guò)誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞向間質(zhì)表型轉(zhuǎn)換促進(jìn)胃癌細(xì)胞侵襲，提示上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化可能是CDH17調(diào)控胃癌細(xì)胞侵襲性的可能機(jī)制之一。轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子(TGF)-β及相關(guān)信號(hào)通路是參與調(diào)節(jié)上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化的重要分子信號(hào)[2]。目前報(bào)道多種腫瘤可通過(guò)自分泌TGF參與調(diào)節(jié)自身的增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移等生物學(xué)行為[3-4]。因此推測(cè)TGF-β自分泌也可能在CDH17誘導(dǎo)的胃癌細(xì)胞侵襲中發(fā)揮作用。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)比較胃癌細(xì)胞CDH17沉默前后，TGF-β的表達(dá)及分泌變化和相關(guān)信號(hào)通路活化情況，觀察其對(duì)胃癌細(xì)胞侵襲性的影響，探討TGF-β自分泌在CDH17調(diào)節(jié)胃癌細(xì)胞侵襲力中的作用及其可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 主要材料和試劑 蛋白裂解液M-PER購(gòu)自美國(guó)Thermo Pierce公司。CDH17和TGF-β一抗購(gòu)自美國(guó)Abcam公司，磷酸化p-Smad3、總t-Smad3和SIS3一抗購(gòu)自美國(guó)Cell Signaling Technology公司。β-actin一抗及相應(yīng)的二抗和鏈霉親和素-生物復(fù)合物(SABC)免疫熒光試劑盒購(gòu)自武漢博士德生物工程有限公司。超敏電化學(xué)發(fā)光(ECL)試劑盒購(gòu)自碧云天生物技術(shù)研究所。胎牛血清和高糖DMEM培養(yǎng)基購(gòu)自美國(guó)Hyclone公司。TGF-β ELISA試劑盒購(gòu)自美國(guó)R&D公司。去細(xì)胞因子基質(zhì)膠購(gòu)自美國(guó)Sigma-Aldrich公司。24孔嵌套Transwell(聚碳酯膜孔徑8μm)購(gòu)自美國(guó)Corning公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)及實(shí)驗(yàn)分組 胃癌細(xì)胞系MKN-45由華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬協(xié)和醫(yī)院普通外科實(shí)驗(yàn)室保存提供。細(xì)胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清的高糖DMEM完全培養(yǎng)基中，置于37℃,5%CO2培養(yǎng)箱，2～3 d傳代一次。實(shí)驗(yàn)共分為3組：轉(zhuǎn)染siRNA-CDH17組；轉(zhuǎn)染CDH17空白質(zhì)粒(vector)組和非轉(zhuǎn)染組。

1.2.2 siRNA-CDH17的構(gòu)建與轉(zhuǎn)染 CDH17基因的cDNA序列由 GenBank(NM_001144663.1) 獲得，針對(duì)該序列的3種不同siRNA 由在線RNAi設(shè)計(jì)算法設(shè)計(jì)(http://www.ambion.com/techlib/misc/siRNA_finder.html)。所有設(shè)計(jì)的siRNAs由上海吉瑪生物制藥有限公司合成純化。合成純化的siRNAs 用全式金脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑盒(北京全式金生物技術(shù)有限公司)根據(jù)說(shuō)明書(shū)轉(zhuǎn)染入MKN-45細(xì)胞。經(jīng)實(shí)時(shí)定量PCR 鑒定，siRNA-CDH17 序列正義鏈：5′-TGC AUT TCC UAA GGC TGA-3′,反義鏈5′- GAU CCT GGT TCA AUA ACA T-3′，具有最佳干擾效率。再將siRNA-CDH17用上述方法和試劑盒分別轉(zhuǎn)染入MKN-45細(xì)胞。細(xì)胞轉(zhuǎn)染48 h后用于實(shí)驗(yàn)，細(xì)胞活性由臺(tái)盼藍(lán)染色鑒定。

1.2.3 細(xì)胞免疫熒光染色 分別將轉(zhuǎn)染與非轉(zhuǎn)染MKN-45細(xì)胞接種于蓋玻片上，以SABC法進(jìn)行免疫熒光染色。4%多聚甲醛固定后，以0.1%Triton-x-100對(duì)細(xì)胞膜打孔15 min，30%過(guò)氧化氫與甲醇混合浸泡60 min以滅活內(nèi)源性過(guò)氧化物酶，洗滌后以5%牛血清清蛋白封閉60 min，分別加入CDH17和TGF-β一抗(1∶100)，4℃濕盒內(nèi)孵育過(guò)夜。再滴加生物素化二抗室溫孵育20 min后加入異硫氰酸熒光素(FITC)標(biāo)記的SABC熒光反應(yīng)液室溫孵育20 min，脫水，透明，封片，熒光顯微鏡觀察。

1.2.4 ELISA 收集上述各組細(xì)胞培養(yǎng)上清液，按TGF-β ELISA試劑盒說(shuō)明測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)曲線后加樣，每孔終體積50 μL。用封板膜封板后置37 ℃溫育30 min后甩干、洗滌，重復(fù)5次，拍干。每孔加入酶標(biāo)試劑50 μL，空白孔除外，重復(fù)上述步驟5次，拍干。每孔加入顯色劑A 50 μL，再加入顯色劑B 50 μL，輕輕振蕩混勻，37 ℃避光顯色15 min。每孔加終止液50 μL，終止反應(yīng)，最后以空白孔凋零，450 nm波長(zhǎng)依序測(cè)量各孔的吸光度。

1.2.5 Western blot 將轉(zhuǎn)染siRNA-空載體組細(xì)胞預(yù)先用SIS3(10 μmol/L)孵育24 h，然后同上述轉(zhuǎn)染和未轉(zhuǎn)染細(xì)胞洗滌加入蛋白裂解液提取總蛋白。蛋白定量后，煮沸變性后按每孔30 μg上樣，經(jīng)12%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(DS-PAGE)凝膠電泳后轉(zhuǎn)移至PVDF膜，以5%脫脂奶粉封閉60 min，分別加入TGF-β(1∶1 000)、p-Smad3(1∶1 000)和t-Smad3(1∶1 000)及β-actin(1∶1 000)一抗4 ℃孵育過(guò)夜，二抗室溫孵育1 h后，采用ECL，以Bio-Rad熒光成像系統(tǒng)顯影。目的蛋白表達(dá)以β-actin作為參照相對(duì)定量。

1.2.6 Transwell侵襲實(shí)驗(yàn) 將上述經(jīng)SIS3孵育的細(xì)胞及轉(zhuǎn)染和未轉(zhuǎn)染細(xì)胞按1×105/孔接種于鋪有去細(xì)胞因子基質(zhì)膠的24孔Transwell嵌套(濾膜孔徑為8 μm)中，上室加入不含血清的高糖DMEM培養(yǎng)基，下室均加入含10%胎牛血清的完全培養(yǎng)基，孵育8 h后，蘇木素染色，顯微鏡下計(jì)數(shù)穿膜細(xì)胞。

2 結(jié) 果

2.1 siRNA-CDH17轉(zhuǎn)染對(duì)TGF-β表達(dá)的影響 細(xì)胞免疫熒光顯示轉(zhuǎn)染siRNA-CDH17后，MKN-45細(xì)胞CDH17及TGF-β表達(dá)明顯下降，Western blot也顯示沉默CDH17表達(dá)后，TGF-β表達(dá)也明顯減少。轉(zhuǎn)染siRNA-vector(空載體)組與未轉(zhuǎn)染對(duì)照組TGF-β呈現(xiàn)相對(duì)高表達(dá)，二者間表達(dá)水平比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖1)。

A:免疫熒光染色；B：Western blot；C：Western blot相對(duì)定量。a:P<0.05

圖1 siRNA-CDH17轉(zhuǎn)染對(duì)TGF-β表達(dá)的影響

2.2 siRNA-CDH17轉(zhuǎn)染對(duì)TGF-β分泌的影響 ELISA檢測(cè)顯示，轉(zhuǎn)染siRNA-CDH17，沉默MKN-45細(xì)胞CDH17表達(dá)后，其培養(yǎng)上清液中TGF-β水平明顯降低[(510±55)pg/mLvs.(115±20) pg/mL,P<0.05]，而轉(zhuǎn)染siRNA-vector組與未轉(zhuǎn)染組上清液中TGF-β水平相對(duì)較高，兩組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義[(510±55)pg/mLvs.(485±38) pg/mL,P>0.05]。

2.3 siRNA-CDH17轉(zhuǎn)染對(duì)TGF-β/Smad3信號(hào)通路活化的影響 轉(zhuǎn)染siRNA-CDH17，沉默CDH17表達(dá)后，胃癌MKN-45細(xì)胞Smad3磷酸化水平較未轉(zhuǎn)染組明顯下降(P<0.05)，而轉(zhuǎn)染siRNA-vector組與未轉(zhuǎn)染組細(xì)胞Smad3磷酸化水平較高，兩組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。而TGF-β/Smad3信號(hào)通路抑制劑SIS3可明顯減少siRNA-vector組的Smad3磷酸化水平(P<0.05)，見(jiàn)圖2。

A：Western blot；B：Western blot相對(duì)定量。a:P<0.05

圖2 siRNA-CDH17轉(zhuǎn)染對(duì)TGF-β/Smad3信號(hào)通路活化的影響

2.4 TGF-β/Smad3信號(hào)通路對(duì)MKN-45細(xì)胞侵襲性的影響 Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)檢測(cè)顯示，較未轉(zhuǎn)染組(9 525±1 000)及siRNA-vector組(9 525±1 000)，siRNA-CDH17轉(zhuǎn)染(2 650±410)及應(yīng)用SIS3處理(3 800±525)均可明顯減少胃癌MKN-45細(xì)胞的侵襲數(shù)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

3 討 論

前期研究發(fā)現(xiàn)CDH17表達(dá)可誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞向間質(zhì)細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化，提示上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化可能在CDH17調(diào)控胃癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移、侵襲中發(fā)揮作用。因此探討上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化相關(guān)信號(hào)機(jī)制與CDH17侵襲調(diào)控間的關(guān)系，有助于進(jìn)一步闡明胃癌侵襲調(diào)控的信號(hào)生物學(xué)機(jī)制。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)檢測(cè)CDH17對(duì)胃癌細(xì)胞TGF-β產(chǎn)生和TGF-β/Smad3信號(hào)通路活化的影響，以及TGF-β/Smad3信號(hào)活化在胃癌細(xì)胞侵襲中的作用，探討TGF-β及其相關(guān)信號(hào)通路在CDH17調(diào)控胃癌細(xì)胞侵襲性中的可能作用及機(jī)制。

本研究發(fā)現(xiàn)在胃癌細(xì)胞高表達(dá)CDH17時(shí)，細(xì)胞TGF-β的表達(dá)及分泌均較高，而抑制CDH17表達(dá)后，TGF-β的表達(dá)及分泌均明顯減少，提示CDH17可能對(duì)胃癌細(xì)胞TGF-β的自分泌發(fā)揮作用。盡管CDH17是鈣黏蛋白家族成員，通常被作為下游蛋白受上游分子信號(hào)調(diào)節(jié)。但近來(lái)研究表明，采用siRNA干擾技術(shù)，抑制CDH17的基因表達(dá)，可抑制上游β-catenin/Wnt和Ras/MEK信號(hào)通路活化，進(jìn)而影響胃癌細(xì)胞的侵襲[5-6]。本研究則發(fā)現(xiàn)，CDH17高表達(dá)伴隨的TGF-β高表達(dá)可增加Smad3磷酸化水平，而沉默CDH17表達(dá)后，在TGF-β產(chǎn)生減少的同時(shí)，Smad3磷酸化水平也顯著下降，表明CDH17也可介導(dǎo)上游TGF-β/Smad3信號(hào)通路活化，進(jìn)而促進(jìn)胃癌細(xì)胞侵襲。

TGF-β/Smad3信號(hào)通路在介導(dǎo)上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)中發(fā)揮最重要功能[7]。而EMT通過(guò)細(xì)胞表型向間質(zhì)轉(zhuǎn)化，使細(xì)胞高表達(dá)基質(zhì)金屬蛋白酶，從而易于分解細(xì)胞外基質(zhì)，利于細(xì)胞遷移；同時(shí)通過(guò)間質(zhì)轉(zhuǎn)化本身，細(xì)胞內(nèi)骨架重排，遷移能力增強(qiáng)也有利于細(xì)胞遷移力及侵襲性增強(qiáng)[8]。前期研究證實(shí)，CDH17可通過(guò)誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞EMT促進(jìn)其侵襲。本研究也發(fā)現(xiàn)，Smad3磷酸化水平與胃癌細(xì)胞侵襲性相關(guān)，無(wú)論抑制CDH17表達(dá)或直接抑制Smad3活化均可顯著減少胃癌細(xì)胞侵襲。進(jìn)一步證實(shí)TGF-β/Smad3信號(hào)通路可能通過(guò)誘導(dǎo)EMT在介導(dǎo)胃癌細(xì)胞侵襲性中發(fā)揮重要作用。

本研究發(fā)現(xiàn)為CDH17在調(diào)節(jié)胃癌細(xì)胞侵襲性中的作用提供了又一新的分子細(xì)胞生物學(xué)機(jī)制，較以往的研究不僅關(guān)注分子信號(hào)機(jī)制本身，結(jié)合前期研究更進(jìn)一步揭示分子信號(hào)與侵襲終效應(yīng)間的細(xì)胞生物學(xué)行為聯(lián)系。但由于β-catenin/Wnt和Ras/MEK等信號(hào)通路也在CDH17介導(dǎo)的胃癌細(xì)胞侵襲中發(fā)揮重要作用，且細(xì)胞信號(hào)本身存在多種信號(hào)交聯(lián)機(jī)制。因此進(jìn)一步深入探尋信號(hào)交聯(lián)分子在其中的作用，更有助于進(jìn)一步闡明胃癌細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移機(jī)制。同時(shí)CDH17介導(dǎo)上游信號(hào)通路的活化調(diào)節(jié)是直接作用還是需要中間分子機(jī)制參與是下一個(gè)研究目標(biāo)。

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Study on role of CDH17 regulating TGF-β autocrine for affecting invasion of gastric cancer cells*

LuXin,MengQingbin,ShaoYongsheng△

(DepartmentofGastrointestinalSurgery,WuhanMunicipalNo.1Hospital,Wuhan,Hubei430022,China)

Objective To explore the role and possible mechanism of transforming growth factor (TGF)-β autocrine in CDH17 regulating invasion of gastric cancer cells.Methods Construction and transfection of siRNA-CDH17 into MKN-45 gastric cancer cell line to silence the expression of CDH17.Expression of TGF-β and concentrations of TGF-β in supernatants were detected before and after CDH17 silence by immunofluorescence,immunoblotting and ELISA.The autocrine situation of TGF-β was observed.Meanwhile,the activation of TGF-β/Smad3 signaling pathway was also detected by immunoblot.After giving signaling pathway inhibitor,the changes of invasion ability of MKN-45 cells were observed by Transwell invasion experiment.The role of TGF-β autocrine and related signaling pathway activation in CDH17-regulated invasion of gastric cancer cells was evaluated.Results After transfecting siRNA-CDH17 for silencing CDH17 expression in MKN-45 cells,the expression of TGF-β was significantly decreased compared with non-transfection group,its concentration in supernatants was also significantly reduced[(510±55)pg/mLvs. (115±20) pg/mL,P<0.01].The immunoblots revealed that phosphorylation level of Smad3 after CDH17 silence was also significantly diminished.However,giving the TGF-β/Smad3 signaling inhibitor SIS3 (10 μmol/L) could also suppress the phosphorylation level of Smad3 when CDH17 was highly expressed,meanwhile silencing CDH17 and inhibiting Smad3 phosphorylation could significantly decrease the invasion of MKN-45 gastric cancer cells (P<0.05).Conclusion CDH17 could participate in the invasion of gastric cancer cells by promoting TGF-β autocrine to activate TGF-β/Smad3 signaling pathway.

stomach neoplasms;neoplasm invasiveness;transforming growth factor -β;CDH17;signaling pathway

2015年武漢市衛(wèi)生和計(jì)劃生育委員會(huì)科研項(xiàng)目(WX15C31).

盧昕(1971-)，副主任醫(yī)師，博士，主要從事胃腸腫瘤分子生物學(xué)研究。

△通信作者，E-mail:shaoyongsheng1211@medmail.com.cn。

10.3969/j.issn.1671-8348.2017.24.003

R735.2

A

1671-8348(2017)24-3321-03

2016-12-19

2017-03-07)