哈尼克孜·吐爾遜，古再麗努爾·麥麥提圖爾蓀，木合布力·阿布力孜，馬依努爾·艾肯，祖菲婭·艾力△

(1.新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院婦科，烏魯木齊 830054；2.新疆維吾爾自治區(qū)喀什地區(qū)第二人民 醫(yī)院婦產(chǎn)科 844000；3.新疆醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，烏魯木齊 830011； 4.新疆維吾爾自治區(qū)第二人民醫(yī)院婦科，烏魯木齊 830054)

論著·基礎(chǔ)研究

異甘草素誘導(dǎo)人宮頸癌細(xì)胞增殖的影響及作用機(jī)制的研究*

哈尼克孜·吐爾遜1，古再麗努爾·麥麥提圖爾蓀2，木合布力·阿布力孜3，馬依努爾·艾肯4，祖菲婭·艾力2△

(1.新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院婦科，烏魯木齊 830054；2.新疆維吾爾自治區(qū)喀什地區(qū)第二人民 醫(yī)院婦產(chǎn)科 844000；3.新疆醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，烏魯木齊 830011； 4.新疆維吾爾自治區(qū)第二人民醫(yī)院婦科，烏魯木齊 830054)

目的 研究異甘草素(ISL)抑制宮頸癌Hela細(xì)胞增殖作用及促進(jìn)細(xì)胞凋亡的作用機(jī)制。方法 采用0.025、0.050、0.100、0.200、0.300、0.400 mg/mL濃度ISL處理HeLa細(xì)胞，采用四甲基偶氮唑鹽(MTT)比色法檢測(cè)HeLa細(xì)胞增殖；采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)HeLa細(xì)胞凋亡情況；應(yīng)用羅丹明123染色法檢測(cè)HeLa細(xì)胞線粒體跨膜電位的變化；采用RT-PCR檢測(cè)6種不同濃度ISL對(duì)Bcl-2、P53、P21、E6 mRNA基因表達(dá)的影響。結(jié)果 (1)MTT檢測(cè)結(jié)果顯示：隨著ISL濃度增加，對(duì)不同時(shí)間段HeLa細(xì)胞的抑制作用明顯增加(P<0.05)；(2)流式細(xì)胞儀檢測(cè)：相比于空白對(duì)照組，隨著ISL濃度逐漸增加，Hela細(xì)胞凋亡率明顯升高(P<0.01)，且凋亡率呈劑量依賴性；(3)羅丹明123熒光染色檢測(cè)結(jié)果：隨著ISL濃度逐漸增加，細(xì)胞線粒體膜電位下降(P<0.01)；(4)RT-PCR結(jié)果顯示：隨著ISL濃度逐漸增加，E6、Bcl-2 mRNA表達(dá)水平明顯降低(P<0.05)，而P53、p21 mRNA表達(dá)水平越升高(P<0.05)。結(jié)論 ISL通過下調(diào)E6、Bcl-2的表達(dá)和上調(diào)P21、P53基因的表達(dá)來抑制宮頸癌細(xì)胞的增殖。

宮頸腫瘤；Hela細(xì)胞；細(xì)胞凋亡；異甘草素

子宮頸癌(簡(jiǎn)稱宮頸癌)為常見婦科惡性腫瘤，是威脅女性生殖系統(tǒng)健康的主要疾病之一，主要發(fā)病年齡為50歲左右[1]。研究數(shù)據(jù)顯示，全世界每年新發(fā)宮頸癌患者人數(shù)為46.5萬，而我國宮頸癌每年新發(fā)病例數(shù)超過13萬，且每年死于宮頸癌的患者占據(jù)女性癌癥死亡人數(shù)第2位[2]。異甘草素(2,2,4-三羥基查耳酮，isoliquiritigenin,ISL)是甘草黃酮的一種查耳酮類化合物，是甘草黃酮中主要活性成分之一。近年來研究報(bào)道顯示，ISL對(duì)肺癌、前列腺癌、結(jié)直腸癌等腫瘤具有明顯的抑制作用，其主要通過抑制細(xì)胞周期誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡來發(fā)揮作用[3]。而少見國內(nèi)關(guān)于ISL對(duì)宮頸癌的研究報(bào)道，通過本次實(shí)驗(yàn)探討ISL對(duì)宮頸癌Hela細(xì)胞的增殖抑制作用及凋亡機(jī)制，為腫瘤化療及生物治療提供新的思路及策略。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞株 體外培養(yǎng)宮頸癌細(xì)胞株HeLa 細(xì)胞(HPV18+，野生型p53)均購于中國典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC)。

1.2 方法

1.2.1 相關(guān)藥品與試劑 ISL由新疆醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)室合成并提供；高糖DMEM培養(yǎng)基(美國HyClone公司)；胎牛血清(FBS，美國Gibco公司)；胰蛋白酶(T-EDTA，美國HyClone公司)；磷酸鹽緩沖液(PBS，美國HyClone公司)；雙抗(美國HyClone公司)；四甲基偶氮唑鹽 (MTT，美國Sigma公司)；二甲基亞砜 (DMSO，美國Sigma公司)；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(美國Thermo公司)；PCR 引物(上海生工生物技術(shù)有限公司)；羅丹明123(美國Sigma公司)；AnnexinⅤ 細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒Ⅰ試劑盒(美國BD公司)。

1.2.2 Hela細(xì)胞培養(yǎng) 將細(xì)胞用完全培養(yǎng)液(44.5 mL高糖DMEM+5 mL FBS+0.5 mL 雙抗)培養(yǎng)在37 ℃,5% CO2恒溫培養(yǎng)箱中，倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)、貼壁及融合等狀態(tài)，一般在2～3 d進(jìn)行傳代。

1.2.3 MTT實(shí)驗(yàn) 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的Hela細(xì)胞，進(jìn)行消化、離心操作，重懸細(xì)胞并調(diào)整細(xì)胞數(shù)目為1×105個(gè)/毫升，然后接種于96孔培養(yǎng)板，每孔200 μL，培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后將配置好的不同濃度ISL(0.025、0.050、0.100、0.200、0.300、0.400 mg/mL)加入培養(yǎng)板中，設(shè)立空白組(僅細(xì)胞培養(yǎng)液)及陽性組(0.025 mg/mL順鉑)，每組設(shè)5個(gè)復(fù)孔，分別培養(yǎng)24、48、72 h。每孔中加入5 mg/mL 20 μL MTT溶液，37 ℃ 避光孵育4 h，去除溶液后，加入150 μL DMSO，室溫下振蕩，在酶標(biāo)儀上選用490 nm測(cè)定吸光度值。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取3次實(shí)驗(yàn)的平均值作為實(shí)驗(yàn)結(jié)果，以不同濃度ISL為X軸，細(xì)胞數(shù)量為Y軸繪制細(xì)胞生長(zhǎng)抑制曲線。利用計(jì)算公式計(jì)算不同濃度各個(gè)時(shí)間段藥物對(duì)Hela細(xì)胞增殖的抑制率，得出最佳時(shí)間段最佳藥物濃度。其中抑制率(%)=(空白組-不同濃度ISL處理組)/空白組×100%。

1.2.4 按AnnexinⅤ 細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒Ⅰ試劑盒說明書進(jìn)行操作，用流式細(xì)胞儀上機(jī)檢測(cè)。

1.2.5 ISL誘導(dǎo)Hela細(xì)胞凋亡的線粒體跨膜電位的變化 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的Hela細(xì)胞2×106個(gè)接種于6孔板中藥物干預(yù)后，進(jìn)行以下操作:(1)換液；(2)收集細(xì)胞；(3)加1 mL羅丹明123染色液(終濃度0.01 mg/mL)染色，避光孵育30 min；(4)離心后洗滌細(xì)胞2次；(5)再加入0.5 mL PBS懸浮細(xì)胞后，直接用流式細(xì)胞儀上機(jī)檢測(cè)。

1.2.6 RT-PCR檢測(cè)藥物對(duì)Hela細(xì)胞相關(guān)凋亡基因表達(dá)水平影響 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的Hela細(xì)胞，進(jìn)行消化、離心操作，重懸細(xì)胞并調(diào)整細(xì)胞數(shù)目為1×106個(gè)/毫升，然后接種于培養(yǎng)皿中，培養(yǎng)24 h貼壁后各個(gè)組加藥提取總RNA進(jìn)行RT-PCR。(1)提取總RNA。(2)定量總RNA。(3)逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)：按照Postscript Ⅱ First-strand cDNA Synthesis Mix試劑盒操作說明進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄。(4)RT-PCR檢測(cè)HPV16 E6、Bcl-2、P21、P53及內(nèi)參β-actin基因，每份樣品設(shè)3個(gè)復(fù)孔，反應(yīng)條件：①E6反應(yīng)條件，逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物95 ℃預(yù)變性3 min，95 ℃變性30 s，55 ℃退火60 s，72 ℃延伸10 s，共40個(gè)循環(huán)，72 ℃延伸10 min；②Bcl-2反應(yīng)條件，逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物95 ℃預(yù)變性3min，95 ℃變性30s，54 ℃退火30 s，72 ℃延伸10 s共40個(gè)循環(huán),72 ℃延伸10 min；③P53反應(yīng)條件，逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物95 ℃預(yù)變性3 min，95 ℃變性30 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸10 s，共40個(gè)循環(huán)，72 ℃延伸10 min；④β-actin反應(yīng)條件，逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物95 ℃預(yù)變性3 min，95 ℃變性30 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸10 s，共40個(gè)循環(huán),72 ℃延伸10 min；⑤P21反應(yīng)條件，逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物95 ℃預(yù)變性3 min，95 ℃變性30 s，54 ℃退火30 s，72 ℃延伸10 s，共40個(gè)循環(huán)，72 ℃延伸10 min。利用系統(tǒng)自帶軟件分析各基因溶解曲線、起峰曲線及Ct值，根據(jù)結(jié)果分析藥物對(duì)細(xì)胞基因表達(dá)的影響。

1.2.7 Western blot檢測(cè)藥物對(duì)Hela細(xì)胞相關(guān)蛋白表達(dá)水平影響 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞進(jìn)行消化、離心，細(xì)胞重懸后以1×106個(gè)/毫升細(xì)胞培養(yǎng)密度種植于培養(yǎng)瓶中，溫箱中培養(yǎng)24 h，待貼壁后加入0.025、0.050、0.100 mg/mL ISL和0.025 mg/mL順鉑干預(yù)24 h，蛋白裂解液裂解細(xì)胞后提取總蛋白，采用BSA法進(jìn)行蛋白質(zhì)定量，簡(jiǎn)單步驟如下：(1)提取總蛋白；(2)BAS法蛋白質(zhì)定量;(3)蛋白質(zhì)變性;(4)凝膠配制及電泳;(5)十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電流(SDS-PAGE)凝膠配制;(6)轉(zhuǎn)膜;(7)封閉;(8)一抗孵育;(9)二抗孵育;(10)顯色。

2 結(jié) 果

2.1 ISL對(duì)HeLa細(xì)胞生長(zhǎng)抑制作用 采用0.025、0.050、0.100、0.200、0.300、0.400 mg/mL ISL對(duì)Hela細(xì)胞進(jìn)行24 h、48 h、72 h處理后，結(jié)果顯示，隨著藥物濃度的升高及時(shí)間的延長(zhǎng)，抑制率越高。且作為陽性對(duì)照的順鉑對(duì)細(xì)胞也具有明顯的增殖抑制作用(表1)。

表1 不同濃度ISL對(duì)Hela細(xì)胞不同時(shí)間的抑制率

a：P<0.05，與空白組比較；b：P<0.05，與陽性組比較。

2.2 Hela細(xì)胞凋亡率檢測(cè)結(jié)果 從凋亡結(jié)果可知：空白組早期凋亡率只有5.4%，0.025、0.050、0.100 mg/mL ISL藥物與順鉑0.025 mg/mL作用細(xì)胞后早期凋亡率分別為19.13%、25.43%、56.63%、51.27%，與空白組相比凋亡率明顯增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。見圖1。

2.3 ISL誘導(dǎo)Hela細(xì)胞凋亡的線粒體跨膜電位的變化結(jié)果 不同濃度的藥物干預(yù)Hela細(xì)胞后空白組線粒體膜電位熒光強(qiáng)度為6 255.3%，而藥物組0.025、0.050、0.100 mg/mL分別為4 180.0%、3 328.3%、346.0%，陽性組為1 238.7%，與空白組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。見圖2。

2.4 RT-PCR檢測(cè)藥物對(duì)Hela細(xì)胞相關(guān)凋亡基因表達(dá)的影響 藥物干預(yù)Hela細(xì)胞24 h后相關(guān)基因中E6和Bcl-2基因隨著劑量的增加，基因表達(dá)下調(diào)；P53和P21基因隨著藥物劑量的增加，基因表達(dá)反而上調(diào)。見圖3。

2.5 Western blot檢測(cè)藥物對(duì)宮頸癌細(xì)胞P53、P21 及Bcl-2蛋白表達(dá)影響結(jié)果 Bcl-2蛋白藥物表達(dá)與空白組相比較，隨著ISL藥物濃度增加，蛋白表達(dá)水平逐漸降低，P53與P21蛋白的藥物組表達(dá)與空白組相比較，隨著ISL藥物濃度增加，蛋白表達(dá)逐漸升高。見圖4、5。

圖1 各個(gè)濃度藥物干預(yù)Hela細(xì)胞后凋亡率

圖2 ILG對(duì)Hela細(xì)胞線粒體膜電位的影響(羅丹明123標(biāo)記)

a：P<0.01,b：P<0.05，與空白組比較；c：P<0.01，d：P<0.05，與陽性組比較

圖3 各個(gè)濃度藥物對(duì)Hela細(xì)胞凋亡基因的影響(n=3)

圖4 SL對(duì)相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

a：P<0.01,b：P<0.05，與空白組比較；c：P<0.01，d：P<0.05，與陽性組比較

圖5 ISL對(duì)相關(guān)蛋白表達(dá)影響的灰度值(n=3)

3 討 論

MTT為黃色化合物，是一種接受氫離子的熒光染料，能夠被活細(xì)胞體內(nèi)琥珀酸脫氫酶還原為不溶于水的藍(lán)紫色結(jié)晶甲瓚(Formazan)并沉積在細(xì)胞中，而凋亡細(xì)胞喪失細(xì)胞中琥珀酸脫氫酶消失，不能將MTT還原成藍(lán)紫色結(jié)晶，而采用DMSO溶解細(xì)胞中的甲瓚，用酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀在490 nm波長(zhǎng)處測(cè)定其吸光度值，可間接反映活細(xì)胞數(shù)量[4]。且活細(xì)胞數(shù)量越多，生成藍(lán)紫色結(jié)晶越多，檢測(cè)的吸光度值就越大，活細(xì)胞數(shù)量少，生成紫色結(jié)晶少，吸光度值越小，MTT結(jié)晶形成的量與細(xì)胞數(shù)成正比。因此，MTT法能夠間接反映活細(xì)胞數(shù)及細(xì)胞生長(zhǎng)活性，具有靈敏度高、操作簡(jiǎn)便、經(jīng)濟(jì)、快速等優(yōu)點(diǎn)，被廣泛用于生物活性因子、細(xì)胞毒性的檢測(cè)[5]。本研究結(jié)果顯示，隨著ISL濃度增加對(duì)Hela細(xì)胞增殖抑制作用逐漸增強(qiáng)，且呈現(xiàn)出時(shí)間和劑量依賴性效應(yīng)。

細(xì)胞凋亡是生物界廣泛存在的一種基本生命現(xiàn)象，是指細(xì)胞在一定生理或病理?xiàng)l件下，受內(nèi)在遺傳機(jī)制控制自動(dòng)結(jié)束生命的過程，細(xì)胞凋亡受凋亡相關(guān)基因調(diào)控，又稱為細(xì)胞程序性死亡。近年來，有學(xué)者發(fā)現(xiàn)，機(jī)體內(nèi)細(xì)胞凋亡機(jī)制的發(fā)生和進(jìn)行受到精確調(diào)控，各種凋亡信號(hào)通過相應(yīng)的信號(hào)傳導(dǎo)通路傳遞到相關(guān)細(xì)胞核內(nèi)的相關(guān)靶基因，靶基因通過表達(dá)相關(guān)蛋白引起細(xì)胞凋亡，細(xì)胞凋亡對(duì)腫瘤起著負(fù)調(diào)作用，而細(xì)胞凋亡的調(diào)控過程發(fā)生紊亂會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞代謝紊亂，從而導(dǎo)致腫瘤惡性增殖的發(fā)生[6]。本研究結(jié)果顯示，將通過AnnexinⅤ-FITC和PI雙標(biāo)記法用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡可得到。因此得知，藥物濃度與凋亡的發(fā)生呈正相關(guān)，隨著藥物濃度增加，Hela細(xì)胞出現(xiàn)致密濃染的凋亡細(xì)胞增多，早期凋亡率明顯升高，說明ISL誘導(dǎo)宮頸癌Hela細(xì)胞凋亡。

細(xì)胞膜電位和細(xì)胞凋亡有著密不可分的關(guān)系，細(xì)胞凋亡的過程中往往伴隨著線粒體跨膜電位的破壞，這被廣泛認(rèn)為是細(xì)胞凋亡過程中最早發(fā)生的事件之一。有研究報(bào)道，在ISL誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的可能機(jī)制為，線粒體膜電位的耗散觸發(fā)細(xì)胞色素C的釋放和半胱天冬酶的活化[7-9]。Yuan等[10]研究報(bào)道顯示，ISL主要是通過改變細(xì)胞線粒體跨膜電位的變化來誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。本研究結(jié)果顯示，ISL能夠降低Hela細(xì)胞線粒體跨膜電位穩(wěn)定性，從而誘導(dǎo)線粒體介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，且隨著ISL濃度增加，凋亡程度顯著增加。ISL藥物濃度越增加，羅丹明123熒光強(qiáng)度越明顯下降，膜電位下降百分比也下降，表明ISL以濃度依賴方式降低HeLa細(xì)胞線粒體跨膜電位。

宮頸癌細(xì)胞中腫瘤抑制因子P53表達(dá)以野生型為主，P53在不同的刺激下分別調(diào)節(jié)細(xì)胞周期或者細(xì)胞凋亡，通過轉(zhuǎn)錄活化相關(guān)靶基因，如P21、Bax、P53DINP1等，其作為一種重要抑癌基因與細(xì)胞生長(zhǎng)、分化及死亡的生物調(diào)控具有密切聯(lián)系[11-12]。HPV早期編碼區(qū)E6、E7基因表達(dá)E6、E7蛋白是致癌的關(guān)鍵，其中E6蛋白能夠與E6相關(guān)蛋白介導(dǎo)與抑癌蛋白P53結(jié)合，經(jīng)過泛素途徑使其降解，阻止細(xì)胞凋亡，導(dǎo)致細(xì)胞向惡性增殖發(fā)展；而E7蛋白能夠結(jié)合細(xì)胞周期相關(guān)負(fù)向調(diào)節(jié)因子P21和P16，導(dǎo)致其失活抑制細(xì)胞生長(zhǎng)，造成細(xì)胞周期紊亂，引起細(xì)胞無限增殖并向惡性轉(zhuǎn)化，最終導(dǎo)致子宮頸癌的發(fā)生[13]。本研究結(jié)果顯示：隨著ISL藥物濃度的增加，p53、p21表達(dá)增加或者恢復(fù)功能，抑制E6、Bcl-2的表達(dá)，并呈現(xiàn)劑量依賴性效應(yīng)。

綜上所述，ISL藥物能夠通過引起線粒體膜電位變化來誘導(dǎo)宮頸癌細(xì)胞凋亡，同時(shí)ISL還可以降低Hela細(xì)胞中E6癌基因、Bcl-2基因表達(dá)，增加P53、P21基因表達(dá)來促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡，為進(jìn)一步明確ISL的抗腫瘤活性和抗癌候選藥物的篩選提供理論基礎(chǔ)。

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Effect and mechanism of isoquiritigenin on proliferation of human cervical cancer cells*

Hanikezi·Tuerxun1,Guzainuer·Maimaitituersun2,Mourboul·Ablise3,Mayinuer·Aiken4,Zufeiya·Aili2△

(1.DepartmentofGynecology,FirstAffiliatedHospital,XinjiangMedicalUniversity,Urumqi,Xinjiang830054,China;2.KashiAreaSecondPeople′sHospital,Kashi,Xinjiang844000,China； 3.CollegeofPharmacy,XinjiangMedicalUniversityUrumqi,Xinjiang830011,China; 4.DepartmentofGynecology,SecondPeople′sHospitalofXinjiangAutonomousRegion,Urumqi,Xinjiang830054,China)

Objective To study the effects and mechanism of isoquiritigenin (ISL) in inhibiting the proliferation and promoting the apoptosis of cervical cancer HeLa cells.Methods HeLa cells were treated with ISL of 0.025,0.050,0.100,0.200,0.300 and 0.400 mg/mL.The proliferation of HeLa cells was detected by MTT colorimetric assay,and the apoptosis of HeLa cells was detected by flow cytometry.Changes of mitochondrial transmembrane potential in HeLa cells were detected by rhodamine 123 staining method.RT-PCR was used to detect the effect of 6 different concentrations of ISL on the expression of Bcl-2,P53,P21 and E6mRNA genes.Results (1) MTT test showed that with the increase of ISL concentration,the inhibitory effect on HeLa cells in different time periods increased significantly (P<0.05).(2) Flow cytometry showed that compared with the blank control group,with the increase of ISL concentration,the apoptosis rate of Hela cells increased significantly (P<0.01),and the apoptosis rate was dose-dependent.(3) Rhodamine 123 fluorescence staining showed that with the increase of ISL concentration,the mitochondrial membrane potential decreased (P<0.01).(4) RT-PCR showed that the expression levels of E6 and Bcl-2 mRNA decreased significantly (P<0.05),and the expression levels of P53 and p21mRNA increased (P<0.05) with the increase of ISL concentration.Conclusion ISL can inhibit the proliferation of cervical cancer cells by down regulating the expression of E6 and Bcl-2 and up regulating the expression of P21 and P53 genes.

Cervical neoplasms;HeLa cells;apoptosis;isoquiritigenin

新疆維吾爾自治區(qū)自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(2014211C064)。

哈尼克孜·吐爾遜(1975-)，副主任醫(yī)師，碩士，主要從事婦科腫瘤方面的研究。

△通信作者，E-mail:2428157641@qq.com。

10.3969/j.issn.1671-8348.2017.24.004

R711.74

A

1671-8348(2017)24-3324-04

2017-01-11

2017-03-21)