李星軍，張瑜芬，李 鋒△，朱小華，黃 嵐

(1.上海交通大學醫(yī)學院附屬新華醫(yī)院崇明分院檢驗科，上海 202150； 2.復旦大學附屬華山醫(yī)院皮膚科，上海 200040)

·論 著·

負向免疫調(diào)節(jié)分子TIPE2調(diào)控巨噬細胞亞型治療狼瘡小鼠的研究

李星軍1，張瑜芬2，李 鋒2△，朱小華2，黃 嵐2

(1.上海交通大學醫(yī)學院附屬新華醫(yī)院崇明分院檢驗科，上海 202150； 2.復旦大學附屬華山醫(yī)院皮膚科，上海 200040)

目的 探討腫瘤壞死因子誘導蛋白8樣因子-2(TIPE2)調(diào)控系統(tǒng)性紅斑狼瘡(SLE)巨噬細胞極化的作用和對實驗狼瘡小鼠的治療作用。方法 將小鼠分別用活化淋巴細胞來源的DNA(ALD-DNA)誘導狼瘡小鼠模型，分為AAV-scr組和AAV-TIPE2組，從小鼠尾靜脈注射AAV-TIPE2或AAV-scr病毒溶液。檢測極化的巨噬細胞TIPE2 mRNA和蛋白表達、小鼠血清抗dsDNA抗體滴度、尿蛋白及腎病理指數(shù)。結(jié)果 (1)轉(zhuǎn)染AAV-TIPE2細胞的TIPE2 mRNA和蛋白表達水平分別是AAV-scr組的(13.5±1.6)倍和(10.8±1.6)倍；(2)AAV-TIPE2組M2巨噬細胞特異分子MGL+為59.6%，AAV-scr組MGL+細胞為8.4%；AAV-TIPE2與AAV-scr轉(zhuǎn)染的巨噬細胞M2/M1比值之比為16；(3)重組TIPE2基因的腺病毒相關(guān)載體在轉(zhuǎn)染HEK-293中穩(wěn)定表達，小鼠體內(nèi)外實驗證實AAV-TIPE2能誘導ALD-DNA狼瘡小鼠巨噬細胞向M2極化；(4)AAV-TIPE2組血清抗dsDNA抗體、尿蛋白及腎病理等活動指標明顯低于AAV-scr組(P<0.01)。結(jié)論 TIPE2誘導巨噬細胞極化為M2表型，緩解ALD-DNA誘導狼瘡小鼠的病情，可以作為ALD-DNA誘導狼瘡小鼠的一種有前景的治療方法。

巨噬細胞；系統(tǒng)性紅斑狼瘡；腺病毒科；活化淋巴細胞來源的DNA；腫瘤壞死因子誘導蛋白8樣蛋白-2

系統(tǒng)性紅斑狼瘡(SLE)是最為典型，并且迄今為止仍然是難治的慢性自身免疫性疾病，其病因和發(fā)病機制尚未明了，治療仍然以糖皮質(zhì)激素和免疫抑制劑為主，其嚴重的不良反應威脅著SLE患者的生命健康?；?、性激素、感染和免疫功能異常一直是SLE病因?qū)W研究的幾個重要方面。免疫功能異常是影響SLE發(fā)生、發(fā)展的重要因素之一。巨噬細胞極化是近幾年免疫學研究熱點，筆者前期研究結(jié)果顯示，骨髓來源的單核細胞體外誘導分化M2，M2回輸活化淋巴細胞來源的DNA(ALD-DNA)狼瘡模型，可以減輕狼瘡小鼠病情活動指標、降低dsDNA抗體滴度、改善腎病理指標[1]。腫瘤壞死因子誘導蛋白8樣因子-2(TIPE2)是一種新發(fā)現(xiàn)的負性免疫調(diào)節(jié)蛋白，它調(diào)控Toll樣受體(TLR)的信號轉(zhuǎn)導，在固有免疫反應和適應性免疫反應中均發(fā)揮負性調(diào)節(jié)作用，這種作用可能與TIPE2調(diào)控巨噬細胞極化有關(guān)[2]。筆者構(gòu)建AAV-TIPE2載體，通過體外和體內(nèi)實驗，探討TIPE2促進SLE小鼠巨噬細胞極化及治療SLE小鼠，為進一步細胞生物學治療SLE打下基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 SPF級10周齡BALB/c雌性小鼠，復旦大學實驗動物科學部，許可證號：SYXK(滬)2014-0029。

1.2 方法

1.2.1 ALD-DNA制備 ConA活化或未活化小鼠脾細胞，S1核酸酶及蛋白酶K處理后，UltraPureTMgenomic DNA 純化試劑盒(Shanghai SBS Genetech,China)，按說明步驟提取ALD-DNA，DNA的A260/A280比值>1.8，260 nm分光光度計測定DNA濃度。

1.2.2 動物免疫 10只BALB/c小鼠分為AAV-TIPE2組和AAV-scr組(各5只)。分別給兩組小鼠皮下注射0.2 mL含ALD-DNA的磷酸鹽緩沖液(PBS)誘導狼瘡小鼠[1]。從兩組小鼠尾靜脈分別注射AAV-TIPE2或AAV-scr病毒溶液，每只小鼠注射AAV病毒數(shù)量為108PFU。免疫前和免疫后1、2、3和4周，分別取小鼠內(nèi)眥靜脈血和尿液。分離血清做dsDNA抗體和尿蛋白檢測。4周后，取小鼠腎做病理切片并消化分離巨噬細胞。

1.2.3 狼瘡性腎炎嚴重程度的評估 小鼠腎小球病理變化由有經(jīng)驗的病理醫(yī)師盲法評價，每只小鼠評估100個腎小球，6個等級6分。正常無病變評分0分；Ⅰ級：小范圍腎小球輕度腫脹，1分；Ⅱ級：小范圍腎小球中度腫脹，2分；Ⅲ級：中度腫脹，但受累濾管區(qū)小于或等于50%，3分；Ⅳ級：中度腫脹，但受累濾管區(qū)大于50%，4分；Ⅴ級：重度腫脹，多數(shù)腎單位均受累，外皮層也受累，5分；Ⅵ級：重度腫脹，多數(shù)腎單位受累，有疤痕形成，6分。

1.2.4 尿蛋白的測定 考馬斯亮藍法檢測[3]。

1.2.5 血清ssDNA、dsDNA滴度檢測 ELISA方法檢測[3]。

1.2.6 骨髓來源的單核巨噬細胞(BMDM)分離、培養(yǎng)和誘導分化 10周齡雌性小鼠，取BMDM，與FITC-F4/80抗體孵育，F(xiàn)CM分選陽性細胞，在DEME/F12培養(yǎng)，加入10 mmol/mL L-谷氨酰胺,100 U/mL青霉素,100 μg/mL鏈霉素和100 U/mL重組巨噬細胞集落刺激因子(M-CSF)，體外分化實驗如文獻[1，4]所述。

1.2.7 流式細胞儀(FACS)分選不同亞型巨噬細胞 貼壁培養(yǎng)的BMDM，用0.25% Trypsine solution分離，PBS清洗3次、重新懸浮，用異硫氰酸熒光素(FITC)-F4/80抗體和APC-MGL抗體,分選巨噬細胞、M1和M2亞型。數(shù)據(jù)通過Flowjo Software分析、定量[4]。

1.2.8 細胞培養(yǎng)和目標基因的轉(zhuǎn)染 人HEK293細胞(ATCC,Rockville,MD,USA)和小鼠巨噬細胞用DMEM培養(yǎng)基(DMEM,Invitrogen,Carlsbad,CA,USA)，加15%胎牛血清(FBS，Sigma-Aldrich,St Louis,MO,USA)在5%CO2，37 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)。HEK293和BMDA轉(zhuǎn)導AAV(血清型8)-pCMV-PITE2和AAV-pCMV-scr[5-6]。步驟為：選取基因文庫人TIPE2 cDNA(編號NM_001014039.1),前端和尾端分別加入EcoRⅠ和NheⅠ限制性酶切位點。亞克隆到帶有50-EcoRⅠ位點和尾端30-NheⅠ位點的pAAV-CMV-GFP質(zhì)粒載體(Clontech,Mountain View,CA,USA)，在TIPE2/scr和GFP基因之間構(gòu)建2A多肽-ORF-多個順向表達基因載體，2A多肽有利于高效、功能區(qū)蛋白組裝完成。3個質(zhì)粒共同轉(zhuǎn)染：包括pAAV-pCMV-TIPE2-GFP或?qū)φ誴AAV-pCMV-scr-GFP質(zhì)粒(Clontech,Mountain View,CA,USA),R2C8(包括AAV2 Rep和AAV8 cap基因)和plAd5(包括腺病毒輔助基因)(Applied Viromics,LLC.Fremont,CA,USA)通過Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑(Invitrogen)轉(zhuǎn)染到HEK293細胞，組裝合成帶有目標基因的AAV。病毒純化采用CsCl密度離心，滴度采用定量光密度斑點實驗定量。HEK293及原代小鼠巨噬細胞加入AAV(MOI為100)培養(yǎng)12 h。

1.2.9 實時定量PCR 巨噬細胞分選后，抽提RNA,合成cDNA，取1∶4稀釋的cDNA，進行實時定量PCR(Quantitect SyBr green PCR system，Qiagen)。引物為:TIPE2正向5′-GAC TGA CCA CAT ACC CCA CTC-3′，反向 5′-TCA CCA AAG CTA AGT GCC GT-3′；CD163正向5′-TCC ACA CGT CCA GAA CAG TC-3′，反向5′-CCT TGG AAA CAG AGA CAG GC-3′；CD206正向5′-CAG GTG TGG GCT CAG GTA GT-3′，反向5′-TGT GGT GAG CTG AAA GGT GA-3′；iNOS正向5′-CAG AGG ACC CAG AGA CAA GC-3′，反向5′-TGC TGA AAC ATT TCC TGT GC-3′；Arginase正向5′-GCT GTC TTC CCA AGA GTT GGG-3′，反向5′-ATG GAA GAG ACC TTC AGC TAC-3′；α-tubulin正向5′-CCA AGC TGG AGT TCT CTA-3′，反向5′-CAG AGT GCT CCA GG-3′。數(shù)據(jù)收集和分析采用2-△△Ct方法，定量mRNA 相對表達水平，先與α-tubulin 比值，再與對照比較。

2 結(jié) 果

2.1 轉(zhuǎn)染重組病毒細胞中TIPE2的過表達 制備AAV-TIPE2目標基因在CMV啟動子控制下，空白對照帶有無功能序列，兩個病毒都帶有GFP報告基因。病毒先感染HEK293細胞，通過FCM檢測GFP熒光，分離和純化轉(zhuǎn)導細胞。目標基因和對照基因AAV病毒顆粒轉(zhuǎn)染HEK293細胞,均能夠表達強GFP熒光(圖1A、B)。采用實時定量PCR和蛋白印跡檢測轉(zhuǎn)導細胞TIPE2的mRNA和蛋白表達水平，結(jié)果顯示其表達水平為AAV-scr對照的(13.5±1.6)倍和(10.8±1.6)倍(圖1C、D)。

A：FCM檢測細胞GFP熒光強度，并純化細胞；B：AAV-scr-和AAV-TIPE2組受感染細胞表達GFP強熒光；C：AAV-scr-和AAV-TIPE2-受感染細胞mRNA的表達；D:AAV-scr-和AAV-TIPE2-受感染細胞蛋白質(zhì)的表達

圖1 TIPE2- AAV過度表達載體的制備

2.2 TIPE2對體外培養(yǎng)的巨噬細胞極化的影響 用FCM分選狼瘡小鼠BMDM,獲得F4/80+細胞(圖2)，結(jié)果顯示，AAV-TIPE2組MGL+細胞為59.6%，MGL+/MGL-比值為1.44；而AAV-scr組MGL+細胞為8.4%，MGL+/MGL-比值為0.09。AAV-TIPE2組與AAV-scr組巨噬細胞M2/M1比值之比為16(圖2D)。RT顯示，M2表達CD163、CD206和Arginase等分子，M1表達iNOS分子(圖2E)。

2.3 AAV-TIPE2對狼瘡小鼠M2表達TIPE2 的影響 AAV-TIPE2處理小鼠F4/80雙陽性巨噬細胞TIPE2的mRNA和蛋白表達水平顯著高于AAV-scr處理組(8倍，圖3)。

2.4 AAV-TIPE2在狼瘡小鼠體內(nèi)促進巨噬細胞向M2極化 AAV-TIPE2處理狼瘡小鼠模型MGL+/F4/80+比值(40±10)明顯高于AAV-scr組的(8±2)，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。狼瘡小鼠模型體內(nèi)實驗也證實TIPE2可以誘導巨噬細胞向M2亞型極化。

2.5 AAV-TIPE2減輕狼瘡小鼠模型狼瘡病情活動指標 檢測狼瘡小鼠血清抗dsDNA抗體、尿蛋白及腎病理活動指標，結(jié)果顯示AAV-TIPE2組血清抗dsDNA抗體、尿蛋白及腎病理活動指標明顯低于AAV-scr組(表1)。

A：FCM分離的F4/80+巨噬細胞；B：培養(yǎng)純化的巨噬細胞；C：FCM檢測轉(zhuǎn)染AAV-TIPE2或AAV-scr的M2巨噬細胞特異性表達MGL分子；D：C圖的統(tǒng)計結(jié)果；E：實時定量PCR檢測M2表達分子CD163、CD206、Arginase和M1表達分子iNOS；a：P<0.05,n=5。

圖2 體外實驗證實TIPE2誘導巨噬細胞極化

A：實驗計劃圖；B：AAV-TIPE2-或AAV-scr-轉(zhuǎn)染F4/80+巨噬細胞的GFP熒光強度；C：ALD-DNA+AAV-scr- 和 ALD-DNA+AAV-TIPE2-轉(zhuǎn)染細胞TIPE2 mRNA表達水平；D：ALD-DNA+AAV-scr- 和 ALD-DNA+AAV-TIPE2-轉(zhuǎn)染細胞TIPE2 蛋白質(zhì)表達水平；a:AAV-TIPE2組與 AAV-scr 組比較P<0.05，n=10

圖3 AAV-TIPE2對狼瘡小鼠M2表達TIPE2的影響

3 討 論

巨噬細胞是機體的重要免疫細胞，具有吞噬、抗原遞呈和分泌多種細胞因子等功能，在病原微生物與衰老細胞的清除、促進炎性反應、適應性免疫反應的誘發(fā)及損傷組織重構(gòu)與修復過程中起關(guān)鍵作用。近年來，其在SLE等自身免疫性疾病的免疫調(diào)節(jié)方面的作用也受到了極大的關(guān)注。巨噬細胞大體可分為兩種類型，即M1和M2型。M1表達iNOS表型特征分子，并能夠高效遞呈抗原、高水平合成促炎細胞因子，是激活Th1細胞反應的效應細胞，具有抗病原微生物和腫瘤細胞的作用；M2巨噬細胞以CD163+、CD206+和Arginase+為其表型特征，抗原遞呈功能弱，特征為低表達白細胞介素(IL)-12、高表達IL-10，具有抑制Th1免疫反應，具有調(diào)節(jié)免疫反應的作用。

筆者前期采用ALD-DNA誘導狼瘡樣小鼠。取骨髓來源的單核細胞，F(xiàn)ACS分選F4/80+細胞，加入干擾素-γ(IFN-γ)或IL-4體外培養(yǎng)，通過特異性分子表達(M2特異性分子CD163、CD206、Arginase和M1特異性分子iNOS)篩選M1、M2。FACS和實時定量PCR檢測CD163、CD206、Arginase和iNOS表達[1，4]。純化的M2進行移植治療狼瘡小鼠結(jié)果顯示：(1)氯磷酸鹽清除巨噬細胞后，狼瘡模型小鼠病情加重，給M2治療后狼瘡活動指數(shù)和腎病理改變明顯改善。而單獨注射M1則不能改善狼瘡小鼠病情。(2)M2直接注射治療可減輕狼瘡模型小鼠病情。(3)M1過繼移植可以加重狼瘡模型小鼠病情活動指標[1]。

TIPE2可能是一種很強的M1/M2極化調(diào)節(jié)分子[7]，最新研究顯示TIPE2可抑制iNOS表達，阻止NO和氧自由基(ROS)產(chǎn)生，而抑制炎性反應。但它在SLE中的調(diào)節(jié)作用目前尚少見報道。帶著這個問題，應用已建立的ALD-DNA誘導的狼瘡小鼠模型，研究TIPE2對SLE巨噬細胞極化的影響，并進一步探討其治療作用及機制。為了驗證TIPE2促狼瘡小鼠M/M1向M2極化，設(shè)計了AAV-TIPE2-GFP病毒載體，通過體外和體內(nèi)實驗，結(jié)果顯示TIPE2基因的腺病毒相關(guān)載體在轉(zhuǎn)染HEK293中穩(wěn)定表達。在體外，TIPE2對體外培養(yǎng)的巨噬細胞，促進其M2分子CD163、CD206、Arginase表達，AAV-TIPE2處理小鼠GFP+P4/80+雙陽性巨噬細胞TIPE2的mRNA和蛋白表達水平顯著高于AAV-scr組。狼瘡小鼠模型體內(nèi)實驗證實M2巨噬細胞高表達TIPE2分子，同時也證實小鼠腎的巨噬細胞極化為表達MGL的M2亞型。AAV-TIPE2能誘導ALD-DNA狼瘡小鼠巨噬細胞向M2極化,并且改善狼瘡小鼠病情活動指標。本研究表明，TIPE2可以減輕ALD-DNA誘導的狼瘡小鼠的狼瘡活動指數(shù)，緩解狼瘡病情。

Li等[8]對39例SLE患者外周血單個核細胞TIPE2基因的表達進行了檢測，SLE患者外周血單個核細胞TIPE2表達較正常對照組顯著下調(diào)，且活動期比靜止期下調(diào)更明顯。同時，TIPE2的表達與SLE病情活動性指標SLEDAI之間存在高度的負相關(guān)，該結(jié)果表明TIPE2在SLE患者病情發(fā)展過程中可能具有一定的調(diào)節(jié)作用。

張有斌等[6]通過成功構(gòu)建體內(nèi)、體外都能穩(wěn)定表達TIPE2的重組腺病毒載體，應用該載體使同種異體心臟移植大鼠受體內(nèi)過表達TIPE2，能下調(diào)腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、IFN-γ、IL-2表達水平，上調(diào)IL-4、IL-10的表達水平，減輕急性排斥反應，顯著延長供體在受體內(nèi)的存活時間。Sun等[9]在自身免疫性脊髓炎中明確證實TIPE2的負向免疫調(diào)節(jié)作用。有研究發(fā)現(xiàn)TIPE2+/+表達質(zhì)粒明顯提升大鼠佐劑型關(guān)節(jié)炎成纖維樣滑膜細胞的TIPE2蛋白表達水平，TIPE2對DR5介導細胞凋亡有重要作用[10]。TIPE2是一種新發(fā)現(xiàn)的免疫負調(diào)控分子，優(yōu)先表達在正常小鼠的髓系和淋巴系細胞，而在人體分布更加廣泛。TIPE2可以調(diào)控T細胞受體和TLR的信號轉(zhuǎn)導，從而對固有性免疫應答和適應性免疫應答進行免疫負調(diào)控，以便維持免疫自穩(wěn)；TIPE2還可以通過直接結(jié)合caspase-8后，抑制激活蛋白-1和核因子-κB的活化等途徑發(fā)揮其促細胞凋亡作用[2]。腺病毒相關(guān)載體則以其轉(zhuǎn)染效率高，免疫原性低，長時穩(wěn)定表達，定點整合無致癌隱患等獨有的優(yōu)勢，在近些年的研究中得到了長足的發(fā)展[11]。AAV載體可操作性強，許多AAV已在臨床中應用。因此，AAV-TIPE2載體在SLE及其他自身免疫性疾病中應用，將有著無限廣闊的前景。

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Negative immune regulatory molecule TIPE2 for treating SLE mice through regulating macrophage subtype

LiXingjun1,ZhangYufen2,LiFeng2△,ZhuXiaohua2,HuangLan2

(1.DepartmentofClinicalLaboratory,ChongmingBranchHospital,AffiliatedXinhuaHospital,SchoolofMedicine,ShanghaiJiaotongUniversity,Shanghai202150,China; 2.DepartmentofDermatology,AffiliatedHuashanHospital,FudanUniversity,Shanghai200040,China.)

Objective To investigate the role of tumor necrosis factor (TNF)-alpha-induced protein 8-like 2 (TIPE2) for regulating the macrophage polarization in systemic lupus erythematosus and its curative effects on experimental SLE mice.Methods The mice were treated with activated lymphocytes derived DNA (ALD-DNA) for inducing mice model,randomly divided into AAV-scr control group and AAV-TIPE2 experimental group,and injected with AAV-TIPE2 or AAV-scr virus solution from the tail vein of mice.The expression of TIPE2 mRNA and protein in polarized macrophages,serum dsDNA antibody titer,urine protein and renal pathological index were detected.Results (1) The TIPE2 expression level of TIPE2 mRNA and protein in AAV-TIPE2-transfected cells was 13.5±1.6 times and 10.8±1.6 times of AAV-scr control group respectively.(2) M2 macrophage specific molecule MGL+was 59.6% in AAV-TIPE2 group and MGL+cells in the AAV-scr group was 8.4%.M2/M1 odds ratio of AAV-TIPE2 experimental group to AAV-scr control group was 16.(3) The recombinant TIPE2 adenovirus related vector could stably expressed in transfected HEK-293.In vitro and in vivo experiments confirmed that AAV-TIPE2 was able to induce M2 polarization of macrophages in ALD-DNA-induced lupus mice.(4) The serum anti-dsDNA antibody,urinary protein and renal pathology in the AAV-TIPE2 group were significantly lower than those in the AAV-scr group(P<0.01).Conclusion TIPE2 alleviates the disease condition of ALD-DNA induced SLE mice through induction of macrophage polarization to M2 phenotype,which may be used as a promising therapeutic method for ALD-DNA induced SLE mice.

macrophages;systemic lupus erythematosus;adenoviridae;ALD-DNA;TIPE2

李星軍(1967-)，副主任技師，碩士，主要從事臨床免疫檢驗相關(guān)研究。△

，E-mail:lifengxr@sina.com。

10.3969/j.issn.1671-8348.2017.24.002

R751.05

A

1671-8348(2017)24-3318-03

2016-12-18

2017-03-06)