張金婷 王淑民 白兢毳 杜淑英 李巧鳳 朱曉紅 張 斌 王 寧＊張樹成

1.河北省承德縣婦幼保健和計劃生育技術(shù)服務中心（067400）；2.北京市朝陽區(qū)太陽宮社區(qū)衛(wèi)生服務中心；3.河南省新密市婦幼保健和計劃生育技術(shù)服務中心；4.國家衛(wèi)生計生委科學技術(shù)研究所

補腎調(diào)經(jīng)方藥對排卵障礙不孕患者子宮內(nèi)膜的影響

張金婷1王淑民1白兢毳2杜淑英3李巧鳳3朱曉紅4張 斌4王 寧4＊張樹成4

1.河北省承德縣婦幼保健和計劃生育技術(shù)服務中心（067400）；2.北京市朝陽區(qū)太陽宮社區(qū)衛(wèi)生服務中心；3.河南省新密市婦幼保健和計劃生育技術(shù)服務中心；4.國家衛(wèi)生計生委科學技術(shù)研究所

目的：觀察補腎調(diào)經(jīng)方藥對子宮內(nèi)膜的影響。方法：對排卵障礙不孕婦女45例，采用服藥前后自身對照方法，通過中藥方藥治療和隨訪各3個周期，進行臨床觀察和B超檢測；服藥前后分別于增殖晚期、分泌中期和分泌晚期刮取子宮內(nèi)膜進行形態(tài)學、免疫組織化學檢測。結(jié)果：服藥后月經(jīng)、排卵、子宮內(nèi)膜等均有改善，總?cè)焉锫蕿?5.6%；子宮內(nèi)膜的腺體細胞和間質(zhì)細胞的功能狀態(tài)與月經(jīng)周期發(fā)育各個時同步化能力和8種細胞因子的表達均較服藥前明顯增強。結(jié)論：補腎調(diào)經(jīng)方藥可以促進子宮內(nèi)膜發(fā)育，改善子宮內(nèi)膜的接受性，提高內(nèi)膜細胞活性，從而提高妊娠率。關(guān)鍵詞 補腎調(diào)經(jīng)，子宮內(nèi)膜，卵泡發(fā)育，妊娠率，形態(tài)學

子宮內(nèi)膜對孕卵的接受性（子宮內(nèi)膜感受態(tài)）對妊娠的建立十分重要。在多數(shù)妊娠失敗病例中除了胚胎因素外，子宮內(nèi)膜發(fā)育不佳、不能達到接受狀態(tài)成為影響輔助生殖成功的主要因素之一。使用激素類進行促（超）排卵藥物，可以在受體水平上阻斷雌激素作用，導致子宮內(nèi)膜DNA合成受阻，造成患者子宮內(nèi)膜發(fā)育遲緩，內(nèi)膜與卵泡發(fā)育不同步。祖國傳統(tǒng)醫(yī)學注重整體調(diào)理，采用中西醫(yī)結(jié)合治療方法被更多嘗試在超排卵、輔助生殖醫(yī)學領(lǐng)域。中藥復方具有改善排卵能力，促進卵泡發(fā)育，同時可以同步調(diào)節(jié)子宮內(nèi)膜容受性和輸卵管功能，促進受孕成功多環(huán)節(jié)的內(nèi)環(huán)境。meta分析和系統(tǒng)評價基于目前的證據(jù)可以說明復方中藥干預輔助生殖技術(shù)具有良好的效果和安全性，可提高臨床妊娠率、受精率、種植率和優(yōu)秀胚胎率，降低流產(chǎn)率［1］。通過前期臨床觀察，補腎調(diào)經(jīng)方藥具有明確的調(diào)經(jīng)、促排卵、健內(nèi)膜作用［2］。為進一步認識補腎調(diào)經(jīng)方的作用，本文對子宮內(nèi)膜的病理學變化和相關(guān)因子的免疫組化進行研究。

1 材料和方法

1.1 觀察對象

根據(jù)診斷標準［34］選擇因排卵障礙不孕婦女45例為觀察對象。受試者平均年齡28.3（22～36）歲，平均不孕年限3.3（2～11.5）年；原發(fā)、繼發(fā)性不孕分別為22、23例，月經(jīng)周期39～60d；主要表現(xiàn)為卵泡發(fā)育生長緩慢、停育、變性、無優(yōu)勢卵泡和子宮內(nèi)膜薄、分泌期子宮內(nèi)膜反應比正常月經(jīng)周期相差兩天以上等。受試者半年內(nèi)無甾體激素藥物或其它影響生殖的中西藥物使用，有至少3個月經(jīng)周期明確記錄，常規(guī)婦科檢查正常，排除器質(zhì)性病變；有完整的內(nèi)分泌性激素測定結(jié)果；有至少一個周期的連續(xù)B超監(jiān)測結(jié)果。男方發(fā)育正常，精液檢查正常；雙方免疫性不育因素均經(jīng)過檢查和治療顯示正常。

1.2 藥方

補腎調(diào)經(jīng)方藥為協(xié)定處方，功能為補腎填精、養(yǎng)血活血、調(diào)經(jīng)助孕，由當歸、菟絲子、枸杞子、女貞子、覆盆子、山萸肉、何首烏、巴戟天、熟地、山藥、甘草等組成［2］，水煎服，每日1劑，分2次服用。

1.3 治療和觀察方法

采用自身對照方法觀察。治療前，觀察對象連續(xù)記錄3個月經(jīng)周期，并行≥2個周期的B超監(jiān)測，選擇3個觀察周期中最接近正常的臨床指標作為對照數(shù)據(jù)。于月經(jīng)第5d開始服用補腎調(diào)經(jīng)方藥，根據(jù)連續(xù)B超監(jiān)測確定排卵日，記錄卵泡大小和子宮內(nèi)膜厚度。當有排卵發(fā)生即停止服用中藥，若連續(xù)服用18d仍未排卵發(fā)生時服用至月經(jīng)周期第23d停止服藥；若妊娠不再服用中藥行妊娠期觀察。若未妊娠次月第5天繼續(xù)服用中藥。連續(xù)服用中藥3個周期，作為治療后數(shù)據(jù)分析并繼續(xù)隨訪觀察3個周期。1.4子宮內(nèi)膜樣本采集和處理

以B超監(jiān)測確定的排卵日為LH 0，排卵前2d為LH－2（增殖晚期），排卵后7天和10天分別為LH＋7（分泌中期）和LH＋10（分泌晚期）。在治療前和治療后第2個周期分別于增殖晚期、分泌中期、分泌晚期子宮內(nèi)膜取材，每名觀察對象僅選取1個時相在治療前和治療后相同時相取材。將觀察對象隨機分為增殖晚期、分泌中期、分泌晚期共3個內(nèi)膜取材時相，服藥前分別為18、16、11例，共45例；服藥后分別為各12、10、10例，共32例（其他13例失訪或未能獲得取材組織）。子宮內(nèi)膜組織經(jīng)Bouin固定，經(jīng)常規(guī)水洗、脫水、浸蠟、包埋、5μm石蠟切片，行常規(guī)蘇木精－伊紅（HE）染色，脫水，透明，封片，鏡檢。根據(jù)文獻［5］標準確定子宮內(nèi)膜組織學分期。

1.5 免疫組化染色和分析

免疫組化染色方法采用SP法，封閉血清為正常山羊血清，一抗購自R＆D或abcam公司?？贵w滴度1200～1800，3%的過氧化氫封閉。加一抗于4℃孵育過夜，使用通用型生物素標記的二抗，辣根過氧化物酶標記的鏈霉卵白素S－A／HRP工作液，DAB顯色，陰性對照一抗為正常羊血清。進行13種因子的免疫組化，分別為雌激素受體（ER）、孕激素受體（PR）、雌激素調(diào)節(jié)蛋白（PS2）、增殖細胞核抗原（PCNA）、血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）及受體（VEGFR）、轉(zhuǎn)化生長因子（TGF）及受體（TGFR）、表皮生長因子受體（EGFR）、成纖維細胞生長因子（FGF）、纖維連接蛋白（FN）、層粘連蛋白（LN）及受體（LNR）。免疫組織化學染色采用雙盲法根據(jù)陽性反應顆粒強度和分布程度進行定性分析，特異性著染強度以陰性（－）、弱陽性（±）、陽性（＋）、強陽性（2＋）、極強陽性（3＋、4＋）表示。

1.6 資料整理和統(tǒng)計分析

卵泡測定以（長徑×短徑）12換算為卵泡標準大小。采用SPSS11.5軟件包處理數(shù)據(jù)和統(tǒng)計學分析，單因素方差分析、配對資料t檢驗、χ2檢驗，以均值±標準差表示。

2 結(jié)果

2.1 妊娠和流產(chǎn)情況

45例觀察對象，服藥后1、2、3個周期和隨訪觀察1、2、3個周期分別妊娠2、6、4例和2、1、1例，累計妊娠率分別為4.4%（2／45）、17.8%（8／45）、26.7%（12／45）和31.1%（14／45）、33.3%（15／45）、35.6%（16／45）；服藥3個周期內(nèi)妊娠率為26.7%（12／45），隨訪觀察3個周期內(nèi)妊娠率為12.1%（4／33），總?cè)焉锫蕿?5.6%（16／45）。共有2例（2／16）發(fā)生流產(chǎn)。

2.2 月經(jīng)變化

所有觀察對象服藥前均月經(jīng)不調(diào)。服藥后各觀察時期月經(jīng)不調(diào)和月經(jīng)性狀明顯改善（P＜0.05或P＜0.01）。見表1。

2.3 排卵情況

不同服藥時期卵泡發(fā)育情況比較，均顯示服藥后卵泡發(fā)育明顯改善（P＜0.05或P＜0.01）。見表2。

表1 觀察對象服藥前后月經(jīng)情況變化比較［例（%）］

表2 觀察對象服藥前后卵泡發(fā)育和排卵變化比較

2.4 子宮內(nèi)膜發(fā)育情況

服藥前和服藥后1、2、3個周期子宮內(nèi)膜厚度在LH－2時分別為6.7±2.1、8.2±1.8、9.1±1.9、9.5± 2.3mm，在LH0時分別為7.1±1.9、8.8±1.6、9.6± 1.9、10.6±2.2mm，服藥后子宮內(nèi)膜發(fā)育好于服藥前（P＜0.05或P＜0.01）。

2.5 子宮內(nèi)膜組織形態(tài)學變化

2.5.1 LH－2 此期共12例。在服藥前，內(nèi)膜增殖表現(xiàn)不良11例（增中期2例、后期2例、末期4例、晚增前期3例），腺體數(shù)目少、分布疏松不均勻；腺腔分化程度低，腺腔小而圓，腺體功能差；顯示形態(tài)學滯后、正常發(fā)育狀態(tài)不同步11例；處于正常增殖子宮內(nèi)膜僅1例。在服藥后，內(nèi)膜增殖表現(xiàn)不良3例（中增末期1例、晚增前期2例），正常晚增中期9例。子宮內(nèi)膜發(fā)育不良者服藥后比服藥前減少了8例（8／12）（P＜0.01）。

2.5.2 LH＋7 此期共10例。在服藥前，8例內(nèi)膜發(fā)育不良，表現(xiàn)為仍停留在增殖期，腺上皮仍為假復層；腺體細胞小，數(shù)目少，彎曲擴大程度低；間質(zhì)主要為細胞數(shù)目較少，梭形（小細胞）和星形（大細胞）細胞同時可見各占50%左右；小動脈和血管增生不明顯；處于正常分泌表現(xiàn)者2例。在服藥后，內(nèi)膜發(fā)育不良1例；符合正常分泌特征表現(xiàn)者9例，內(nèi)膜中腺體發(fā)育充分，出現(xiàn)核下空泡，頂漿分泌的細胞減少；間質(zhì)細胞水腫明顯。子宮內(nèi)膜發(fā)育不良者服藥后比服藥前減少了7例（7／10）（P＜0.01）。

2.5.3 LH＋10 此期共10例。服藥前，10例內(nèi)膜均發(fā)育不良，處在中泌期（初期、中期），子宮內(nèi)膜發(fā)育不同步，滯后于正常晚泌的狀態(tài)，子宮內(nèi)膜的腺體擴張彎曲程度低，頂漿分泌和核下空泡偶見；在間質(zhì)細胞數(shù)目少，細胞分化延遲，小動脈和血管增生不明顯。在服藥后，正常發(fā)育內(nèi)膜7例，內(nèi)膜發(fā)育不良3例。子宮內(nèi)膜發(fā)育不良者服藥后比服藥前減少了7例（7／10）（P＜0.01）。

2.6 子宮內(nèi)膜活性因子的影響

進行了13種因子的免疫組化分析，主要分為3種類型：細胞生長因子及生長因子受體類（VEGF、VEGFR、TGF、TGFR、EGFR、FGF；細胞粘附分子類（FN、LN及LNR）和其他（ER、PR、PS2和PCNA）。見表3。①細胞生長因子及受體：EGFR、TGF在排卵前后表達強度逐漸增加（分泌晚期比分泌中期、增殖晚期強），TGFR排卵后表達強度逐漸降低（分泌晚期比分泌中期弱）。與服藥前相比，服藥后增殖晚期的EGFR表達明顯增強；分泌中期、分泌晚期組EGFR略有增強，VEGF增強，F(xiàn)GF明顯增強。服藥前后TGF、TGFR、VEGFR均無變化。②細胞粘附因子：服藥后與服藥前比較，LN、LNR在各組均明顯增強；FN在各組表達均陽性，F(xiàn)N在增殖晚期、分泌中期組明顯增強。③其它相關(guān)因子：PR排卵前后（增殖晚期～分泌晚期）強度逐漸降低（增殖晚期比分泌中期表達高，分泌晚期不表達）。服藥前后比較PCNA、PS2在各組均為服藥后明顯增強，ER在增殖晚期、分泌中期組服藥后明顯增強，PR在增殖晚期組服藥后明顯增強、在分泌中期組服藥后略有增強。見表3。

表3 觀察對象不同時期各細胞因子免疫組化表達定性分析

3 討論

人子宮內(nèi)膜因取材受限影響了在體觀察以及中藥治療效果的全面評價，故以往的相關(guān)研究多集中在動物實驗，而采用離體人子宮內(nèi)膜進行研究是目前最理想的手段。中醫(yī)藥強調(diào)整體辨證施治，對不育癥的治療突出局部作用又兼顧整體效果，在臨床上取得了較好的療效［67］。本研究在中醫(yī)“腎主生殖”“腎藏精”“精滿則子宮易于攝精，血足則子宮易于容物”的理論指導下，通過調(diào)經(jīng)孕育方藥對排卵障礙性不孕患者子宮內(nèi)膜組織形態(tài)進行觀察，研究中藥對“植入窗口期”子宮內(nèi)膜感受態(tài)變化的影響，探討中藥對子宮內(nèi)膜刺激作用的機制。

在正常婦女月經(jīng)周期的整個增殖期內(nèi)，上皮和間質(zhì)細胞分裂增殖，內(nèi)膜功能層生長增厚，功能活躍旺盛。旺盛的分泌反應，為精子的運行和獲能提供了基本的適宜條件，是胚胎著床的基本保證。胚泡的正常植入需要子宮內(nèi)膜處于感受狀態(tài)，子宮內(nèi)膜接受性的改善可能涉及改善子宮內(nèi)膜蛻膜化反應、促進細胞因子和生長因子的分泌、增加子宮內(nèi)膜和胚胎發(fā)育的協(xié)調(diào)性等方面［8］。

內(nèi)膜中活性物質(zhì)的協(xié)調(diào)和表達對著床的成立極為重要，這些活性物質(zhì)主要為激素、激素受體、早孕相關(guān)因子和早孕相關(guān)因子受體。細胞因子可以介導甾體激素對子宮內(nèi)膜的調(diào)節(jié)作用。當不孕婦女服用補腎調(diào)經(jīng)方后，方藥促進調(diào)節(jié)此期內(nèi)膜活性物質(zhì)的變化。在增殖晚期有10種增強，EGFR、LN、LNR、FN、PS2、ER、PR、PCNA等8種明顯增強，這8種因子主要與促進細胞增殖分化、與激素和細胞粘附相關(guān)［911］。通過這些因子的作用，影響子宮內(nèi)膜的生理狀態(tài)和胚胎植入的局部微環(huán)境，改善子宮內(nèi)膜的容受性，有利于對著床的過程進行精細的調(diào)控［12］。

本研究所觀察的細胞因子（VEGF、TGF、FGF、VEGFR、TGFR、EGFR）同時也是促血管生成因子。在子宮內(nèi)膜發(fā)育的不同時相均有表達，服用中藥后增殖晚期、分泌中期、分泌晚期具有不同強度的增強，這些結(jié)果提示不孕婦女服用補腎調(diào)經(jīng)方藥后，促血管生成活性明顯增強，符合正常生理狀態(tài)下“血”、“脈”充沛盈盛表現(xiàn)。從微觀角度看，服用中藥后增殖期的內(nèi)膜分化增殖能力明顯改善，內(nèi)膜明顯增厚，增殖旺盛；分泌期子宮內(nèi)膜發(fā)育同步，分泌晚期細胞分泌活動增強；相應時相標志性細胞因子表達增加，細胞活性增加。顯示出補腎調(diào)經(jīng)方整體調(diào)節(jié)作用的優(yōu)勢。補腎調(diào)經(jīng)方調(diào)節(jié)子宮內(nèi)膜容受性的精密機制以及提高妊娠率的協(xié)調(diào)機制還有待進一步深入研究。

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［責任編輯：董 琳］

Influence of Bushen Tiaojing Decoctin on endometrium of infertile women with ovulation failure

ZHANG Jinting1，WANG Shumin1，BAI Jingcui2，DU Shuying3，LI Qiaofeng3，ZHU Xiaohong4，ZHANG Bin4，WANG Ning4＊，ZHANG Shucheng4
1.Maternal＆child and Family Planning Service Center of Chengde County，Hebei，067400；2.Community Health Service Center of Chaoyang district，Beijing；3.Maternal＆child and Family Planning Service Center of Xinmi city，Henan；4.National Research Institute for Family Planning，Beijing
＊

wangn333＠126.com

Objective：To investigate the influence of Bushen Tiaojing Decoction on endometrium.Methods：Forty five infertile women with ovulation failure were included and observed by self－control method before and after taking Bushen Tiaojing Decoction.All women were followed up 3months after taking medicine，and the outcomes were obtained by observation of clinical symptoms and ultrasound.The endometria of included women were collected for morphological and immunohistochemical detection before and after medicine in late proliferation stage，mid secretory and late secretory stage.Results：Bushen Tiaojing Decoction regulated menstruation，promoted ovulation，and enhanced endometrial development.The total pregnancy rate was 35.6%in these women.The development of gland and the stromal cells synchronized with the menstrual cycle，and eight cytokines were highly expressed after treatment，so it indicated endometria activity and function increased.Conclusion：Bushen Tiaojing Decoction can promote endometrial development，improve endometrial receptivity，and improve pregnancy rate of infertile women.

Bushen Tiaojing；Endometrium；Pregnant rate；Morphology

10.3969／j.issn.1004－8189.2017.04.004

國家重點基礎(chǔ)研究發(fā)展計劃（973計劃，2010CB530403）；國家自然科學基金（90409016）

2017－02－13

2017－02－23

＊通訊作者：wangn333＠126.com