張競(jìng)文 燕茹 常越 秦璟

高同型半胱氨酸血癥引起小鼠嗅球細(xì)胞損傷的初步探討

張競(jìng)文1燕茹2常越1秦璟3

目的 探討高同型半胱氨酸血癥損傷神經(jīng)細(xì)胞的特點(diǎn)。方法通過(guò)高蛋氨酸飲食在ApoE-/-小鼠誘發(fā)高同型半胱氨酸血癥，采用組織學(xué)，組織化學(xué)，免疫組化和原位末端脫氧核糖核酸轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的脫氧尿苷三磷酸（dUTP）標(biāo)記法（TUNEL），對(duì)比觀察小鼠嗅球組織結(jié)構(gòu)、尼氏體變化和細(xì)胞凋亡。結(jié)果 實(shí)驗(yàn)組血漿總同型半胱氨酸[（23．71±6．30）μmol/L]高于對(duì)照組[（6．47±2．66）μmol/L ]（P＜0．05）。在對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組，均可見(jiàn)嗅球的基本組織結(jié)構(gòu)，實(shí)驗(yàn)組嗅球組織結(jié)構(gòu)未見(jiàn)明顯的異常。Nissl體染色可見(jiàn)，實(shí)驗(yàn)組Nissl體光密度值明顯低于對(duì)照組（P＜0．05）。 NeuN免疫組織化學(xué)染色顯示，實(shí)驗(yàn)組NeuN陽(yáng)性神經(jīng)元數(shù)量與對(duì)照組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0．05）。實(shí)驗(yàn)組嗅球中TUNEL陽(yáng)性顆粒細(xì)胞數(shù)量明顯多于對(duì)照組（P＜0．05）。 結(jié)論 高同型半胱氨酸血癥能夠?qū)е翧poE-/-小鼠嗅球神經(jīng)元線(xiàn)粒體損傷和細(xì)胞凋亡。

嗅球；細(xì)胞凋亡；Nissl體；小鼠；高同型半胱氨酸血癥

高同型半胱氨酸血癥 （hyperhomocysteinemia，HHcy）是臨床上常見(jiàn)的代謝異常之一，與多種人類(lèi)疾病有關(guān)，是心腦血管疾病獨(dú)立的危險(xiǎn)因素，與Alzheimer病，Parkinson病，腦萎縮以及其他神經(jīng)變性疾病有密切關(guān)系[1-2]。同型半胱氨酸所致中樞神經(jīng)系統(tǒng)損害和疾病的作用及其機(jī)制尚不清楚。研究提示，同型半胱氨酸可作為興奮性氨基酸，增加神經(jīng)元對(duì)外源性有害物質(zhì)和氧化損傷的敏感性，從而加重或促進(jìn)損傷的發(fā)生[1，3]。嗅球（Olfactory bulb）是哺乳動(dòng)物大腦的一部分，作為大腦中一個(gè)非常重要的感覺(jué)系統(tǒng)[4]，在許多疾病，特別是中樞神經(jīng)疾病初期就可發(fā)生神經(jīng)元損傷[4]。研究提示，嗅覺(jué)功能障礙的發(fā)生通常早于認(rèn)知障礙[4-5]。但是，作為單獨(dú)的致病因素，HHcy所致的中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷尚缺少組織學(xué)的證據(jù)；關(guān)于HHcy對(duì)嗅球神經(jīng)元結(jié)構(gòu)和細(xì)胞凋亡的影響尚不清楚。本研究采用經(jīng)典的方法[1，2，6]，通過(guò)飼喂高蛋氨酸飲食，在ApoE-/-小鼠誘導(dǎo)HHcy，采用組織學(xué)，組織化學(xué)，免疫組織化學(xué)和原位末端脫氧核糖核酸轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的脫氧尿苷三磷酸（dUTP）標(biāo)記法（TUNEL）技術(shù)，對(duì)比觀察HHcy所致嗅球神經(jīng)元損傷及其細(xì)胞凋亡。

1 材料和方法

1.1 材料

SPF級(jí)近交系C57BL/6J背景5周齡雄性純合子ApoE-/-小鼠20只，體重為18～20 g（購(gòu)自美國(guó)杰克遜實(shí)驗(yàn)室），AIN-93G飼料（上海薩博生物有限公司），含1.7%蛋氨酸的AIN-93G飼料（上海薩博生物有限公司）。 抗 神 經(jīng) 元 核 抗 原 （neuronal nuclei，NeuN） 抗體（Abcam 公司），HRP標(biāo)記的兔二抗IgG（Invitrogen公司），TUNEL 細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒（羅氏公司），DAB顯色試劑盒，PBS緩沖液等均購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。

1.2 方法

1.2.1 分組及處理

ApoE-/-小鼠20只，適應(yīng)性喂養(yǎng)1周。按照隨機(jī)化原則分為2組，每組10只：（1）正常飲食 ApoE-/-對(duì)照組（簡(jiǎn)稱(chēng)對(duì)照組），飼以普通AIN-93G飼料；（2） 高蛋氨酸飲食誘導(dǎo)高同型半胱氨酸血癥實(shí)驗(yàn)組（簡(jiǎn)稱(chēng)實(shí)驗(yàn)組），飼以添加1.7%蛋氨酸的AIN-93G飼料；所有動(dòng)物均在相同條件下按分組的飲食喂養(yǎng)18周，室溫（22±1）℃，濕度 40%～70%，12 h 光照/12 h 黑暗，自由采食和飲水。

1.2.2 標(biāo)本制備 高蛋氨酸飲食喂養(yǎng)18周，3.5%水合氯醛，0.1 ml/10 g麻醉小鼠，收集血液置于抗凝EP管，4℃冷藏。包括嗅球的腦組織沿矢狀切面一分為二，4%多聚甲醛固定。

1.2.3 血漿同型半胱氨酸水平測(cè)定 血液在室溫靜置30 min，離心（4℃，3 000 r/min）10 min后，分離上層血漿，裝入EP管。用ADVIA 2400全自動(dòng)生化儀檢測(cè)血漿同型半胱氨酸濃度（μmol/L）。

1.2.4 尼氏染色 石蠟切片常規(guī)脫蠟脫水；亞甲藍(lán)10 min；分化液2 min；鉬酸銨溶液5 min，蒸餾水沖洗；常規(guī)脫水透明，中性樹(shù)膠封片。光學(xué)顯微鏡觀察，在高倍鏡（400X）下采圖，采用圖像分析軟件測(cè)定平均光密度值。

1.2.5 TUNEL 應(yīng)用 TUNEL 細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒檢測(cè)凋亡細(xì)胞，根據(jù)說(shuō)明書(shū)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)操作。在光學(xué)顯微鏡下觀察，高倍鏡下采圖，計(jì)數(shù)高倍鏡下TUNEL陽(yáng)性的細(xì)胞數(shù)量，計(jì)算出每高倍鏡下TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞比例：TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞/TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞+TUNEL陰性細(xì)胞。

1.2.6 免疫組織化學(xué)染色 切片脫蠟水化，蒸餾水沖洗；高壓鍋抗原修復(fù)； 3%雙氧水室溫30 min，用PBS沖洗3次；山羊血清封閉，室溫30 min；NeuN一抗（1：200），濕盒4℃過(guò)夜；二抗37℃孵育1 h；用DAB顯色1 min； 蘇木素復(fù)染，中性樹(shù)脂膠封片。光學(xué)顯微鏡觀察，高倍鏡下采圖，采用圖像分析軟件計(jì)數(shù)高倍鏡下NeuN陽(yáng)性的細(xì)胞數(shù)量，計(jì)算出每高倍鏡視野下NeuN陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)，并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。

1.2.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用 SPSS 20.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行獨(dú)立樣本檢驗(yàn)，計(jì)量資料數(shù)據(jù)以（均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差）表示，組間比較進(jìn)行t檢驗(yàn)，P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 血漿同型半胱氨酸

對(duì)照組血漿總同型半胱氨酸為（6.47±2.66）μmol/L，實(shí)驗(yàn)組為（23.71±6.30）μmol/L，實(shí)驗(yàn)組血漿同型半胱氨酸含量明顯增加，與對(duì)照組相比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）（圖1）。

圖1 血漿同型半胱氨酸測(cè)定結(jié)果

2.2 嗅球組織學(xué)

在對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組，均可見(jiàn)基本的嗅球組織結(jié)構(gòu)，嗅神經(jīng)層，突觸球?qū)樱鈪矤顚?，僧帽?xì)胞層，內(nèi)叢狀層，顆粒細(xì)胞層清晰可見(jiàn)。與對(duì)照組比較，在實(shí)驗(yàn)組未見(jiàn)明顯的細(xì)胞層次紊亂、腦水腫、壞死等結(jié)構(gòu)異?；虿±碜兓▓D2）。

2.3 Nissl體

通過(guò)尼氏染色可見(jiàn)，在顆粒細(xì)胞層、僧帽神經(jīng)元、嗅小球神經(jīng)元均可見(jiàn)比較豐富的Nissl體（圖3）。光密度值分析可見(jiàn)，實(shí)驗(yàn)組Nissl體光密度值低于對(duì)照組（P＜0.05） （圖4）。

2.4 NeuN免疫組織化學(xué)

圖2 嗅球組織學(xué)

圖3 嗅球Nissl體染色結(jié)果

圖4 嗅球Nissl體染色光密度值統(tǒng)計(jì)結(jié)果

在對(duì)照組，僧帽神經(jīng)元、嗅小球神經(jīng)元、大多數(shù)顆粒層細(xì)胞NeuN陽(yáng)性，陽(yáng)性強(qiáng)度為棕黃色，著色強(qiáng)度基本一致，定位于細(xì)胞核。實(shí)驗(yàn)組NeuN陽(yáng)性情況與對(duì)照組接近，未見(jiàn)明顯的NeuN陽(yáng)性細(xì)胞減少。對(duì)NeuN陽(yáng)性顆粒細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)統(tǒng)計(jì)可見(jiàn)，實(shí)驗(yàn)組NeuN陽(yáng)性神經(jīng)元與對(duì)照組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05） （圖 5）。

圖5 嗅球NeuN陽(yáng)性細(xì)胞統(tǒng)計(jì)結(jié)果

2.5 細(xì)胞凋亡

在對(duì)照組，小鼠嗅球顆粒細(xì)胞層中散在少數(shù)TUNEL 陽(yáng)性細(xì)胞，實(shí)驗(yàn)組TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞明顯增加（圖6）。對(duì)TUNEL陽(yáng)性顆粒細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)統(tǒng)計(jì)可見(jiàn)，實(shí)驗(yàn)組TUNEL陽(yáng)性顆粒細(xì)胞多于對(duì)照組（P＜0.05）（圖7）。

圖6 嗅球TUNEL染色結(jié)果

3 討論

圖7 嗅球TUNEL染色陽(yáng)性細(xì)胞統(tǒng)計(jì)結(jié)果

嗅球是大多數(shù)哺乳動(dòng)物（包括人類(lèi)）中樞神經(jīng)系統(tǒng)的重要組成部分，在有害因素存在時(shí)，嗅球受到損傷的時(shí)間常常早于其他部分的腦組織[6]。有研究提示，嗅覺(jué)功能障礙可以作為早期診斷神經(jīng)變性疾病的重要指標(biāo)，也是判斷其進(jìn)展的重要依據(jù)[6-7]。流行病學(xué)和臨床研究提示，高同型半胱氨酸血癥（HHcy）與Alzheimer病，Parkinson病，腦萎縮以癲癇等有關(guān)[1，8]。本研究結(jié)果顯示，在高蛋氨酸食物飼喂的ApoE-/-小鼠，能夠引起中度HHcy，嗅球的組織學(xué)結(jié)構(gòu)存在，在光學(xué)顯微鏡下未見(jiàn)明顯的病理變化；從反映線(xiàn)粒體結(jié)構(gòu)的Nissl體可見(jiàn)，實(shí)驗(yàn)組Nissl體染色光密度值明顯低于對(duì)照組；同時(shí)，實(shí)驗(yàn)組TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞明顯增加。結(jié)果提示，HHcy能夠?qū)е翧poE-/-小鼠嗅球神經(jīng)細(xì)胞線(xiàn)粒體損傷和凋亡增加。

目前，關(guān)于HHcy所致中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷及其機(jī)制仍然不清楚。本研究結(jié)果顯示，HHcy組嗅球顆粒細(xì)胞TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞明顯增加。提示HHcy可能誘導(dǎo)小鼠嗅球神經(jīng)細(xì)胞的凋亡，從而影響嗅球神經(jīng)元的更新和功能。有研究提示，同型半胱氨酸可作為興奮性氨基酸，增加神經(jīng)元對(duì)外源性有害物質(zhì)損傷的敏感性[6-7]。HHcy能夠加重細(xì)胞對(duì)氧化損傷的敏感性，并誘發(fā)興奮性毒性[3，7]。研究提示，SH-SY5Y神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞系培養(yǎng)基加高同型半胱氨酸培養(yǎng)5天后，ROS產(chǎn)物增加4.4倍，隨著培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)可產(chǎn)生基因毒性，引起DNA斷裂[3]。HHcy誘導(dǎo)的細(xì)胞損傷與谷氨酸受體亞型以及NMDA激活有關(guān)，也與DNA損傷、P53激活以及線(xiàn)粒體功能障礙有關(guān)[1，3，9]。

本研究通過(guò)高蛋氨酸飲食在ApoE-/-小鼠誘發(fā)了高同型半胱氨酸血癥。在實(shí)驗(yàn)組，嗅球未見(jiàn)明顯的組織學(xué)異常；組織化學(xué)檢查可見(jiàn)，實(shí)驗(yàn)組Nissl體染色光密度值明顯低于對(duì)照組；實(shí)驗(yàn)組嗅球TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞明顯增加，原位末端脫氧核糖核酸轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的脫氧尿苷三磷酸能夠標(biāo)記出凋亡細(xì)胞。結(jié)果提示，高同型半胱氨酸血癥能夠?qū)е翧poE-/-小鼠嗅球神經(jīng)細(xì)胞線(xiàn)粒體損傷和凋亡增加，這可能與高同型半胱氨酸所致的神經(jīng)細(xì)胞損傷有關(guān)[10-11]。由于體內(nèi)同型半胱氨酸代謝復(fù)雜，其產(chǎn)生和排泄處于動(dòng)態(tài)平衡過(guò)程中，高同型半胱氨酸誘導(dǎo)的中樞神經(jīng)系統(tǒng)病理?yè)p害具有十分復(fù)雜的過(guò)程和機(jī)制[6，12]。因此，要了解高同型半胱氨酸對(duì)神經(jīng)細(xì)胞的損傷及其機(jī)制尚需更多更深入的研究。

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Preliminary Study on the Injury of Olfactory Bulb Cells Induced by Hyperhomocysteinemia in Mice

ZHANG Jingwen1YAN Ru2CHANG Yue1QIN Jing3
1 School of Basic Medical Science, Ningxia Medical University, Yinchuan Ningxia 750004, China; 2 Cardiac Center, General Hospital of Ningxia Medical University, Yinchuan Ningxia 750004, China; 3 Pathology Department, General Hospital of Ningxia Medical University, Yinchuan Ningxia 750004, China

ObjectiveTo investigate the characteristics of neuronal cell damage induced by hyperhomocysteinemia (HHcy).MethodsHyperhomocysteinemia was induce by a high-methionine diet in ApoE-/-mice. The histology, Nissl body and apoptosis in the olfactory bulb were comparatively studied by histology, histochemistry, immunohistochemistry and terminal deoxynucleotidyl transferasemediated dUTP nick end labeling (TUNEL).ResultsThe total plasma homocysteine in the experimental HHcy group [(23.71±6.30) μmol/L] was significantly higher than that in the control group [(6.47±2.66) μmol/L ](P ＜ 0.05). In the control group and experimental HHcy group, the basic structure of olfactory bulb was observed, and there were no obvious histological abnormalities in the experimental HHcy group. Nissl body staining showed that the optical density of Nissl bodies in the experimental HHcy group was significantly lower than that in the control group (P ＜ 0.05). As was immunohistochemistry showed that no signi ficant difference between the numbers of NeuN-positive neuron between the experimental HHcy group and the control group (P ＞ 0.05). The numbers of TUNEL-positive granule cells in the experimental HHcy group were significantly higher than those in the control group (P ＜0.05).ConclusionThe hyperhomocysteinemia may be able to induce mitochondrial damage and apoptosis in olfactory bulb neurons of ApoE-/-mice.

olfactory bulb; apoptosis; Nissl body; mice; hyperhomocysteinemia

R589

A

1674-9316（2017）17-0127-05

10．3969/j．issn．1674-9316．2017．17．068

寧夏醫(yī)科大學(xué)優(yōu)勢(shì)學(xué)科群研究項(xiàng)目（XY201714）

1寧夏醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，寧夏 銀川 750004；2寧夏醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院心臟中心，寧夏 銀川 750004；3 寧夏醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院病理科，寧夏 銀川 750004