安坤 周文斌

吉蘭-巴雷綜合征患者血漿Sema-4A水平與免疫細(xì)胞相關(guān)性研究

安坤 周文斌

目的 檢測sema-4A在吉蘭-巴雷綜合征(Guillain-Barré syndrome，GBS)患者外周血血漿中及免疫細(xì)胞中的表達(dá)水平，探討sema-4A在GBS致病機(jī)制中的作用。方法 選擇作者醫(yī)院收治的GBS患者18例，另選健康體檢者18名作對照，并根據(jù)hughes評分將GBS患者劃分為輕型與重型。收集GBS患者急性期、恢復(fù)期及對照組外周血血漿及單個(gè)核細(xì)胞，利用ELISA法檢測外周血血漿中sema-4A表達(dá)水平，比較各組血漿sema-4A表達(dá)量變化。通過流式細(xì)胞術(shù)檢測sema-4A在DC細(xì)胞、B細(xì)胞、CD4+T細(xì)胞等單個(gè)核細(xì)胞的表達(dá)，比較各類單個(gè)核細(xì)胞表達(dá)sema-4A的差異。分析血漿sema-4A表達(dá)水平與表達(dá)sema-4A的免疫細(xì)胞頻率及疾病嚴(yán)重程度的相關(guān)性。結(jié)果 GBS患者急性期血漿sema-4A的表達(dá)水平〔(0.6162±0.1440)ng/mL〕高于恢復(fù)期及對照組〔分別(0.1071±0.0328)ng/mL、(0.0904±0.0249)ng/mL)，均P<0.05〕。重型GBS患者急性期血漿sema-4A表達(dá)水平高于輕型GBS〔分別為(0.7351±0.1172) ng/mL、(0.5009±0.0825)ng/mL，t=2.467，P=0.035)〕。GBS急性期患者血漿sema-4A表達(dá)水平與hughes評分呈正相關(guān)(r=0.79，P=0.025)。GBS急性期患者表達(dá)sema-4A的DC細(xì)胞頻率〔(3.7260±0.7516)%〕及B細(xì)胞頻率〔(2.8072±0.5548)%〕高于恢復(fù)期〔分別為(1.6912±0.4322)%、(1.6039±0.3091)%；均P<0.05〕及對照組〔分別為(1.7194±0.3624)%、(1.5027±0.3208)%；均P<0.05〕。GBS急性期患者表達(dá)sema-4A的DC細(xì)胞頻率與血漿sema-4A表達(dá)水平之間呈正相關(guān)(r=0.95，P=0.032)。結(jié)論 GBS急性期Sema-4A表達(dá)增高，并與病情嚴(yán)重程度及DC細(xì)胞頻率相關(guān)。Sema-4A可能是GBS急性期病情嚴(yán)重程度的一個(gè)評價(jià)指標(biāo)。

吉蘭-巴雷綜合征；sema-4A；DC細(xì)胞

吉蘭-巴雷綜合征(Guillain-Barré syndrome，GBS)是一種影響周圍神經(jīng)的炎性自身免疫性脫髓鞘疾病[1]。盡管有血漿置換、靜脈注射免疫球蛋白、糖皮質(zhì)激素等多種免疫治療方法，GBS患者中仍有20%以上遺留嚴(yán)重殘疾，死亡率高達(dá)5%[2]。大量研究發(fā)現(xiàn)體液免疫與細(xì)胞免疫共同參與此病的發(fā)生，T細(xì)胞及其分泌的相關(guān)細(xì)胞因子在GBS發(fā)病機(jī)制中起著重要的作用，但其具體發(fā)病機(jī)制仍未明確[3-4]。

Sema-4A是Ⅳ類信號素(semaphorins，semas)，屬于信號素家族[5]。Sema-4A可以在DC細(xì)胞及B細(xì)胞等多種免疫細(xì)胞中表達(dá)[6]。研究發(fā)現(xiàn)其受體為T細(xì)胞免疫球蛋白粘蛋白-2(the T cell, immunoglobulin and mucin domain proteins-2，TIM-2)。Sema-4A激活TIM-2可以誘導(dǎo)TIM-2酪氨酸激酶的磷酸化，進(jìn)而啟動(dòng)下游信號通路參與T細(xì)胞免疫功能的調(diào)節(jié)[7]，在類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎[8]、多發(fā)性硬化[9]等免疫炎性疾病的發(fā)展病程中均起了重要作用。然而sema-4A在GBS中的表達(dá)水平及其是否參與了GBS的致病機(jī)制，目前國內(nèi)外尚無相關(guān)研究報(bào)道。本研究擬通過檢測在GBS患者急性期及恢復(fù)期外周血中sema-4A水平及sema-4A在多種免疫細(xì)胞中的表達(dá)，探討sema-4A在GBS疾病演變過程中的規(guī)律。

1 對象和方法

1.1 觀察對象 研究病例來源為2013-03-01—2014-03-01中南大學(xué)湘雅醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科病房住院治療的GBS患者18例，其中男12例、女6例，年齡14～67歲，平均年齡為(47.56±16.21)歲，患者均符合2010年修訂的GBS診斷標(biāo)準(zhǔn)。入組的所有GBS患者均排除近期心腦血管疾病、腫瘤及其他自身免疫性疾病。根據(jù)Hughes評分(輕癥患者1～3分之間，重癥患者4～6分之間)，本組輕型為7例，重型為11例。本組脫髓鞘型10例，軸索型6例，脫髓鞘伴軸索損害2例(在進(jìn)行脫髓鞘型和軸索型兩型之間比較時(shí)此2例排除在外)。選取中南大學(xué)湘雅醫(yī)院門診體檢中心的健康體檢者18名，其中男12名、女6名，年齡18～60歲，平均(46.72±14.13)歲。入組標(biāo)準(zhǔn)：均排除神經(jīng)系統(tǒng)疾病、免疫疾病，無感染性疾病、腫瘤等相關(guān)疾病。病例組和對照組年齡性別相匹配。本研究中的所有患者及對照組志愿者均了解研究目的及研究意義，并自愿簽署研究知情同意書，愿意參與此次實(shí)驗(yàn)研究。

1.2 方法 所有入選的GBS患者分別在疾病急性期(即發(fā)病1～14 d)及恢復(fù)期(即發(fā)病30～60 d)采集外周血標(biāo)本10 mL，置于5 mL EDTA管中，每管5 mL。其中一管離心后取上清，將血漿凍存于-80℃，備用于ELISA法進(jìn)行sema-4A檢測，另一管血用于提取外周血單核細(xì)胞(PBMC)，采用美國BD FACSCantoTMII流式細(xì)胞儀檢測sema-4A在CD4+T細(xì)胞、B細(xì)胞、DC細(xì)胞的表達(dá)。先根據(jù)前向散射(FSC)和側(cè)向散射(SSC)光信號，對PBMC進(jìn)行設(shè)門，再分別對CD4+T細(xì)胞、DC細(xì)胞、B細(xì)胞進(jìn)行設(shè)門。根據(jù)各同型對照確定各細(xì)胞分群散點(diǎn)圖的分界游標(biāo)。每份標(biāo)本至少收集5×104個(gè)PBMC，用配套的軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，分別得到sema-4A在CD4+T細(xì)胞、B細(xì)胞、DC細(xì)胞的表達(dá)頻率(百分率)。分析不同疾病分期及不同分型GBS患者sema-4A表達(dá)，并分析急性期sema-4A水平與表達(dá)sema-4A的CD4+T細(xì)胞、B細(xì)胞、DC細(xì)胞頻率及Hughes評分的相關(guān)性。

本研究所有檢測項(xiàng)目均經(jīng)過三次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)重復(fù)驗(yàn)證。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。兩組間定量資料的比較采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)；多組定量資料的組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。相關(guān)分析采用Pearson相關(guān)性分析方法。計(jì)數(shù)資料樣本的比較釆用卡方檢驗(yàn)。以P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 GBS患者急性期、恢復(fù)期及對照組血漿sema-4A水平比較 具體見表1。GBS急性期、恢復(fù)期、對照組三組間血漿sema-4A水平比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=16.69，P=0.000)，GBS 患者急性期血漿中sema-4A表達(dá)水平高于恢復(fù)期(t=3.356，P=0.002)及對照組(t=3.261，P=0.003)；GBS患者恢復(fù)期血漿sema-4A表達(dá)水平與對照組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=0.723，P=0.568)。脫髓鞘型、軸索型GBS患者急性期血漿sema-4A水平均高于恢復(fù)期及對照組(均P<0.05)，急性期及恢復(fù)期脫髓鞘型與軸索型GBS之間比較sema-4A水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P>0.05)。

表1 各組血漿sema-4A水平比較(n=18，±s，ng/mL)

注：F值、P值為三組間比較所得；t值、P1值為脫髓鞘型與軸索型比較所得；與對照組比較，*P<0.05，**P<0.01；與恢復(fù)期比較，#P<0.01

表2 GBS患者與對照組表達(dá)sema-4A的DC細(xì)胞、B細(xì)胞和CD4+T細(xì)胞頻率比較

注：與對照組比較，*P<0.05，**P<0.01；與恢復(fù)期比較，#P<0.05

2.2 輕型與重型GBS患者血漿sema-4A水平比較 重型GBS患者急性期血漿sema-4A水平高于輕型GBS患者〔分別為0.7351±0.1172) ng/mL、(0.5009±0.0825) ng/mL，t=2.467,P=0.035〕。重型GBS患者恢復(fù)期血漿sema-4A水平與輕型GBS患者相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義〔分別為(0.1099±0.016) ng/mL、(0.1064±0.0194) ng/mL，t=0.962，P=0.773〕。

2.3 GBS患者急性期血漿sema-4A水平與hughes評分的相關(guān)性分析 GBS患者急性期血漿sema-4A水平與hughes評分呈正相關(guān)(r=0.7905，P=0.025)。

2.4 GBS患者與對照組表達(dá)sema-4A的DC細(xì)胞、B細(xì)胞和CD4+T細(xì)胞頻率比較 GBS患者急性期表達(dá)sema-4A的DC細(xì)胞、B細(xì)胞頻率均高于恢復(fù)期及對照組(均P<0.05)，對照組與GBS患者恢復(fù)期比較差異無明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；急性期、恢復(fù)期患者與對照組表達(dá)sema-4A的CD4+T細(xì)胞頻率差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。具體見表2。

2.5 GBS患者急性期表達(dá)sema-4A的CD4+T、B、DC細(xì)胞頻率與血漿sema-4A表達(dá)水平的相關(guān)性分析 GBS患者急性期表達(dá)sema-4A的DC細(xì)胞頻率與血漿sema-4A表達(dá)水平呈正相關(guān)(r=0.95，P=0.032)；表達(dá)sema-4A的B細(xì)胞、CD4+T頻率與血漿sema-4A表達(dá)水平不存在相關(guān)性(r=-0.301，P=0.45；r=0.029，P=0.67)。

3 討論

GBS是一種影響周圍神經(jīng)的炎性自身免疫性疾病，大量研究發(fā)現(xiàn)體液免疫與細(xì)胞免疫共同參與此病的發(fā)生[1]。sema-4A對于T細(xì)胞分化及功能調(diào)節(jié)具有重要的作用[5]。既往動(dòng)物研究表明，sema-4A參與Th1/Th2細(xì)胞比例的調(diào)節(jié)以及Th17細(xì)胞及Treg細(xì)胞的功能調(diào)節(jié)[10]。而T細(xì)胞及其分泌的細(xì)胞因子在GBS發(fā)病過程中發(fā)揮著重要作用[1]，由此可見sema-4A可能通過調(diào)節(jié)T細(xì)胞分化及功能參與GBS發(fā)病。

3.1 Sema-4A表達(dá)水平與GBS患者急性期嚴(yán)重程度呈正相關(guān) MS與GBS同是T細(xì)胞參與的脫髓鞘性疾病。既往多項(xiàng)研究表明，sema-4A在MS中發(fā)揮了重要作用。Nakatsuji等[11]研究發(fā)現(xiàn)，sema-4A在MS中的表達(dá)升高，通過調(diào)節(jié)Th17細(xì)胞的分化參與MS發(fā)病過程；而且MS患者sema-4A表達(dá)水平越高，病情越重，并且對IFN-β治療效果越差。一項(xiàng)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明sema-4A在實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎(experimental autoimmune encephalomyelitis，EAE)表達(dá)升高，并可抑制IFN-β對EAE的治療作用[12]。是否sema-4A也參與了GBS的疾病過程，本研究進(jìn)行了探索。本研究結(jié)果顯示，sema-4A在GBS患者急性期血漿中的表達(dá)水平較恢復(fù)期及對照組明顯升高，GBS急性期hughes評分為重型的患者sema-4A表達(dá)量較輕型患者升高，而且GBS急性期血漿sema-4A水平與hughes評分呈正相關(guān)，即hughes評分越高，sema-4A的表達(dá)水平越高。以上結(jié)果均提示sema-4A水平與GBS病情嚴(yán)重性有關(guān)，其對判定GBS疾病演變也可能具有一定的作用，由此推測sema-4A可能是GBS急性期促進(jìn)GBS病情發(fā)展的重要的細(xì)胞因子。

3.2 表達(dá)sema-4A的DC細(xì)胞、B細(xì)胞、CD4+T的細(xì)胞在GBS中的作用 Wang等[13]的臨床研究發(fā)現(xiàn)DC細(xì)胞在GBS急性期表達(dá)升高，并與GBS的嚴(yán)重程度存在正相關(guān)性，提示DC細(xì)胞在GBS發(fā)病機(jī)制中起重要主要，但其具體機(jī)制未明。既往研究發(fā)現(xiàn)sema-4A主要來源于DC細(xì)胞、B細(xì)胞、CD4+T細(xì)胞、巨噬細(xì)胞，而DC細(xì)胞來源的sema-4A在MS發(fā)病過程中起促進(jìn)作用[11]。本研究發(fā)現(xiàn)GBS急性期表達(dá)sema-4A的DC細(xì)胞及B細(xì)胞頻率均較恢復(fù)期及對照組升高，而且GBS急性期患者血漿sema-4A表達(dá)水平與表達(dá)sema-4A的DC細(xì)胞頻率呈正相關(guān)，而與表達(dá)sema-4A的B細(xì)胞頻率無相關(guān)性，同時(shí)表達(dá)sema-4A的CD4+T細(xì)胞頻率無明顯變化，提示DC細(xì)胞可能通過sema-4A參與GBS發(fā)病機(jī)制，DC細(xì)胞來源的sema-4A在GBS發(fā)病過程起一定的作用，其具體機(jī)制需進(jìn)一步深入研究。

綜上，本研究結(jié)果顯示sema-4A表達(dá)在GBS急性期顯著升高，并與疾病嚴(yán)重程度存在相關(guān)性，提示sema-4A參與了GBS急性期疾病過程，推測sema-4A可能是GBS病情嚴(yán)重程度的一個(gè)評價(jià)指標(biāo)，尚待進(jìn)一步深入研究。

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(本文編輯：鄒晨雙)

Analysis of sema-4A in plasma and immune cells of the patients with Guillain-Barré syndrome

ANKun*,ZHOUWenbin.

*DepartmentofNeurology,Huai’anFirstPeople’sHospital,NanjingMedicalUniversity,Huai’anJiangsu223300,China

AN Kun，Email：ankun10011@163.com

Objective To detect the expression of sema-4A,in plasma and CD4+T,B,and DC cells of GBS patients. Methods The plasma and PBMC were collected at the acute stage and recovery period in GBS patients and normal controls. GBS was divided into severe and mild groups according to the hughes scores. The expression of sema-4A was detected by ELISA.The expression of sema-4A in different stages of GBS was compared.The correlation between the level of sema-4A and the severity of GBS was analyzed. The DC,B and CD4+T cells expressed of sema-4A were detected by flow cytometry. The correlation of sema-4A expression on DC,B,and CD4+T cells with the severity of GBS was evaluated. Results The level of sema-4A in plasma significantly increased in the acute phase of GBS patients[(0.6162±0.1440)ng/mL,P<0.05]. The severe GBS patients showed higher plasma level of sema-4A at the acute phase[(0.7351±0.1172) ng/mL)] than mild GBS[(0.5009±0.0825)ng/mL,t=2.467,P=0.035].Hughes scores of acute phase GBS patients was positively correlated with the level of sema-4A in the plasma (r=0.79,P=0.025).DC cell and B cell expressing sema-4A in acute phase of GBS patients significantly increased (P<0.05).DC cells expressing sema-4A in acute phase of GBS patients was positively correlated with the level of sema-4A in the plasma (r=0.95,P=0.032).Conclusions Sema-4A may be an indicator representing disease severity in acute phase GBS.

Guillain-Barré Syndrome;sema-4A;DC cell

10.3969/j.issn.1006-2963.2017.04.007

223001 南京醫(yī)科大學(xué)附屬淮安第一醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科(安坤)；410078 中南大學(xué)湘雅醫(yī)學(xué)院神經(jīng)內(nèi)科(周文斌)

安坤，Email：ankun10011@163.com

R475.4

A

1006-2963(2017)04-0266-04

2017-01-11)