潘福勤，劉建輝，蔡春意，王靜，周靜，劉孟媛

(1滄州醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校，河北滄州061001；2滄州市人民醫(yī)院)

口腔鱗癌組織中PDCD5、Smac的表達(dá)及與患者臨床病理參數(shù)的關(guān)系

潘福勤1，劉建輝1，蔡春意2，王靜1，周靜1，劉孟媛1

(1滄州醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校，河北滄州061001；2滄州市人民醫(yī)院)

目的 觀察口腔鱗癌組織中程序性細(xì)胞死亡蛋白5(PDCD5)、第二線粒體源性激活半胱天冬酶(Smac)的表達(dá)變化，并探討其與患者臨床病理參數(shù)的關(guān)系。方法 口腔鱗癌患者55例，取其癌組織及癌旁組織(距癌組織2 cm)55例份。應(yīng)用免疫組化SP法檢測(cè)患者口腔鱗癌組織、癌旁組織 PDCD5、Smac蛋白表達(dá)，分析PDCD5、Smac蛋白表達(dá)與口腔鱗癌患者臨床病理參數(shù)的關(guān)系。結(jié)果 口腔鱗癌組織中PDCD5、Smac蛋白表達(dá)陽(yáng)性率低于癌旁組織(P均<0.05)。口腔鱗癌組織中PDCD5、Smac蛋白表達(dá)陽(yáng)性率與腫瘤的TNM分期以及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)(P均<0.05)，與腫瘤的分化程度無(wú)關(guān)(P均>0.05);PDCD5與Smac蛋白表達(dá)呈正相關(guān)(rs=0.542，P<0.05)。結(jié)論 口腔鱗癌組織中PDCD5、Smac蛋白表達(dá)降低，其二者低表達(dá)協(xié)同參與口腔鱗癌的發(fā)生發(fā)展。

口腔鱗癌；程序性細(xì)胞死亡蛋白5；第二線粒體源性激活半胱天冬酶；病理參數(shù)

鱗癌是我國(guó)口腔部常見(jiàn)惡性腫瘤，約占全部口腔部惡性腫瘤的80%以上[1，2]。研究表明，口腔鱗癌的發(fā)生是一個(gè)從正常黏膜上皮到黏膜白斑再到惡變的復(fù)雜過(guò)程，期間涉及到多種基因、蛋白和信號(hào)通路的異常改變[3]。程序性細(xì)胞死亡蛋白5(PDCD5)是我國(guó)北京大學(xué)人類疾病研究所發(fā)現(xiàn)的新型凋亡基因[4]。目前已有研究顯示,PDCD5與多種疾病的發(fā)生有關(guān)，尤其與惡性腫瘤的發(fā)生和發(fā)展有密切關(guān)系[5]。第二線粒體源性激活半胱天冬酶(Smac)是近年新發(fā)現(xiàn)的一種促凋亡基因，主要參與細(xì)胞凋亡的相關(guān)反應(yīng)。研究[6，7]發(fā)現(xiàn)，在食管癌、鼻咽癌中存在Smac的高表達(dá)。為探討口腔鱗癌組織中PDCD5、Smac的表達(dá)變化及其與臨床病理參數(shù)的關(guān)系，筆者進(jìn)行了相關(guān)探討。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選擇滄州市人民醫(yī)院2013年10月～2016年10月收治的口腔鱗癌患者55例，其中男35例、女20例，年齡20～68(41.2±3.4)歲。納入標(biāo)準(zhǔn)：原發(fā)于口腔，排除其他部位的轉(zhuǎn)移或者是復(fù)發(fā)型腫瘤；入院前未進(jìn)行相關(guān)治療，無(wú)其他重要臟器受損現(xiàn)象；臨床資料完善。分化程度：高分化11例、中分化19例、低分化25例；根據(jù)國(guó)際抗癌聯(lián)盟口腔鱗癌TNM分期標(biāo)準(zhǔn)：Ⅰ期8例、Ⅱ期17例、Ⅲ期19例、Ⅳ期11例；存在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移20例、無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移35例?；颊呔谑中g(shù)時(shí)留取癌組織及距癌組織2 cm的癌旁組織標(biāo)本，進(jìn)行石蠟包埋處理，并進(jìn)行0.5 mm連續(xù)切片。

1.2 組織PDCD5、Smac蛋白的檢測(cè) 采用免疫組化SP法。將組織進(jìn)行梯度乙醇脫水，蒸餾水沖洗，高溫高壓抗原修復(fù)，PBS緩沖液沖洗，加入生物素一抗，恒溫孵育過(guò)夜，加入山羊血清和生物素二抗，PBS緩沖液沖洗，DAB顯色，蘇木精復(fù)染，中性樹(shù)膠封片。具體的操作嚴(yán)格依照說(shuō)明書(shū)實(shí)施。設(shè)置相應(yīng)的陰性對(duì)照、陽(yáng)性對(duì)照，前者使用 PBS代替一抗，陽(yáng)性對(duì)照使用已知的陽(yáng)性切片。鼠抗人 PDCD5 單克隆抗體以及鼠抗人Sam單克隆抗體均購(gòu)自北京博奧森生物技術(shù)有限公司。氫體二氨基聯(lián)苯胺顯色的相關(guān)系統(tǒng)以及SP法的相關(guān)試劑盒均購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。

1.3 結(jié)果評(píng)價(jià) 口腔鱗癌組織中PDCD5蛋白表達(dá)于細(xì)胞質(zhì)以及細(xì)胞核中，Smac定位于細(xì)胞核中，表現(xiàn)出棕黃色顆粒狀。癌細(xì)胞染色強(qiáng)度計(jì)分：細(xì)胞不顯色為0分；淡黃色為1 分；棕黃色為2 分；棕褐色為3 分。根據(jù)陽(yáng)性癌細(xì)胞數(shù)量所占百分比進(jìn)行計(jì)分：癌細(xì)胞陰性為0 分，陽(yáng)性癌細(xì)胞≤10%為1 分，11%～50%為2 分，51%～75%為3 分，﹥75%為4分。相應(yīng)的染色強(qiáng)度和陽(yáng)性細(xì)胞所占百分比乘積大于3 則是免疫反應(yīng)陽(yáng)性。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS20.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)數(shù)資料以頻次或百分比表示，比較行χ2檢驗(yàn)。采用Spearman相關(guān)分析兩蛋白的關(guān)系。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 PDCD5、Smac蛋白在口腔鱗癌組織以及癌旁組織中的表達(dá) 口腔鱗癌組織中PDCD5蛋白、Smac蛋白表達(dá)陽(yáng)性率分別為29.09%(16/55)、12.73%(7/55)，低于癌旁組織的表達(dá)陽(yáng)性率[78.18%(43/55)、30.91%17/55)](χ2分別為26.650、5.581，P均<0.05)。

2.2 口腔鱗癌組織PDCD5、Smac蛋白表達(dá)與患者臨床病理特征之間的關(guān)系 見(jiàn)表1?？谇击[癌組織中PDCD5、Smac蛋白表達(dá)陽(yáng)性率與腫瘤TNM分期以及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)(P均<0.05)。

表1 口腔鱗癌組織PDCD5、Smac蛋白表達(dá)與患者臨床病理特征之間的關(guān)系(例)

2.3 口腔鱗癌組織中PDCD5、Smac蛋白之間的關(guān)系 口腔鱗癌組織組織中PDCD5與Smac蛋白表達(dá)存在正相關(guān)(rs=0.542，P<0.05)。

3 討論

人體口腔黏膜的上皮從正常狀態(tài)發(fā)展為鱗癌是一個(gè)涉及到多因素、多步驟的復(fù)雜過(guò)程。已有研究表明，在惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中，細(xì)胞凋亡扮演重要角色。細(xì)胞凋亡受到抑制將導(dǎo)致細(xì)胞生存期延長(zhǎng)、細(xì)胞惡變[8]。目前研究認(rèn)為，細(xì)胞凋亡主要有三條通路：死亡受體通路、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)通路和線粒體通路，三條通路可以相互關(guān)聯(lián)，共同發(fā)揮功能[9,10]。PDCD5定位于19q12～q13.1染色體上，最初在白血病細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)[4]。近年研究證實(shí)，PDCD5和多種病癥的發(fā)生以及發(fā)展相關(guān)聯(lián)，特別是在腫瘤組織中PDCD5水平下降。然而在口腔鱗癌組織中PDCD5的表達(dá)情況并無(wú)過(guò)多文獻(xiàn)報(bào)道[11]。Smac是近年發(fā)現(xiàn)的一種促凋亡基因，它主要參與凋亡過(guò)程中的下游反應(yīng)，較高表達(dá)的Smac能夠加速腫瘤細(xì)胞凋亡[12]。作為一種正常的線粒體型蛋白質(zhì)，一旦人體的細(xì)胞發(fā)生凋亡，此蛋白就會(huì)釋放到胞質(zhì)中，與Caspase-9相互爭(zhēng)奪凋亡抑制因子的BIR3區(qū)域；與此同時(shí)，聯(lián)合X-連鎖凋亡抑制蛋白的BIR2的相關(guān)基序[13]。有研究發(fā)現(xiàn)，腎細(xì)胞癌中Smac低水平表達(dá)能夠加速順鉑介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡現(xiàn)象[14]。

本研究通過(guò)對(duì)口腔鱗癌和癌旁組織PDCD5蛋白和Smac蛋白表達(dá)情況進(jìn)行對(duì)比，發(fā)現(xiàn)口腔鱗癌組織中PDCD5、Smac蛋白表達(dá)陽(yáng)性率低于癌旁組織，表明口腔鱗癌組織中存在PDCD5、Smac蛋白的低表達(dá)。PDCD5、Smac蛋白可能通過(guò)促進(jìn)細(xì)胞凋亡抑制細(xì)胞惡變，而當(dāng)其表達(dá)水平降低時(shí)，細(xì)胞凋亡受抑，細(xì)胞發(fā)生惡變的概率增高。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，口腔鱗癌組織中PDCD5、Smac蛋白表達(dá)陽(yáng)性率與腫瘤的TNM分期以及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，與腫瘤的分化程度無(wú)關(guān)。對(duì)兩種蛋白的相關(guān)性進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，PDCD5與Smac蛋白之間存在正相關(guān)。提示二者低表達(dá)共同參與口腔鱗癌的發(fā)生發(fā)展。

綜上所述，口腔鱗癌組織中PDCD5、Smac蛋白表達(dá)降低，且其表達(dá)與腫瘤TNM分期以及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，二者低表達(dá)可能共同參與口腔鱗癌的發(fā)生與發(fā)展。

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河北省科技計(jì)劃項(xiàng)目(162777266)。

劉建輝(E-mail: czliujianhui@163.com)

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B

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2017-05-14)