盛紅娜，王艷麗，吳璠，趙采云，李晶

(天津醫(yī)科大學第二醫(yī)院，天津300211)

·基礎(chǔ)研究·

卵巢癌細胞自噬后4種miRNAs表達變化及miR-144對mTOR的靶向調(diào)控作用

盛紅娜，王艷麗，吳璠，趙采云，李晶

(天津醫(yī)科大學第二醫(yī)院，天津300211)

目的 觀察雷帕霉素誘導卵巢癌SKOV3細胞自噬后miR-18a、miR-19a、miR-21及miR-144表達的變化，并以miR-144為研究對象，驗證其對自噬相關(guān)基因絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶(mTOR)的靶向調(diào)控作用。方法 分別用50 ng/mL雷帕霉素(雷帕霉素組)及10 nmol/L 3-甲基腺嘌呤(3-MA組)作用于SKOV3細胞2、12 h，收集細胞，并設(shè)立不進行任何處理的細胞作為對照組，提取總RNA;應用實時熒光定量PCR(qRT-PCR)檢測4種miRNAs的表達水平。培養(yǎng)SKOV3細胞，設(shè)立正常細胞組、miR-144 mimic組和miR-144 inhibitor組，分別將合成的miR-144 mimic及miR-144 inhibitor轉(zhuǎn)染到SKOV3細胞內(nèi)，正常細胞組不處理。應用qRT-PCR方法檢測各組的miR-144及mTOR mRNA表達量，應用Western blotting法檢測各組細胞中mTOR蛋白表達量。應用雙熒光素酶報告系統(tǒng)驗證miR-144與mTOR的相互作用關(guān)系。結(jié)果 對照組細胞miR-18a、miR-19a、miR-21及miR-144的表達量分別為1.003±0.021、1.001±0.039、1.014±0.016、1.028±0.037；雷帕霉素組4種miRNAs的表達量分別為6.310±0.025、1.200±0.058、52.310±0.005、63.490±0.024，其miR-18a、miR-21及miR-144高于對照組(P均<0.05)；3-MA組SKOV-3細胞的4種miRNAs的表達量分別為0.540±0.019、0.890±0.062、0.820±0.012和0.660±0.003，其miR-18a及miR-144低于對照組(P均<0.05)。與正常細胞組比較，miR-144 mimic組miR-144 mRNA表達量高(P<0.05)，mTOR mRNA和蛋白的表達量降低(P均<0.05)；miR-144 inhibitor組miR-144表達量下降(P<0.05)，mTOR mRNA和蛋白的表達量升高(P均<0.05)。miR-144 mimic分別與mTOR-WT及mTOR-Mut共轉(zhuǎn)染，前者的熒光表達量低于后者(P均<0.05)。結(jié)論 SKOV3細胞發(fā)生自噬后，miR-18a、miR-21及miR-144表達升高， miR-144可靶向抑制mTOR的表達。

卵巢腫瘤；微小RNA-144；絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶；細胞自噬

卵巢癌是目前最為常見的女性生殖系統(tǒng)三大惡性腫瘤，高于70%的患者確診時已屬晚期，是目前病死率最高的婦科腫瘤[1]。該病易轉(zhuǎn)移、易復發(fā)，且對化療易產(chǎn)生耐藥，其療效及遠期預后較差，5年生存率僅為30%左右[2]。微小RNA(miRNA)是一類內(nèi)源性的非編碼小分子RNA，其主要在基因轉(zhuǎn)錄后水平對靶基因進行調(diào)控，影響眾多重要的生物學過程。目前已證實miRNA與多種腫瘤的發(fā)病密切相關(guān)。自噬是一種高度保守的，可使溶酶體降解的生物學代謝過程，該過程主要通過吞噬自身細胞質(zhì)蛋白或細胞器，并與溶酶體融合形成自噬溶酶體，進而降解其所包裹的內(nèi)容物,使得某些腫瘤細胞凋亡或?qū)棺陨憝h(huán)境來逃避凋亡[3]。自噬的發(fā)生離不開自噬相關(guān)蛋白的調(diào)控，主要蛋白包括：ATG5、ATG12、絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶(mTOR)及Beclin1等。當機體細胞癌變后，多種自噬相關(guān)蛋白發(fā)生變化，直接或間接地影響腫瘤的發(fā)病過程。近年來，關(guān)于miRNAs對卵巢癌細胞自噬調(diào)控的研究逐漸增多，已被證實的對卵巢癌細胞自噬具有調(diào)控作用的miRNAs包括miR-30d、miR-29b及miR-152[4～6]。2016年1～10月，基于miRNA、自噬以及卵巢癌三者之間的相互作用關(guān)系，本課題應用雷帕霉素誘導自噬，同時應用3-甲基腺嘌吟(3-MA)抑制自噬，最終篩選出miR-144可能對卵巢癌的細胞自噬起著調(diào)控作用，通過一系列生物信息學試驗，驗證miR-144與潛在靶基因mTOR的相互作用關(guān)系，為進一步研究miR-144對卵巢癌細胞自噬的調(diào)控作用奠定理論依據(jù)，為卵巢癌的基因診斷及基因治療提供實驗基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料 卵巢癌細胞株 SKOV3 購于中國科學院上海細胞庫；質(zhì)粒提取試劑盒及膠回收試劑盒購自天根生化技術(shù)有限公司；限制性內(nèi)切酶購自大連寶生物技術(shù)有限公司；Western blotting所用一抗購自Abgent公司；雙熒光素酶檢測試劑盒及反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自Promega公司；胎牛血清及DMEM高糖培養(yǎng)基購自美國Hyclone公司；雷帕霉素購自上海前塵生物科技公司；3-MA購自Sigma公司；miR-18a、miR-19a、miR-21、miR-144、mTOR及mTOR/mut引物由上海華大基因公司合成； miR-144 mimic/inhibitor引物序列由上海吉瑪公司合成。

1.2 細胞培養(yǎng)及處理 應用10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基,37 ℃、5%CO2及100%飽和濕度的培養(yǎng)箱培養(yǎng)SKOV3細胞。將培養(yǎng)好的細胞接種于12孔板培養(yǎng)瓶中，待細胞生長匯合至75%～85%時，分別進行以下處理：雷帕霉素50 ng/mL(雷帕霉素組)反應2 h、3-MA 10 nmol/L(3-MA組)反應12 h，對照組細胞不經(jīng)過任何處理。

1.3 各組miRNAs表達量的檢測 提取各組細胞中的RNA,應用莖環(huán)引物進行逆轉(zhuǎn)錄，莖環(huán)引物分別為：miR-18a：5′CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGG-CAATTCAGTTGAGCTATCTGCACTAGATG3′；miR-19a：5′CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGT-TGAGTCAGTTTTGCATA3′；miR-21：5′CTCAACTGGTGTCGTGGACTCGGCAATTCAGTTGAGTCAACATC3′；miR-144：5′CTCAACTGGTGTCGTGGACTCGGCAATTCAGTTGAGAGTACATC3′；應用qRT-PCR方法檢測各組細胞內(nèi)miRNAs的表達量，qRT-PCR特異性引物序列分別為：miR-18a：5′ACACTCCAGCTGGGTAAGGTGCATCTAGTGCAGA3′；miR-19a：5′ACACTCCAGCTGGGTGTGCAAATCTATGCAAAAC3′；miR-21：5′ACACTCCAGCTGGGTAGCTTATCAGACTGATG3′；miR-144：5′ACACTCCAGCTGGGTACAGTATACATGATGTACT3′)。以U6為對比內(nèi)參，以2-ΔΔCt法計算目的基因表達量。

1.4 SKOV3細胞中miR-144、mTOR mRNA及mTOR蛋白表達的檢測 培養(yǎng)SKOV3細胞，設(shè)立正常細胞組、miR-144 mimic和miR-144 inhibitor組：分別將合成的miR-144 mimic及miR-144 inhibitor轉(zhuǎn)染到SKOV3細胞內(nèi)，正常細胞組不處理。提取各組細胞的總RNA，逆轉(zhuǎn)錄后應用qRT-PCR方法檢測各組miR-144及mTOR mRNA表達水平。試驗重復3次。分別提取各組細胞的蛋白質(zhì)，BCA法測定蛋白濃度，等量上樣，應用Western blotting法檢測各組細胞中mTOR的蛋白水平。

1.5 pMIR-Report載體構(gòu)建與鑒定 應用TargetScan、miRanda等生物信息學軟件進行miR-144的靶基因預測。選定mTOR作為預測靶基因，構(gòu)建pMIR-Report-mTOR-3′UTR(mTOR-WT)及其突變(mTOR-Mut)的重組質(zhì)粒，酶切及測序驗證結(jié)果。

1.6 miR-144與靶基因mTOR 3′UTR的靶向作用驗證 采用雙熒光素酶報告基因檢測系統(tǒng)。將NC/mTOR-WT、NC/mTOR-Mut及miR-144 mimic/mTOR-WT、miR-144 mimic/mTOR-Mut轉(zhuǎn)染到HEK-293T細胞中，以海腎熒光素酶作為內(nèi)參，轉(zhuǎn)染48 h后，加入反應試劑，在熒光倒置顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)染細胞的發(fā)光情況，于微孔板發(fā)光分析儀檢測其活性，每組試驗重復3次。

2 結(jié)果

2.1 三組SKOV3細胞4種miRNAs的表達水平比較 見表1。

表1 各組SKOV3細胞miRNAs的表達水平比較

注：與對照組比較，*P<0.05。

2.2 三組miR-144 mRNA相對表達量比較 正常細胞組miR-144 mRNA表達量為1.01±0.022，miR-144 mimic組為6.9±0.012，miR-144 inhibitor組為0.24±0.003，三組間比較，P均<0.05。

2.3 三組mTOR mRNA及蛋白的相對表達量比較 正常細胞組的mTOR mRNA表達量為1.00±0.02， miR-144 mimic組為0.15±0.00，miR-144 inhibitor組為2.01±0.00。正常細胞組中mTOR蛋白表達水平為78.33±0.24， miR-144 mimic組為22.56±0.11，miR-144 inhibitor組為225.89±0.68。與正常細胞組比較，miR-144 mimic組mTOR mRNA及蛋白表達水平降低，miR-144 inhibitor組升高(P均<0.05)。

2.4 miR-144對靶基因mTOR 3′UTR的靶向作用 microRNA網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)庫顯示，miR-144在mTOR mRNA的3′UTR上有堿基互補配對位點。NC/mTOR-WT的熒光表達量為54.10±0.23，NC/mTOR-Mut為57.2±0.31，二者相比，P>0.05；miR-144 mimic/mTOR-WT熒光表達量為9.88±0.07，miR-144 mimic/mTOR-Mut為56.10±0.19，兩者比較,P<0.05。

3 討論

mTOR是PI3k/Akt信號通路下游一個高度保守的調(diào)控分子，屬于磷脂酰肌醇激酶相關(guān)激酶家族成員。其主要參與細胞的生長、細胞周期進程及蛋白質(zhì)合成等生物學過程，可通過調(diào)控其下游的核糖體蛋白激酶活性，來影響自噬的發(fā)生。有研究者發(fā)現(xiàn)，當機體的癌癥相關(guān)基因PTEN被敲除或持續(xù)性激活Akt基因后，mTOR可調(diào)控FOXP3的表達，抑制Treg的分化，干擾腫瘤發(fā)生[7]；mTOR可促進起始蛋白翻譯，誘導腫瘤增殖，通過作用于胰島素樣生長因子-1，使得E-鈣黏附蛋白表達增多，從而促進卵巢癌細胞生長[8]。

miRNA是一類小分子RNA，其主要的生物學功能是通過與靶基因的3′UTR相互結(jié)合，導致基因表達受到影響。目前已有大量研究報道關(guān)于miRNAs與卵巢癌的相互作用關(guān)系，例如：在卵巢癌A2780細胞系及OV8細胞系中，miR-9的表達較正常組織相比明顯異常，并證實miR-9通過影響E-鈣黏蛋白的表達，干預卵巢癌上皮間質(zhì)細胞的轉(zhuǎn)化[9]。Zhao等[10]研究者發(fā)現(xiàn)，miR-203可通過抑制p53蛋白的表達，促進卵巢癌細胞的增殖與遷移;miR-203還可通過調(diào)控丙酮酸脫氫酶B，促進機體的糖酵解。Kleemann等[11]研究結(jié)果證實，miR-1912、miR-147b及miR-3073a在卵巢癌細胞系中表達異常，三種小分子可增強凋亡信號通路的活性，誘導促凋亡分子Bak1及Bax的表達;同時影響抑制凋亡的相關(guān)基因，如Bcl-2及Bcl-xL的表達。針對卵巢癌藥物敏感性的研究中，發(fā)現(xiàn)miR-100通過抑制mTOR及PLK1基因的表達，抑制腫瘤細胞增殖、影響細胞周期，且可促進腫瘤細胞凋亡[12]。

本研究結(jié)果顯示，經(jīng)雷帕霉素處理后的SKOV3細胞中miR-144的表達明顯上調(diào)，說明miR-144可能對SKOV3細胞的自噬過程存在潛在的調(diào)控作用。通過轉(zhuǎn)染miR-144 mimic，使得細胞內(nèi)miR-144呈過表達狀態(tài)，此時細胞內(nèi)mTOR mRNA及蛋白質(zhì)的表達水平明顯降低；而轉(zhuǎn)染了miR-144 inhibitor后，miR-144的表達減少的同時，mTOR mRNA和蛋白質(zhì)的表達水平有所升高；說明miR-144的表達水平明顯影響了mTOR的表達。雙熒光素酶報告基因檢測結(jié)果顯示，miR-144與mTOR-WT共轉(zhuǎn)染后，熒光表達量明顯降低，而將miR-144 mimic同mTOR-Mut相結(jié)合，熒光表達量無明顯變化，此實驗結(jié)果進一步說明， miR-144與mTOR具有靶向作用關(guān)系。因此，miR-144很可能通過靶向抑制mTOR的表達水平來影響卵巢癌細胞的自噬過程。該實驗結(jié)果為診斷和預防卵巢癌的標志物研究提供了新的靶點，為治療卵巢癌的藥物研究開拓新的思路。

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R711.75

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2017-03-02)