劉林森，龍文汀，張悅，劉樹旺，劉利平

(1深圳市人民醫(yī)院·暨南大學(xué)第二臨床醫(yī)學(xué)院，廣東深圳 518020;2北京大學(xué)深圳醫(yī)院)

索拉非尼對肝癌細(xì)胞中PD-L1表達(dá)的影響及機(jī)制

劉林森1，龍文汀2，張悅1，劉樹旺1，劉利平1

(1深圳市人民醫(yī)院·暨南大學(xué)第二臨床醫(yī)學(xué)院，廣東深圳 518020;2北京大學(xué)深圳醫(yī)院)

目的 探討索拉非尼對肝癌細(xì)胞中程序性死亡分子配體1(PD-L1)表達(dá)的影響及可能的機(jī)制。方法 分別將0、2.5、5、10 μmol /L 索拉菲尼培養(yǎng)液作用于肝癌細(xì)胞株HepG2，Real-time PCR和Western blotting法檢測不同濃度索拉菲尼處理后HepG2細(xì)胞中PD-L1和缺氧誘導(dǎo)因子1α(HIF-1α)的表達(dá)水平。分別用pEGFP-N1-HIF-1α(pEGFP-N1-HIF-1α組)、shRNA-HIF-1α(shRNA-HIF-1α組)和對照質(zhì)粒pEGFP-N1、shRNA-control(pEGFP-N1組、shRNA-control組)轉(zhuǎn)染HepG2細(xì)胞，檢測各組HIF-1α、PD-L1 mRNA及蛋白的表達(dá)。結(jié)果 索拉菲尼干預(yù)后，HepG2細(xì)胞中PD-L1和HIF-1α mRNA及蛋白的表達(dá)下調(diào)，呈濃度依賴性(P均<0.05)。與pEGFP-N1組比較，pEGFP-N1-HIF-1α組PD-L1、HIF-1α mRNA及蛋白表達(dá)水平升高(P均<0.01)；與shRNA-control組比較，shRNA-HIF-1α組PD-L1、HIF-1α mRNA及蛋白表達(dá)水平降低(P均<0.01)。結(jié)論 索拉非尼可通過抑制HIF-1α信號通路抑制肝癌細(xì)胞中PD-L1的表達(dá)。

肝腫瘤；索拉非尼；程序性死亡分子配體1;缺氧誘導(dǎo)因子1α

肝癌是我國常見的惡性腫瘤，起病隱匿，多數(shù)患者確診時(shí)已是晚期[1]。晚期肝癌的治療方法非常有限，索拉非尼是目前治療晚期肝癌的主要藥物之一，其能夠同時(shí)抑制肝癌細(xì)胞增殖和腫瘤血管生長，延長了晚期肝癌患者的生存時(shí)間[2,3]。最近有文獻(xiàn)報(bào)道，索拉非尼還可以增強(qiáng)CD8+T細(xì)胞的免疫功能，減少程序性死亡分子受體 1(PD-1)陽性的CD8+T細(xì)胞的比例和減少免疫抑制細(xì)胞Treg細(xì)胞及骨髓來源的抑制性細(xì)胞的數(shù)量，從而逆轉(zhuǎn)肝癌組織的局部免疫抑制狀態(tài)[4,5]。程序性死亡分子配體1(PD-L1)是PD-1的配體，通過與T 淋巴細(xì)胞表面的PD-1蛋白結(jié)合，抑制T淋巴細(xì)胞的增殖與活化，導(dǎo)致了腫瘤免疫失活和免疫逃逸[6]。PD-L1在肝癌組織中高表達(dá)，與患者預(yù)后呈負(fù)相關(guān)[7,8]。我們前期研究顯示，索拉非尼可抑制缺氧誘導(dǎo)因子1α(HIF-1α)的表達(dá)[9]，有文獻(xiàn)報(bào)道，HIF-1α可以上調(diào)PD-L1的表達(dá)[10,11]。2016年6月～2017年2月，本研究探討了索拉非尼對肝癌細(xì)胞PD-L1表達(dá)的影響及機(jī)制?，F(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 材料 肝癌細(xì)胞HepG2購自中國細(xì)胞庫典藏細(xì)胞中心，采用含10%胎牛血清(FBS)的DMEM培養(yǎng)液，置于37 ℃二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng);脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑lipofectamine 2000為美國Life Technologies公司產(chǎn)品，DMEM、FBS購于Hyclone公司，PCR 引物由Invitrogen公司合成。鼠抗人HIF-1α單克隆抗體購于Santa Cruz 公司。HIF-1α過表達(dá)質(zhì)粒pEGFP-N1-HIF-1α、HIF-1α干擾質(zhì)粒shRNA-HIF-1α和對照質(zhì)粒購自上海吉凱基因化學(xué)技術(shù)有限公司。索拉非尼購于LC Labortories公司。Cocl2購于Sigma公司。

1.2 細(xì)胞處理 將HepG2細(xì)胞種植于6孔板中，經(jīng)24 h 貼壁后，分別加入含0、2.5、5、10 μmol/L索拉菲尼的培養(yǎng)液，同時(shí)加入100 μmol/L Cocl2作用24 h，收獲細(xì)胞，提取RNA和總蛋白。分別用pEGFP-N1-HIF-1α(pEGFP-N1-HIF-1α組)、shRNA-HIF-1α(shRNA-HIF-1α組)和對照質(zhì)粒pEGFP-N1、shRNA-control(pEGFP-N1組、shRNA-control組)轉(zhuǎn)染HepG2細(xì)胞，按照說明書步驟操作，48 h后收獲細(xì)胞提取RNA和總蛋白。

1.3 HepG2細(xì)胞中PD-L1和HIF-1α mRNA的表達(dá) 采用Real-time PCR法。測RNA的濃度和純度后取1 μg mRNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，10倍稀釋后使用。HIF-1α引物序列：上游：5′-ACTTCTGGATGCTGGTGATTTG-3′，下游：5′-GCTTCGCTGTGTGTTTTGTTCT-3′。PD-L1引物序列：上游：5′-CATTTGCTGAACGCCCCATA-3′，下游：5′-CTGCTTGTCCAGATGACTTCG-3′。內(nèi)參照β-actin引物序列：上游：5′-AGAGGGAAATCGTGCGTGAC-3′，下游：5′-CAATAGTGATGACCTGGCCGT-3′。總反應(yīng)體積為20 μL：sybrGreen Mix 10 μL，cDNA模板2 μL，上游引物(10 μmol/L) 0.8 μL，下游引物(10 μmol/L)0.8 μL，去離子水6.4 μL。反應(yīng)條件：95 ℃變性1 min，40次循環(huán)內(nèi)95 ℃變性30 s、55 ℃退火30 s、72 ℃延伸30 s，最后72 ℃延伸10 min。重復(fù)3次。反應(yīng)結(jié)束時(shí)在ABI 7 000軟件系統(tǒng)中分別調(diào)整基線和閾值，計(jì)算出各反應(yīng)孔的Ct值。Ct值代表基因的拷貝數(shù)，ΔΔCt=(目的基因Ct-內(nèi)參基因Ct)/(陰性對照Ct-內(nèi)參基因Ct)，基因表達(dá)的變化倍率=2-ΔΔCt。

1.4 HepG2細(xì)胞中HIF-1α和PD-L1蛋白表達(dá)的檢測 采用Western blotting法。蛋白定量后分別經(jīng)10%的聚丙烯酰胺凝膠電泳轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上。加入鼠抗人HIF-1α單克隆抗體1∶250稀釋；鼠抗人PD-L1單克隆抗體1∶500稀釋；鼠抗人β-actin單克隆抗體1∶2 000稀釋。加入HRP標(biāo)記的兔抗鼠二抗，1∶2 000稀釋。ECL顯色，計(jì)算機(jī)掃描蛋白質(zhì)條帶并作灰度分析。以β-actin作內(nèi)參照, 分別用PD-L1/β-actin、HIF-1α/β-actin代表PD-L1、HIF-1α的相對表達(dá)水平，每個樣本重復(fù)3次。

2 結(jié)果

2.1 不同濃度索拉非尼作用后HepG2細(xì)胞PD-L1和HIF-1α表達(dá)的變化 0、2.5、5、10 μmol/L索拉非尼處理后，HepG2細(xì)胞PD-L1 mRNA相對表達(dá)量分別為1.00±0.01、0.68±0.02、0.45±0.02、0.25±0.01，HIF-1α mRNA相對表達(dá)量分別為1.00±0.03、0.97±0.04、0.95±0.03、0.91±0.06；PD-L1 蛋白相對表達(dá)量分別為1.00±0.03、0.41±0.05、0.26±0.04、0.16±0.03，HIF-1α 蛋白相對表達(dá)量分別為1.00±0.02、0.69±0.06、0.24±0.05、0.13±0.02。HepG2細(xì)胞經(jīng)過2.5、5、10 μmol/L索拉非尼處理后，無論mRNA水平還是蛋白水平，PD-L1、HIF-1α表達(dá)均降低(P均<0.01)，不同濃度間各指標(biāo)比較，P均<0.01，索拉非尼導(dǎo)致二者水平降低且呈濃度依賴性(P<0.01)。

2.2 各組HIF-1α、PD-L1表達(dá)的比較 見表1。

表1 各組HIF-1α、PD-L1表達(dá)的比較

注：與pEGFP-N1組比較，*P<0.01；與shRNA-control組比較，#P<0.01。

3 討論

索拉非尼是一種口服的多種激酶抑制劑，一方面，抑制包括C-Raf、B-Raf 在內(nèi)的絲/蘇氨酸蛋白激酶活性，阻礙Raf/MEK/ERK通路的信號傳導(dǎo)，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡；另一方面，抑制多種與新生血管生成和腫瘤發(fā)展相關(guān)的受體酪氨酸激酶活性，包括與促血管生成相關(guān)的VEGFR-2 、VEGFR-3和 PDGFR-β，與腫瘤生成相關(guān)的c-kit和Flt-3等，阻斷腫瘤新生血管生成，間接抑制腫瘤細(xì)胞生長[2,3]。除此之外，文獻(xiàn)報(bào)道，索拉非尼還可以逆轉(zhuǎn)肝癌的免疫抑制狀態(tài)[4,5]。

免疫抑制和免疫逃逸是腫瘤發(fā)生、發(fā)展的主要原因[6]。研究發(fā)現(xiàn)，免疫抑制與免疫逃逸和腫瘤細(xì)胞PD-L1的過表達(dá)密切相關(guān)。腫瘤細(xì)胞可通過其表面的PD-L1與免疫細(xì)胞T細(xì)胞表面的PD-1結(jié)合，傳導(dǎo)抑制性信號，使得T細(xì)胞不能識別腫瘤細(xì)胞和向腫瘤細(xì)胞發(fā)出攻擊信號，導(dǎo)致了腫瘤細(xì)胞的免疫逃逸[6]。多種腫瘤組織中PD-L1高表達(dá)的患者預(yù)后較差，較易出現(xiàn)復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移[7～9]。因此阻斷PD-L1或下調(diào)PD-L1的表達(dá)有可能恢復(fù)T細(xì)胞對腫瘤的殺傷功能，抑制腫瘤復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移。目前PD-L1抗體在臨床抗腫瘤治療中也獲得了較好的療效。

研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤細(xì)胞的PD-L1過表達(dá)和缺氧微環(huán)境密切相關(guān)。缺氧條件下，PD-L1可在HIF-1α的誘導(dǎo)下上調(diào)其在腫瘤細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、骨髓來源的抑制性細(xì)胞及樹突狀細(xì)胞中的表達(dá)，其作用非常迅速且具有一定的選擇性，其在腫瘤區(qū)域中的表達(dá)相對外周淋巴器官(脾臟) 有明顯差異[10,11]。當(dāng)使用HIF-1α信號通路阻斷劑時(shí)，腫瘤細(xì)胞表面的PD-L1表達(dá)下降，腫瘤細(xì)胞對CTL 細(xì)胞介導(dǎo)的溶解作用的耐受性下降，進(jìn)一步提示了HIF-1α在由PD-L1介導(dǎo)的免疫抑制和免疫逃逸中的關(guān)鍵作用[12]。

我們前期研究發(fā)現(xiàn)索拉非尼可通過阻斷mTOR/p70S6K/4E-BP1和ERK信號通路阻斷HIF-1α的表達(dá)[9]。本研究結(jié)果顯示，索拉菲尼干預(yù)后，HepG2細(xì)胞中PD-L1和HIF-1α的表達(dá)下調(diào)，呈濃度依賴性。上調(diào)HIF-1α的表達(dá)后PD-L1的表達(dá)上調(diào)，干擾HIF-1α的表達(dá)后PD-L1的表達(dá)下調(diào)。提示索拉非尼可通過抑制HIF-1α信號通路抑制PD-L1蛋白及基因的表達(dá)，且呈濃度依賴性。索拉非尼可能一定程度上恢復(fù)了T細(xì)胞對肝癌細(xì)胞的免疫殺傷作用，這可能是其有效治療肝癌又一新的作用機(jī)制。本研究觀察都是基于細(xì)胞水平，尚需通過動物實(shí)驗(yàn)和體內(nèi)實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證。

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Effect of sorafenib on expression of PD-L1 in hepatocellular carcinoma cells

LIULinsen1,LONGWenting,ZHANGYue,LIUShuwang,LIULiping

(ShenzhenPeople'sHospital,Shenzhen518020,China)

Objective To investigate the effect of sorafenib on the expression of programmed cell death ligand 1(PD-L1) in the hepatocellular carcinoma cells and the underlying mechanism. Methods Real-time PCR and Western blotting was applied to detect the mRNA and protein expression levels of PD-L1 and hypoxia-inducible factor-1α (HIF-1α) in HepG2 cells treated with 0, 2.5, 5, 10 μmol/L sorafenib, respectively. HepG2 cells were transfected with pEGFP-N1-HIF-1α (pEGFP-N1-HIF-1α group), shRNA-HIF-1α (shRNA-HIF-1α group) and the control plasmids including pEGFP-N1 and shRNA-control (pEGFP-N1 group, shRNA-control group), and then the mRNA and protein expression levels of HIF-1α and PD-L1 were detected. Results The mRNA and protein expression levels of PD-L1 and HIF-1α in HepG2 cells were down-regulated after sorafenib intervention in a dose-dependent manner (bothP<0.05). Compared with the pEGFP-N1 group, the mRNA and protein expression levels of PD-L1 and HIF-1α increased in the pEGFP-N1-HIF-1α group (bothP<0.01). Meanwhile, compared with the shRNA-control group, the mRNA and protein expression levels of PD-L1 and HIF-1α significantly decreased in the shRNA-HIF-1α group (bothP<0.01).Conclusions Sorafenib can inhibit the expression of PD-L1 in liver cancer cells through inhibiting HIF-1α signaling pathway.

liver neoplasms; sorafenib; programmed cell death ligand 1; hypoxia-inducible factor-1α

國家自然科學(xué)基金青年基金項(xiàng)目(81402041);深圳市科技創(chuàng)新項(xiàng)目(JCYJ20160422170206664，JCYJ20150403101028198)。

劉林森(1982-)，男，碩士，主要研究方向?yàn)楦伟┑幕A(chǔ)與臨床。E-mail: 38284540@qq.com

劉利平(1982-)，男，副主任醫(yī)師，主要研究方向?yàn)楦伟┑幕A(chǔ)和臨床。E-mail: leoliping@aliyun.com

10.3969/j.issn.1002-266X.2017.29.002

R735.7

A

1002-266X(2017)29-0005-03

2017-04-08)