顧青 趙艷 陳華

（上海市寶山區(qū)中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院婦產(chǎn)科 上海201999）

論著

MTA1基因沉默對(duì)宮頸癌細(xì)胞增殖及轉(zhuǎn)移能力的影響

顧青 趙艷 陳華

（上海市寶山區(qū)中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院婦產(chǎn)科 上海201999）

目的：探討MTA1基因沉默對(duì)宮頸癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移增殖的影響。方法：用慢病毒轉(zhuǎn)染法穩(wěn)定轉(zhuǎn)染Siha細(xì)胞，轉(zhuǎn)染同時(shí)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)分組。用RT-PCR技術(shù)和蛋白印跡法測(cè)定宮頸癌Siha、Hela細(xì)胞中MTA1 mRNA和蛋白的表達(dá)。Transwell體外侵襲實(shí)驗(yàn)檢測(cè)轉(zhuǎn)染后Siha細(xì)胞的遷移能力，MTT檢測(cè)法和克隆形成實(shí)驗(yàn)法檢測(cè)轉(zhuǎn)染后Siha細(xì)胞的細(xì)胞增殖能力，F(xiàn)ACS細(xì)胞凋亡法檢測(cè)轉(zhuǎn)染后Siha細(xì)胞的細(xì)胞凋亡率，PI-FACS細(xì)胞周期法檢測(cè)轉(zhuǎn)染后Siha細(xì)胞的各個(gè)生長周期的細(xì)胞數(shù)。結(jié)果：（1）Transwell體外侵襲實(shí)驗(yàn)：相比NC組，KD組Transwell轉(zhuǎn)移率經(jīng)T-Test分析P=2.61E-08＜0.05。（2）MTT檢測(cè)結(jié)果表明：相比NC組，KD組細(xì)胞增殖減緩。（3）克隆形成實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：相比NC組，KD組克隆數(shù)經(jīng)T-Test分析P值=0.000 6＜0.05。（4）FACS細(xì)胞凋亡：相比兩個(gè)對(duì)照組，KD組凋亡率經(jīng)T-Test分析P＜0.05。結(jié)論：MTA1基因促進(jìn)宮頸癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移和增殖，沉默MTA1基因表達(dá)能使宮頸癌細(xì)胞增殖及遷移能力下降，加速宮頸癌細(xì)胞的凋亡，為抑制腫瘤轉(zhuǎn)移奠定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)，最后為宮頸癌的新型藥物性靶向治療提供有力的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

宮頸癌；腫瘤轉(zhuǎn)移；MTA1基因

轉(zhuǎn)移是惡性腫瘤的主要特征之一，其間涉及多種機(jī)制，包括癌細(xì)胞離開原有部位，通過血管和淋巴管浸潤，在內(nèi)皮細(xì)胞和基質(zhì)中滯留，誘導(dǎo)新的血管形成，逃避機(jī)體的腫瘤免疫監(jiān)視而形成新的轉(zhuǎn)移灶。宮頸癌是威脅全球婦女生命的第二常見腫瘤，轉(zhuǎn)移仍然是致死的主要原因。近年來，隨著腫瘤機(jī)制的深入研究，腫瘤形成和轉(zhuǎn)移的信號(hào)通路中的關(guān)鍵調(diào)控因子被一一發(fā)現(xiàn)，腫瘤的靶向治療發(fā)展迅速，可能為宮頸治療帶來突破。大量研究表明，某些蛋白在腫瘤的轉(zhuǎn)移過程中起著重要的作用，其中轉(zhuǎn)移相關(guān)基因1（Metastasis Associated Gene 1，MTA1）是近年來發(fā)現(xiàn)的與腫瘤發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)移有密切關(guān)系的蛋白之一。本實(shí)驗(yàn)通過慢病毒感染技術(shù)沉默宮頸癌細(xì)胞中MTA1的表達(dá)，檢測(cè)宮頸癌細(xì)胞生物學(xué)行為的改變，為深入研究MTA1基因在宮頸癌浸潤轉(zhuǎn)移中的作用奠定基礎(chǔ)?，F(xiàn)介紹如下：

1 材料與方法

1.1 材料來源 人宮頸癌細(xì)胞系Siha（HPV16陽性的宮頸癌細(xì)胞）、Hela（HPV18陽性的宮頸癌細(xì)胞）由上海吉?jiǎng)P基因公司提供保存，Siha、Hela細(xì)胞采用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)。

1.2 方法

1.2.1 高表達(dá)MTA1 mRNA和蛋白的宮頸癌細(xì)胞系的篩選 （1）逆轉(zhuǎn)錄（RT）-PCR技術(shù)檢測(cè)Siha、Hela細(xì)胞中MTA1 mRNA的表達(dá)：分別提取Siha、Hela細(xì)胞總RNA，逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，PCR方法擴(kuò)增MTA1。MTA1基因的上游引物序列：AAGAAGGCGAGGAGGATGG，下游引物序列：ATCTGCTTGTCTGTGAGTGG，擴(kuò)增片段長85 bp。循環(huán)參數(shù)：94 ℃預(yù)變性5 min，94 ℃，40 s，60 ℃，40 s，72 ℃，40 s，27個(gè)循環(huán)，72 ℃延伸7 min。以β-actin為內(nèi)參基因，擴(kuò)增片段長210 bp，1.5%瓊脂糖凝膠電泳。（2）Western Blot的方法檢測(cè)Siha、Hela細(xì)胞中目的基因的蛋白表達(dá)量。分別提取Siha、Hela細(xì)胞總蛋白，以β-actin為內(nèi)參照，進(jìn)行SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉(zhuǎn)膜后與1:1 000稀釋的MTA1單克隆抗體（美國CST公司），4 ℃孵育過夜后，加入rabbit IgG二抗（美國Santa Cruz公司）孵育1.5 h，曝光顯影。選擇相對(duì)高表達(dá)MTA1 mRNA和蛋白的宮頸癌細(xì)胞系進(jìn)行后續(xù)的基因沉默實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 Siha細(xì)胞的轉(zhuǎn)染及分組 將Siha細(xì)胞胰酶消化，完全培養(yǎng)基制成（3～5）×104個(gè)/ml細(xì)胞懸液，按照預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，更換感染培養(yǎng)基，加入最適病毒量進(jìn)行感染。選擇感染后8～12 h更換為常規(guī)培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，細(xì)胞感染效率達(dá)到80%以上。于感染48～72 h后，換用含抗生素（5 μg/ml puromycin）的培養(yǎng)基篩選細(xì)胞。轉(zhuǎn)染同時(shí)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)分組：（1）Mock組：正常Siha細(xì)胞、未加病毒感染的細(xì)胞組；（2）NC組：正常Siha細(xì)胞、加陰性對(duì)照病毒CON077感染的細(xì)胞組；（3）KD組：正常Siha細(xì)胞、加MTA1基因shRNA病毒感染的細(xì)胞組。

1.2.3 轉(zhuǎn)染后Siha細(xì)胞的遷移能力檢測(cè) Transwell體外侵襲實(shí)驗(yàn)法：將Transwell小室置于24孔板中，每個(gè)孔上室加入100 μl細(xì)胞懸液，下室內(nèi)加入600 μl 30% FBS培養(yǎng)基，每組設(shè)3個(gè)重復(fù)孔，常規(guī)培養(yǎng)12 h。取出Transwell小室，95%乙醇固定，用棉拭子輕輕移去小室內(nèi)非轉(zhuǎn)移細(xì)胞，Giemsa染色液進(jìn)行細(xì)胞染色。顯微鏡下觀察并照相。以200 X的照片來計(jì)數(shù)，進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

1.2.4 轉(zhuǎn)染后Siha細(xì)胞的細(xì)胞增殖能力檢測(cè) （1）MTT檢測(cè)法：將各實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞分別接種于96孔板中，進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)。分別在種植細(xì)胞后1、2、3、4、5 d收集細(xì)胞，置酶標(biāo)儀檢測(cè)OD490值（反映了具有活力的細(xì)胞數(shù)量）。每組設(shè)5個(gè)平行孔，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。（2）克隆形成實(shí)驗(yàn)法：將各實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞胰酶消化，于6孔板培養(yǎng)板中進(jìn)行細(xì)胞接種，繼續(xù)培養(yǎng)到14 d，中途每隔3 d進(jìn)行換液并觀察細(xì)胞狀態(tài)。實(shí)驗(yàn)終止前熒光顯微鏡下對(duì)細(xì)胞克隆進(jìn)行拍照，PBS洗滌細(xì)胞1次。每孔加入1 ml 4%多聚甲醛，固定細(xì)胞30～60 min，PBS洗滌細(xì)胞1次。GIEMSA細(xì)胞染色，顯微鏡下進(jìn)行克隆計(jì)數(shù)（鏡下每50個(gè)細(xì)胞算1個(gè)克隆）并照相。

1.2.5 轉(zhuǎn)染后Siha細(xì)胞的細(xì)胞凋亡率檢測(cè) Siha細(xì)胞經(jīng)相應(yīng)處理后，胰酶消化，收集細(xì)胞，預(yù)冷的D-Hanks洗滌細(xì)胞。200 μl結(jié)合緩沖液重懸細(xì)胞，加入10 μl Annexin V-APC染色，室溫避光10～15 min。根據(jù)細(xì)胞量，補(bǔ)加400～800 μl結(jié)合緩沖液，上機(jī)檢測(cè)。

1.2.6 轉(zhuǎn)染后Siha細(xì)胞的生長周期檢測(cè) Siha細(xì)胞經(jīng)相應(yīng)處理后，進(jìn)行胰酶消化，收集細(xì)胞，預(yù)冷的D-Hanks洗滌細(xì)胞沉淀1次。1 300 rmp、5 min離心，4 ℃預(yù)冷的75%乙醇固定細(xì)胞至少1 h，進(jìn)行細(xì)胞染色，上流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 數(shù)據(jù)處理采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件，計(jì)數(shù)資料間的比較用方差分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 高表達(dá)MTA1 mRNA和蛋白的宮頸癌細(xì)胞系的篩選結(jié)果 RT-PCR技術(shù)和蛋白印跡法檢測(cè)顯示，Siha細(xì)胞中MTA1 mRNA及蛋白的表達(dá)強(qiáng)度明顯高于Hela細(xì)胞。因此，本研究選擇相對(duì)高表達(dá)MTA1 mRNA和MTA1蛋白的Siha細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)的基因沉默實(shí)驗(yàn)。見圖1，圖2。

圖1 RT-PCR測(cè)定兩種細(xì)胞中MTA1 mRNA的表達(dá)

圖2 WB測(cè)定兩種細(xì)胞中MTA1 mRNA的表達(dá)

2.2 轉(zhuǎn)染后Siha細(xì)胞生物學(xué)行為的改變

2.2.1 轉(zhuǎn)染后Siha細(xì)胞的遷移能力檢測(cè) 每孔的遷移細(xì)胞數(shù)（Migratory Cells Per Field）Mock組（209±3.82），NC組（222±1.87），KD組（78±0.78）。Migration Fold Change（細(xì) 胞 遷 移 的 變 化 率）Mock組（0.94±0.02），NC組（1.00±0.01），KD組（0.35±0.01）。Mock組 與NC組 對(duì) 比，P值=0.06。Mock與KD對(duì)比，P值=5.262E-07。KD與NC組對(duì)比，P值=2.61E-08。相比NC組，KD組Transwell轉(zhuǎn)移率經(jīng)T-Test分析P＜0.05。見圖3～5。

圖3 各實(shí)驗(yàn)組在transwell小室內(nèi)孵育24 h后的轉(zhuǎn)移細(xì)胞數(shù)對(duì)比

圖4 各實(shí)驗(yàn)組在transwell小室內(nèi)孵育24 h后的轉(zhuǎn)移細(xì)胞數(shù)與NC的變化值對(duì)比

圖5 Mock x 200 NC x 200 KD x 200

2.2.2 轉(zhuǎn)染后Siha細(xì)胞的細(xì)胞增殖能力檢測(cè) （1）MTT檢測(cè)法：第5天的Mock組的OD490為（0.647± 0.003 9），NC組（0.637±0.003 6），KD組（0.363±0.005 7）。Mock組與NC組對(duì)比，P值= 0.022 9。Mock組與KD組對(duì)比，P值=3.77E-07。KD組與NC組對(duì)比，P值=2.5E-07。MTT檢測(cè)結(jié)果表明：相比NC組，KD組細(xì)胞增殖減緩。見圖6，圖7。

圖6 各實(shí)驗(yàn)組在酶標(biāo)儀對(duì)波長490 nm的光的吸收率隨時(shí)間變化的對(duì)比

圖7 各實(shí)驗(yàn)組在酶標(biāo)儀對(duì)波長490 nm的光的吸收率變化倍數(shù)的對(duì)比

（2）克隆形成實(shí)驗(yàn)法：Mock組的克隆數(shù)（30±5），NC組（26±1），KD組（9±2）。Mock組與NC組對(duì)比，P值=0.309。Mock組與KD組對(duì)比，P值=0.002 5。KD組與NC組對(duì)比，P值=0.000 6?？寺⌒纬蓪?shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：相比NC組，KD組克隆數(shù)經(jīng)T-Test分析P＜0.05。見圖8，圖9。

圖8 各實(shí)驗(yàn)組形成克隆數(shù)量的對(duì)比

圖9 Mock x 100 NC x 100 KD x 100

（3）轉(zhuǎn)染后Siha細(xì)胞的FACS細(xì)胞凋亡檢測(cè)：Mock組的凋亡率（1.65±0.064 3）%，NC組（4.66±0.058 7）%，KD組（8.63±0.271 9）%。Mock組與KD組對(duì)比，P值=1.7E-06。KD組與NC組對(duì)比，P值= 1.6E-05。相比兩個(gè)對(duì)照組，KD組凋亡率經(jīng)T-Test分析P＜0.05。見圖10。

圖10 MOCK、NC、KD組凋亡率對(duì)比

（4）轉(zhuǎn)染后Siha細(xì)胞的PI-FACS細(xì)胞周期檢測(cè)：Mock組在G1期（DNA合成前期）的細(xì)胞百分比為（55.15±1.0376）%，S期（DNA合 成 期）（18.8± 1.8143）%，G2/M期（DNA復(fù) 制 結(jié) 束）（26.06± 1.1647）%，NC組在G1期的細(xì)胞百分比為（57.34± 0.4159）%，S期（20.45±1.055）%，G2/M期（22.22± 0.5645）%。KD組與NC組對(duì)比，G1期的P值= 0.716，S期P值=0.908，G2/M期P值=0.0656，相比NC組，KD組處于S期、G1期和G2/M期的細(xì)胞數(shù)T-test分析P＞0.05。見圖11。

圖11 各實(shí)驗(yàn)組處在G1、S以及G2/M期的細(xì)胞占細(xì)胞總數(shù)的比例對(duì)比

3 討論

MTA1基因是MTA家族成員之一，參與細(xì)胞核小體重組和組氨酸去乙?；瘡?fù)合物NuRD的形成，與組蛋白的去乙?；收嚓P(guān)，是轉(zhuǎn)錄過程中的一個(gè)輔助抑制因子。MTA1最初是Pencil等[1]于1990年首次應(yīng)用差異cDNA雜交技術(shù)從13762 NF大鼠乳腺癌轉(zhuǎn)移系統(tǒng)篩選克隆出，繼后在人類高轉(zhuǎn)移乳腺癌細(xì)胞株中發(fā)現(xiàn)其對(duì)應(yīng)的人類同源物MTA1。因該基因的表達(dá)與乳腺腫瘤轉(zhuǎn)移能力成正相關(guān)，故被命名為轉(zhuǎn)移相關(guān)基因1[2]。人的MTA1基因位于染色體14q32.3，編碼1個(gè)含715個(gè)氨基酸殘基的蛋白,分子量為82 kD。MTA1蛋白具有明顯的親水性,不具有跨膜或膜相關(guān)的區(qū)域，表明它并非細(xì)胞表面蛋白或分泌蛋白。因此，MTA1可通過此種功能直接或者間接作用于某些抑制腫瘤浸潤轉(zhuǎn)移的基因，下調(diào)其轉(zhuǎn)錄。有研究表明，MTA1在人類喉癌[3]、口腔鱗癌[4]、食管鱗癌[5]、鼻咽癌[6]及骨肉瘤[7]、子宮內(nèi)膜癌[8]、膀胱癌[9]等多種惡性腫瘤組織中均有不同程度的高表達(dá)，并與腫瘤的浸潤和淋巴轉(zhuǎn)移相關(guān)。Rao等[10]發(fā)現(xiàn)Siha細(xì)胞株所表達(dá)的MTA1蛋白明顯高于HeLa細(xì)胞株，且與這兩株細(xì)胞的遷移及侵襲能力呈正比，用MTA1-siRNA轉(zhuǎn)染Siha細(xì)胞株減少M(fèi)TA1蛋白表達(dá)后，癌細(xì)胞的遷移、侵襲、黏附能力也明顯下降，而細(xì)胞的凋亡、增殖及細(xì)胞周期未受到影響。他們發(fā)現(xiàn)，MTA1-siRNA轉(zhuǎn)染的腫瘤細(xì)胞中的P53蛋白表達(dá)明顯增多，β-catenin蛋白表達(dá)明顯減少。β-catenin在細(xì)胞內(nèi)有E-cadherin/β-catenin復(fù)合物與游離β-catenin兩種存在形式，其黏附功能主要是與E-cadherin的C末端直接作用，將其連接到細(xì)胞骨架的肌動(dòng)蛋白上，形成細(xì)胞間穩(wěn)定連接。

在本研究中選用了RT-PCR技術(shù)和蛋白印跡法測(cè)定了宮頸癌Siha、Hela細(xì)胞中MTA1 mRNA和蛋白的表達(dá)，選擇了相對(duì)高表達(dá)MTA1 mRNA和蛋白的Siha細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)的基因沉默實(shí)驗(yàn)。用慢病毒轉(zhuǎn)染法穩(wěn)定轉(zhuǎn)染Siha細(xì)胞，轉(zhuǎn)染同時(shí)進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)分組：（1）Mock組：正常Siha細(xì)胞、未加病毒感染的細(xì)胞組；（2）NC組：正常Siha細(xì)胞、加陰性對(duì)照病毒CON0 77感染的細(xì)胞組；（3）KD組：正常Siha細(xì)胞、加MTA1基因shRNA病毒感染的細(xì)胞組。經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)：在Transwell體外侵襲實(shí)驗(yàn)中：KD組相比NC組，Transwell轉(zhuǎn)移率經(jīng)T-Test分析P= 2.61E-08＜0.05，結(jié)果表明沉默MTA1基因表達(dá)能使宮頸癌細(xì)胞遷移能力下降。在MTT檢測(cè)及克隆形成實(shí)驗(yàn)中顯示，MTA1基因促進(jìn)宮頸癌細(xì)胞的增殖，沉默MTA1基因表達(dá)能使宮頸癌細(xì)胞增殖能力下降。對(duì)轉(zhuǎn)染后Siha細(xì)胞的PI-FACS細(xì)胞周期檢測(cè)發(fā)現(xiàn)：KD組處于S期、G1期和G2/M期的細(xì)胞數(shù)與NC組相比，P＞0.05，無明顯差異性。在本研究中，對(duì)轉(zhuǎn)染后Siha細(xì)胞的FACS細(xì)胞凋亡進(jìn)行檢測(cè)，Mock組的凋亡率（1.65±0.064 3）%，NC組（4.66±0.058 7）%，KD組（8.63±0.271 9）%，相比兩個(gè)對(duì)照組，KD組凋亡率經(jīng)T-Test分析P＜0.05，從而證明了沉默MTA1基因表達(dá)能加速宮頸癌細(xì)胞的凋亡，這與韓肖燕等[11]在以往這方面的研究發(fā)現(xiàn)有所不同。

總之，本研究結(jié)果表明，MTA1基因可以促進(jìn)宮頸癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移和增殖，沉默MTA1基因表達(dá)能使宮頸癌細(xì)胞增殖及遷移能力下降，加速宮頸癌細(xì)胞的凋亡，為抑制腫瘤轉(zhuǎn)移奠定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)，最后為宮頸癌的新型藥物性靶向治療提供有力的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。相信在不久的將來，我們將一步步揭開MTA1的完整作用機(jī)制，MTA1基因也有望成為腫瘤診斷與治療的重要參考指標(biāo)。

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Effects of MTA1 Gene Silencing on the Metastatic and Proliferation of Cervical Cancer Cell

GU Qing, ZHAO Yan, CHEN Hua

(Department of Obstetrics and Gynecology, Shanghai Baoshan Hospital of Integrated Traditional Chinese and Western Medicine, Shanghai201999)

Objective: To investigate the effects of MTA1 gene silencing on the metastatic and proliferation ability of cervical cancer cell. Methods: The experiment was divided into three groups when the Siha cells were infected by lentivirus. Reverse transcription (RT)-PCR and western blot were used to detect MTA1 mRNA and protein expressions in Siha cell and Hela cell of cervical cancer. Transwell assay detected the migration ability of transfected Siha cells. The proliferation ability of transfected Siha cells were determined by methyl thiazolyl tetrazolium (MTT) and clone formation experiment. FACS cell apoptosis method detected apoptosis rate of transfected Siha cell. Flow cytometry detected transfected Siha cells at different growth periods. Results: (1) Transwell assay: Compared with NC group, the transfer rate in the KD group were analyzed by T Test (P=2.61＜0.05). (2)MTT test: Compared with NC group, the proliferation index of cells was signifcantly decreased in KD group. (3)Clone formation experiment: Compared with NC group, the numbers of cloning were signifcantly less than KD group (P=0.0006＜0.05). (4)FACS: Compared with NC group and Mock group,the apoptosis rate was signifcantly lower than KD group (P＜0.05). Conclusions: MTA1 gene may premote the metastasis and proliferation ability of cervical cancer cell.MTA1 gene silencing may decrease the proliferation and migration of cervical cancer cell, while accelerating the apoptosis of cervical cancer cell. It provides experiental basis for the inhibition of neoplasm metastasis, and powerful new experimental basis for cervical cancer drug targeted therapy fnally.

Cervical cancer; MTA1 gene; Neoplasm metastasis

R737.33

B

10.13638/j.issn.1671-4040.2017.06.001

2017-05-04）