張玉彪， 柳云恩， 佟昌慈， 叢培芳， 劉 穎， 史秀云， 施 琳， 金紅旭， 侯明曉

沈陽(yáng)軍區(qū)總醫(yī)院 急診醫(yī)學(xué)部 全軍重癥(戰(zhàn))創(chuàng)傷救治中心實(shí)驗(yàn)室 遼寧省重癥創(chuàng)傷和器官保護(hù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，遼寧 沈陽(yáng) 110016

·爆震傷·

小鼠肺爆震傷后不同時(shí)間點(diǎn)超氧化物歧化酶-1、丙二醛-5及肌醇酶-α表達(dá)變化研究

張玉彪， 柳云恩， 佟昌慈， 叢培芳， 劉 穎， 史秀云， 施 琳， 金紅旭， 侯明曉

沈陽(yáng)軍區(qū)總醫(yī)院 急診醫(yī)學(xué)部 全軍重癥(戰(zhàn))創(chuàng)傷救治中心實(shí)驗(yàn)室 遼寧省重癥創(chuàng)傷和器官保護(hù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，遼寧 沈陽(yáng) 110016

目的 探討小鼠肺爆震傷后不同時(shí)間點(diǎn)超氧化物歧化酶(SOD)-1、丙二醛(MDA)-5及肌醇酶(IRE)-α表達(dá)的變化。方法 將64只小鼠分為空白對(duì)照組(8只)與爆震傷實(shí)驗(yàn)組(56只)。爆震傷模型建立后，分別于3、6、12、24、48 h與1、2周7個(gè)時(shí)間點(diǎn)解剖8只小鼠。觀察每個(gè)時(shí)間點(diǎn)小鼠的呼吸與被毛狀態(tài)等，應(yīng)用RT-PCR與Western-blot檢測(cè)小鼠肺組織SOD-1、MDA-5及IRE-α在基因與蛋白水平上的表達(dá)量。結(jié)果 爆震傷后，小鼠肺組織SOD-1表達(dá)在3 h后開始降低，1周后上升；MDA-5表達(dá)在3 h后開始上升，12 h時(shí)達(dá)到最高，24 h后下降，1周后再次上升；IRE-α表達(dá)在3 h后開始上升，24 h時(shí)達(dá)到最高，48 h后下降，2周時(shí)恢復(fù)正常。結(jié)論 小鼠肺組織在發(fā)生爆震傷3 h后開始出現(xiàn)氧化應(yīng)激反應(yīng)，12～48 h時(shí)氧化應(yīng)激反應(yīng)達(dá)到高峰，隨后下降，到2周時(shí)基本恢復(fù)正常。

爆震傷； 小鼠； 肺； 氧化應(yīng)激； 超氧化物歧化酶； 丙二醛； 肌醇酶

炸藥、煤氣罐、化學(xué)藥品及水下爆炸等可瞬間產(chǎn)生并釋放巨大的能量，產(chǎn)生一種超聲速的沖擊波，直接對(duì)機(jī)體造成損傷，這種損傷即爆震傷。沖擊波產(chǎn)生后可形成負(fù)壓，對(duì)肺產(chǎn)生一定的損傷，導(dǎo)致肺組織水腫與肺泡破裂，甚至血?dú)庑?，造成死亡[1-3]。本研究通過建立小鼠肺爆震傷模型，觀察肺爆震傷后不同時(shí)間點(diǎn)反映氧化應(yīng)激的指標(biāo)分子與蛋白，探討肺爆震傷后氧化應(yīng)激反應(yīng)的變化，為爆震傷初期的救治提供相關(guān)依據(jù)?，F(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料 C57小鼠64只，6～8周齡，雄性，體質(zhì)量為23～25 g，由北京維通利華公司提供。反轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)于日本TAKARA公司，熒光定量試劑盒購(gòu)于北京天根生化科技有限公司，蛋白提取試劑盒購(gòu)于南京諾唯贊生物科技有限公司，BCA蛋白定量試劑盒購(gòu)于南京諾唯贊生物科技有限公司，ECL顯色試劑盒購(gòu)于美國(guó)BIO-RAD公司，超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)-1抗體、丙二醛(malondialdehyde，MDA)-5抗體及肌醇酶(inositol requiring enzyme，IRE)-α抗體購(gòu)于美國(guó)Abcam公司，二抗抗體購(gòu)于美國(guó)Abcam公司。

1.2 研究方法

將小鼠置于正常飼養(yǎng)房間進(jìn)行飼養(yǎng)，正常飲食水，環(huán)境12 h晝夜交替，適應(yīng)1周。將64只小鼠分為空白對(duì)照組(8只)與爆震傷實(shí)驗(yàn)組(56只)?？瞻讓?duì)照組小鼠正常飼養(yǎng)；爆震傷實(shí)驗(yàn)組小鼠經(jīng)0.55 MPa沖擊波沖擊，建立肺爆震傷模型后，分別于3、6、12、24、48 h及1、2周共7個(gè)時(shí)間點(diǎn)解剖8只小鼠。分別留取4只肺病理標(biāo)本與4只肺凍存標(biāo)本，將病理標(biāo)本置于4%多聚甲醛固定后進(jìn)行熒光染色，凍存標(biāo)本置于-80℃冰箱待測(cè)基因與蛋白表達(dá)。1.2.1 生理學(xué)觀察 觀察兩組小鼠被毛、飲食水、精神狀態(tài)、體質(zhì)量及呼吸的變化。

1.2.2 熒光染色法 將肺組織固定24 h后取材，然后脫水包埋切片與熒光染色。熒光染色按照試劑盒說明書進(jìn)行。熒光顯微鏡下觀察染色情況并拍片。

1.2.3 RT-PCR法 取肺組織標(biāo)本，研缽內(nèi)研磨，按照Trizol提取RNA步驟操作，對(duì)所提取的RNA進(jìn)行定量，然后反轉(zhuǎn)錄為cDNA，SYBR Green實(shí)時(shí)熒光定量PCR，以GAPDH為內(nèi)參，對(duì)GAPDH、SOD-1、MDA-5及IRE-α進(jìn)行擴(kuò)增并分析，計(jì)算小鼠基因相對(duì)表達(dá)量。引物序列見表1。

表1 引物序列

1.2.4 Western-blot法 勻漿機(jī)將肺組織制成勻漿，加入蛋白裂解液，以12 000 r/min速度離心5 min，吸取上清液，酶標(biāo)儀制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。然后蛋白質(zhì)定量，垂直電泳，膠體內(nèi)的藍(lán)色條帶至分離膠底部時(shí)，完成電泳。濕轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)印，加入GAPDH、SOD-1、MDA-5及IRE-α一抗，置于4℃過夜，加入二抗室溫孵育，顯影定影并拍照。以GAPDH為內(nèi)參，進(jìn)行灰度值分析，計(jì)算蛋白相對(duì)表達(dá)量。

2 結(jié)果

2.1 生理學(xué)變化 空白對(duì)照組小鼠的飲食水等情況正常，體質(zhì)量增長(zhǎng)正常。爆震傷實(shí)驗(yàn)組小鼠爆震傷模型建立后呼吸急促，毛發(fā)無光澤，飲食水少于空白對(duì)照組，體質(zhì)量增長(zhǎng)慢于空白對(duì)照組，個(gè)別小鼠不增長(zhǎng)；48 h后，爆震傷實(shí)驗(yàn)組小鼠呼吸等指標(biāo)接近空白對(duì)照組；2周后，爆震傷實(shí)驗(yàn)組小鼠呼吸、毛發(fā)與空白對(duì)照組基本無差異。

2.2 熒光染色結(jié)果 爆震傷后，小鼠肺組織SOD-1表達(dá)在3 h后開始降低，1周后上升；MDA-5表達(dá)在3 h后開始上升，12 h時(shí)達(dá)到最高，24 h后下降，1周后再次上升；IRE-α表達(dá)在3 h后開始上升，24 h時(shí)達(dá)到最高，48 h后下降，2周時(shí)恢復(fù)正常。見圖1。

2.3 RT-PCR結(jié)果 爆震傷后，小鼠肺組織SOD-1表達(dá)在3 h后開始降低，1周后上升；MDA-5表達(dá)在3 h后開始上升，12 h時(shí)達(dá)到最高，24 h后下降，1周后再次上升；IRE-α表達(dá)在3 h后開始上升，24 h時(shí)達(dá)到最高，48 h后下降，2周時(shí)恢復(fù)正常。與空白對(duì)照組小鼠比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)。見圖2。

圖2 SOD-1、MDA-5及IRE-α基因相對(duì)表達(dá)量(與空白對(duì)照組比較，①P<0.05)

2.4 Western-blot結(jié)果 爆震傷后，小鼠肺組織SOD-1表達(dá)在3 h后開始降低，1周后上升；MDA-5表達(dá)在3 h后開始上升，12 h時(shí)達(dá)到最高，24 h后下降，1周后再次上升；IRE-α表達(dá)在3 h后開始上升，24 h時(shí)達(dá)到最高，48 h后下降，2周時(shí)恢復(fù)正常。與空白對(duì)照組小鼠比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)。見圖3。

圖3 SOD-1、MDA-5及IRE-α蛋白相對(duì)表達(dá)量(與空白對(duì)照組比較，①P<0.05)

3 討論

當(dāng)爆炸波沖擊機(jī)體時(shí)，部分震動(dòng)被反射與衍射，部分被傳播。反射壓力高于入射壓力，機(jī)體經(jīng)受的機(jī)械負(fù)荷取決于反射壓力，而不是入射壓力[4-5]。爆炸沖擊波可導(dǎo)致肺損傷，使肺上皮細(xì)胞通透性發(fā)生改變，出現(xiàn)血?dú)庑鼗蚍嗡[等[6-10]。SOD-1能夠清除機(jī)體新陳代謝過程中所產(chǎn)生的一些有害物質(zhì)與自由基，在機(jī)體受到損傷時(shí)，SOD-1會(huì)自動(dòng)調(diào)節(jié)以維護(hù)機(jī)體健康[11-13]。MDA為丙二醛膜脂過氧化的重要產(chǎn)物之一，而MDA-5是細(xì)胞膜內(nèi)識(shí)別受體，自由基的產(chǎn)生與MDA有著很大的關(guān)系[14]。IRE-α作為細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上的感受蛋白，在發(fā)生氧化應(yīng)激反應(yīng)后，其可通過相關(guān)的蛋白促進(jìn)細(xì)胞發(fā)生氧化應(yīng)激而凋亡[12，15]。

本實(shí)驗(yàn)通過建立C57小鼠肺爆震傷模型，觀察爆震傷后3、6、12、24、48 h與1、2周這7個(gè)時(shí)間點(diǎn)對(duì)小鼠生理學(xué)的影響及對(duì)肺氧化應(yīng)激反應(yīng)相關(guān)基因與蛋白的表達(dá)變化。小鼠爆震傷后，48 h內(nèi)體質(zhì)量相對(duì)降低，飲食水少于空白對(duì)照組，呼吸急促；不同時(shí)間點(diǎn)的熒光染色結(jié)果顯示，爆震傷后，小鼠肺組織發(fā)生氧化應(yīng)激反應(yīng)，24～48 h時(shí)氧化應(yīng)激反應(yīng)達(dá)到高峰，隨后下降，到2周時(shí)基本恢復(fù)正常，說明機(jī)體對(duì)外界的損傷具有一定的自我調(diào)節(jié)能力，可發(fā)揮保護(hù)作用；基因與蛋白檢測(cè)的結(jié)果顯示，爆震傷后，小鼠肺組織SOD-1表達(dá)在3 h后開始降低，1周后上升；MDA-5表達(dá)在3 h后開始上升，12 h時(shí)達(dá)到最高，24 h后下降，1周后再次上升；IRE-α表達(dá)在3 h后開始上升，24 h時(shí)達(dá)到最高，48 h后下降，2周時(shí)恢復(fù)正常，與熒光染色結(jié)果一致。

綜上所述，小鼠肺組織在發(fā)生爆震傷3 h后開始出現(xiàn)氧化應(yīng)激反應(yīng)，12～48 h時(shí)氧化應(yīng)激反應(yīng)達(dá)到高峰，隨后下降，到2周時(shí)基本恢復(fù)正常。因此，在爆震傷后，積極進(jìn)行抗氧化應(yīng)激等治療，減少機(jī)體的氧化應(yīng)激反應(yīng)，對(duì)臨床具有一定的指導(dǎo)意義。

[1] Kirkman E,Watts S,Cooper G.Blast injury research models[J].Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci,2011,366(1562):144-159.

[2] Arul R,Adam MH,Spyros M,et al.Blast-related fracture patterns:a forensic biomechanical approach[J].J R Soc Interface,2011,8(58):689-698.

[3] Axel F,Dan B,Benedikt F,et al.The first aid and hospital treatment of gunshot and blast injuries[J].Dtsch Arztebl Int,2017,114(14):237-243.

[4] Archambeau BA,Young S,Lee C,et al.E-cigarette blast injury:complex facial fractures and pneumocephalus[J].West J Emerg Med,2016,17(6):805-807.

[5] Simone F,Raphael S,Rosa D,et al.Pre- and posttreatment with hydrogen sulfide prevents ventilator-induced lung injury by limiting inflammation and oxidation[J].PLoS One,2017,12(4):e0176649.

[6] 柳云恩.爆震沖擊波對(duì)大鼠腦組織炎癥因子IL-1β、IL-6及IL-10表達(dá)影響[J].創(chuàng)傷與急危重病醫(yī)學(xué),2016,6(4):336-340.

[7] Asakura T,Ogura K,Goshima Y.IRE-1/XBP-1 pathway of the unfolded protein response is required for properly localizing neuronal UNC-6/Netrin for axon guidance in C.elegans[J].Genes Cells,2015,20(3):153-159.

[8] Evan C,Fu D,Robert HG,et al.Diffusion tensor imaging reveals white matter injury in a rat model of repetitive blast-induced traumatic brain injury[J].J Neurotrauma,2014,31(10):938-950.

[9] Yashodhar PB,Shwetha KS,Amarnath SM,et al.Regulation of lung injury and fibrosis by p53-mediated changes in urokinase and plasminogen activator inhibitor-1[J].Am J Pathol,2013,183(1):131-143.

[10] Valeriy P,Fanyong M,Angelo M,et al.Alterations of lung microbiota in a mouse model of LPS-induced lung injury[J].Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol,2015,309(1):L76-L83.

[11] Zhao SJ,Ka C,Ma D.Perioperative “remote” acute lung injury:recent update[J].J Biomed Res,2017,31(3):197-212.

[12] Anna AB,Fanyong M,Tian Y,et al.Prostacyclin post-treatment improves LPS-induced acute lung injury and endothelial barrier recovery via Rap1[J].Biochim Biophys Acta,2015,1852(5):778-791.

[13] Edward SM,Nathaniel K,Nadiezhda CM,et al.Nitric oxide inhibits neointimal hyperplasia following vascular injury via differential,cell-specific modulation of SOD-1 in the arterial wall[J].Nitric Oxide,2015,44:8-17.

[14] Effi W,May KW,Natalya PM,et al.Dephosphorylation of the RNA sensors RIG-I and MDA5 by the phosphatase PP1 is essential for innate immune signaling[J].Immunity,2013,38(3):437-449.

[15] Li Y,Yong LC,Ming S,et al.A single-institution experience with open irreversible electroporation for locally advanced pancreatic carcinoma[J].Chin Med J (Engl),2016,129(24):2920-2925.

Changes of SOD-1,MDA-5 and IRE-α expression in the lungs of rats at different time points after blast injury

ZHANG Yu-biao,LIU Yun-en,TONG Chang-ci,CONG Pei-fang,LIU Ying,SHI Xiu-yun,SHI Lin,JIN Hong-xu,HOU Ming-xiao

(Emergency Medicine Department of General Hospital of Shenyang Military Command, Laboratory of Rescue Center of Severe Wound and Trauma PLA, Severe Trauma and Organ Protection key Laboratory of Liaoning Province，Shenyang 110016, China)

Objective To investigate the changes of superoxide dismutase(SOD)-1,malonaldehyde(MDA)-5 and inositol enzyme(IRE)-α expression in rats at different time points after injury.Methods A total of 64 cases of rats were divided into the blank control group(n=8) and exploratory shock group(n=56).The model was established at 3 hours,6 hours,12 hours,24 hours,48 hours,1 week and 2 weeks on 8 rats.The respiratory and hair status of rats at each time point were observed.The expression of SOD-1,MDA-5 and IRE-α in lung tissue were detected by RT-PCR and Western-blot.Results The expression of SOD-1 began to reduce after 3 hours of blast injury,and increased after 1 week.The expression of MDA-5 increased after 3 hours,reached the peak after 12 hours and reduced after 24 hours,then once again increased after 1 week.The expression of IRE-α increased after 3 hours,reached the peak after 24 hours,reduced after 48 hours and returned to normal after 2 weeks.Conclusion Oxidative stress begins to occur after 3 hours of lung injury,and reaches the peak at 12～48 h,then reduces and returns to normal at 2 weeks.

Blast injury; Rats; Lung; Oxidative stress; Superoxide dismutase; Malonaldehyde; Alcoholase

全軍十二五面上項(xiàng)目(CSY12J002)；全軍重大新藥創(chuàng)制項(xiàng)目(2013ZX09J13109-02B)；全軍十二五面上項(xiàng)目(CSY13J002)； 總后衛(wèi)生部重大新上(ASM14L008)

張玉彪(1987-)，男，黑龍江齊齊哈爾人，技師，博士

侯明曉，E-mail：houmingxiao188@163.com

2095-5561(2017)04-0193-05 DOI∶10.16048/j.issn.2095-5561.2017.04.01

2017-08-05