涂福泉， 林興盛， 劉 青

1.福建醫(yī)科大學(xué)附屬協(xié)和醫(yī)院，福建 福州 350001；2.福建省立醫(yī)院金山分院，福建 福州 350001

·論 著·

膿毒血癥大鼠甲狀腺素替代治療研究

涂福泉1， 林興盛2， 劉 青1

1.福建醫(yī)科大學(xué)附屬協(xié)和醫(yī)院，福建 福州 350001；2.福建省立醫(yī)院金山分院，福建 福州 350001

目的 探討膿毒血癥大鼠甲狀腺素替代治療的預(yù)后及細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的改變。方法 清潔級(jí)SD健康雄性大鼠40只，體質(zhì)量180～220 g。采用隨機(jī)數(shù)字表法將大鼠分為膿毒血癥組(S組)及甲狀腺素替代治療組(T組)，每組各20只。大鼠均采用盲腸結(jié)扎穿孔術(shù)建立膿毒血癥模型。T組大鼠分別在模型建立后0、24、48、72 h皮下注射左甲狀腺素鈉(10 μg/100 g)，S組給予同等劑量生理鹽水。兩組大鼠分別在術(shù)前、模型建立后24、48、72 h采血1.5 ml；然后，皮下注射生理鹽1.5 ml/100 g補(bǔ)充失血；血液標(biāo)本離心后，取血清用于檢測(cè)甲功指標(biāo)[游離三碘甲狀腺原氨酸(FT3)、游離甲狀腺素(FT4)、促甲狀腺激素(TSH)]及白細(xì)胞介素-6(IL-6)。觀察兩組大鼠96 h存活率。幸存大鼠處死后取甲狀腺組織標(biāo)本，用于超微結(jié)構(gòu)觀察。結(jié)果 模型建立后24、48、72 h，S組、T組大鼠的FT3水平均低于本組術(shù)前(P<0.05)，且T組各時(shí)間點(diǎn)FT3水平均低于S組(P<0.01)；S組大鼠FT4水平低于術(shù)前，T組FT4水平高于本組術(shù)前及S組(P<0.05)；T組TSH水平低于本組術(shù)前及S組(P<0.05)，S組TSH水平與術(shù)前比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。模型建立后24、48、72 h，兩組IL-6水平均高于各組術(shù)前，且24、48 h時(shí)間點(diǎn)均高于72 h(P<0.05)，但兩組間IL-6水平比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。兩組大鼠24、48、72 h時(shí)間點(diǎn)的FT3、FT4、TSH水平組內(nèi)比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；24、48 h時(shí)間點(diǎn)IL-6水平高于72 h(P<0.05)。T組大鼠96 h存活率高于S組(P<0.05)。電鏡下，S組及T組大鼠甲狀腺濾泡上皮細(xì)胞均出現(xiàn)不同程度胞核固縮、胞質(zhì)溶解、胞膜破裂，但T組甲狀腺濾泡結(jié)構(gòu)破壞相對(duì)輕微。結(jié)論 甲狀腺素替代治療可以增加盲腸結(jié)扎穿孔術(shù)制膿毒血癥大鼠96 h內(nèi)存活率，電子顯微鏡下可見甲狀腺濾泡結(jié)構(gòu)破壞相對(duì)減輕。

膿毒血癥； 甲狀腺激素替代治療； 超微結(jié)構(gòu)

目前，膿毒血癥的發(fā)病率逐年增加[1-3]。膿毒血癥可發(fā)展為多器官功能障礙綜合征，包括肺、肝、腎，循環(huán)、凝血系統(tǒng)，甚至胰腺等[4]。而體內(nèi)重要的內(nèi)分泌器官甲狀腺，在膿毒血癥中也受到不同程度的影響[5]，表現(xiàn)為甲狀腺激素水平異常及器質(zhì)性損害[6]；而是否需要進(jìn)行甲狀腺素替代治療，仍存在爭(zhēng)議。本研究旨在探討膿毒血癥大鼠甲狀腺素替代治療的預(yù)后及甲狀腺超微結(jié)構(gòu)的改變?，F(xiàn)報(bào)道如下。

1 對(duì)象與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 清潔級(jí)SD健康雄性大鼠40只(由福建醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供)，體質(zhì)量180～220 g。采用隨機(jī)數(shù)字法將大鼠隨機(jī)分為膿毒血癥組(S組)及左甲狀腺素鈉替代治療組(T組)，每組各20只。

1.2 儀器與試劑 采用放射免疫法檢測(cè)甲功指標(biāo)[游離三碘甲狀腺原氨酸(FT3)、游離甲狀腺素(FT4)、促甲狀腺激素(TSH)]，分析藥盒購自北京北方生物技術(shù)研究所(批號(hào)：20140723)。采用酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(enzyme-linked immuno sorbent assay，ELISA)法檢測(cè)白細(xì)胞介素(IL-6)水平，試劑盒購自上海博谷生物科技有限公司(批號(hào)：REP055)。左甲狀腺素鈉購自Sigma公司(批號(hào)：32995)。超微結(jié)構(gòu)觀察采用PHILIPS(EM208型)透射電鏡。操作嚴(yán)格按照各指標(biāo)說明書進(jìn)行。

1.3 動(dòng)物模型及標(biāo)本制備 本研究大鼠均采用盲腸結(jié)扎穿孔術(shù)[7]建立膿毒血癥模型。大鼠術(shù)前禁食24 h，不禁水，腹腔注射水合氯醛(30 mg/100 g)，麻醉下保留自主呼吸，剔除腹部毛發(fā)后，聚維酮碘棉球消毒，延腹部正中切開1.5 cm腹壁，顯露盲腸，距末端1.0 cm處結(jié)扎盲腸，然后用0.7 mm內(nèi)徑穿刺針單次貫穿被結(jié)扎盲腸中點(diǎn)處，由穿刺孔擠出少許糞便進(jìn)入腹腔，后將盲腸送回原位，雙層縫合腹壁，皮下注射生理鹽水3 ml/100 g，補(bǔ)充手術(shù)失水，并進(jìn)行抗休克治療。膿毒癥模型成功標(biāo)準(zhǔn)：開腹后見被結(jié)扎盲腸發(fā)黑、腫脹，明顯惡臭，腹腔內(nèi)大量血性腹水。T組大鼠分別在模型建立后0、24、48、72 h皮下給予左甲狀腺素鈉(10 μg/100 g)，S組給予同等劑量生理鹽水。兩組大鼠分別在術(shù)前、模型建立后24、48、72 h時(shí)間點(diǎn)剪尾及眼眶采血1.5 ml，采血后給予皮下注射生理鹽水1.5 ml/100 g，補(bǔ)充失血，血液標(biāo)本立即高速離心后取血清備用，觀察兩組大鼠96 h存活率。幸存大鼠于96 h成功腹腔麻醉后，分離氣管周圍組織，上至聲門，下至第4～5氣管軟骨環(huán)離斷氣管，置于0℃鹽水中，鑷子小心分離甲狀腺左右側(cè)葉，固定于3.0%戊二醛+1.5%多聚甲醛，用于電子顯微鏡觀察超微結(jié)構(gòu)改變。以上操作在2 min內(nèi)完成。實(shí)驗(yàn)過程中動(dòng)物處置方法符合動(dòng)物倫理學(xué)標(biāo)準(zhǔn)。

2 結(jié)果

2.1 兩組各時(shí)間點(diǎn)甲狀腺激素水平比較 模型建立后24、48、72 h，兩組FT3水平均低于本組術(shù)前(P<0.05)，且T組各時(shí)間點(diǎn)水平均低于S組(P<0.05)；S組各時(shí)間點(diǎn)FT4水平均低于術(shù)前，T組高于術(shù)前，且T組各時(shí)間點(diǎn)水平均高于S組(P<0.05)；S組TSH水平與本組術(shù)前比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；T組各時(shí)間點(diǎn)與本組術(shù)前比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；且S組各時(shí)間點(diǎn)水平均高于T組(P<0.05)。兩組大鼠24、48、72 h時(shí)間點(diǎn)的FT3、FT4、TSH水平組內(nèi)比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表1。

2.2 兩組各時(shí)間點(diǎn)IL-6值比較 模型建立后24、48、72 h，兩組IL-6水平均較治療前升高，兩組間各時(shí)間點(diǎn)比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，但各組內(nèi)72 h時(shí)間點(diǎn)的IL-6水平均低于24、48 h時(shí)間點(diǎn)(P<0.05)。見表2。

表1 各組大鼠甲狀腺激素水平比較

注：與本組術(shù)前比較，①P<0.05

表2 兩組各時(shí)間點(diǎn)IL-6值比較[中位數(shù)(p25，p75)]

2.3 大鼠存活情況分析 觀察截點(diǎn)為96 h，發(fā)現(xiàn)S組存活大鼠2只，存活率為10.0%；T組6只，存活率為30.0%；T組存活率顯著高于S組，組間比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見圖1。

2.4 甲狀腺組織電鏡超微結(jié)構(gòu)改變情況 電子顯微鏡下，S組大鼠多數(shù)甲狀腺濾泡上皮細(xì)胞發(fā)生核固縮，染色不均勻加深，細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整性破壞，無細(xì)胞器結(jié)構(gòu)，破碎的細(xì)胞質(zhì)脫落于甲狀腺濾泡中，殘存的部分細(xì)胞質(zhì)內(nèi)可見大量空泡。而T組大鼠部分濾泡上皮細(xì)胞發(fā)生核固縮，染色不均勻加深，胞質(zhì)內(nèi)呈空泡化，無細(xì)胞器結(jié)構(gòu)，細(xì)胞間隔模糊，但細(xì)胞膜尚完整；而相鄰一甲狀腺濾泡的上皮細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整，細(xì)胞器結(jié)構(gòu)清晰，可見微絨毛向?yàn)V泡腔分泌。見圖2。

圖1 S組及T組大鼠造模后96 h內(nèi)存活曲線

圖2 大鼠甲狀腺組織超微結(jié)構(gòu)[a.S組(3 150倍)；b.T組(6 300倍)])

3 討論

膿毒血癥可導(dǎo)致甲狀腺病態(tài)綜合征，表現(xiàn)為血清中甲狀腺相關(guān)激素水平的變化[8]。膿毒血癥后檢測(cè)的最突出的血清中甲狀腺激素水平變化為低FT3、FT4，而沒有代償性的高水平的TSH的情況，TSH往往保持正?；蛏詼p低[9]。本研究中檢測(cè)的膿毒血癥S組大鼠FT3、FT4水平均較術(shù)前低，而TSH與術(shù)前比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；且分別于模型建立后24 h、48 h及72 h時(shí)間點(diǎn)測(cè)得的甲狀腺激素水平比較，差異也無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。結(jié)果同于筆者研究生論文中甲狀腺激素水平的變化[6]，Meyer等[10]的研究中也有類似描述，但其中機(jī)制尚不明確。

針對(duì)膿毒血癥甲狀腺素替代治療藥物的劑型及劑量報(bào)道較少，因此，本研究參考甲狀腺減退癥的替代治療[11]，探索性采用左甲狀腺素鈉(10 μg/100 g)為替代治療藥物，發(fā)現(xiàn)替代治療后FT4水平明顯高于未治療及術(shù)前，同時(shí)發(fā)現(xiàn)治療后TSH及FT3均呈現(xiàn)不同程度相對(duì)降低，考慮可能與下丘腦-垂體-甲狀腺軸的負(fù)反饋調(diào)節(jié)有關(guān)，Yaglova[12]提出病理狀態(tài)下甲狀腺激素調(diào)節(jié)軸的作用仍然顯著。

IL-6是白細(xì)胞介素家族中的一員，同時(shí)具有抗炎及促炎功能的細(xì)胞因子，已有研究發(fā)現(xiàn)其具有良好的預(yù)后價(jià)值[13-14]，Soong等[15]研究中提到IL-6是早期診斷膿毒血癥的重要生物標(biāo)記。故IL-6是評(píng)價(jià)膿毒血癥嚴(yán)重程度的良好指標(biāo)。本研究中，S組、T組均較術(shù)前明顯升高，不同時(shí)間點(diǎn)數(shù)據(jù)對(duì)比發(fā)現(xiàn)，72 h的IL-6水平低于24 h及48 h，考慮可能與少數(shù)幸存盲腸結(jié)扎穿孔術(shù)后膿毒血癥大鼠自身機(jī)體保護(hù)性免疫反應(yīng)有關(guān)，使穿孔部位炎癥局限形成包裹，進(jìn)而病情改善[16]。

有研究表明，特別是膿毒血癥中存在的大量細(xì)胞因子，如腫瘤壞死因子，會(huì)影響組織對(duì)甲狀腺激素的敏感性，所以有學(xué)者提出能否采用甲狀腺激素替代治療[17]。以往有研究認(rèn)為，甲狀腺激素水平低下可能是一種適應(yīng)性反應(yīng)，從而可減少機(jī)體蛋白質(zhì)分解及降低能量需求，幫助機(jī)體度過難關(guān)[18]。有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，補(bǔ)充三碘甲狀腺原氨酸(T3)可減弱膿毒血癥降低體內(nèi)抗凝血酶Ⅲ水平的作用，可減少出血及發(fā)生彌散性血管內(nèi)凝血的風(fēng)險(xiǎn)[19]；補(bǔ)充四碘甲腺原氨酸(T4)可以改善大鼠肺順應(yīng)性有所增加，從而改善呼吸衰竭情況[20]。也有臨床研究表明，補(bǔ)充T4并不能夠改變ICU患者總體病死率[21]。而本研究中發(fā)現(xiàn)，膿毒血癥大鼠96 h病死率較高，尤其是在觀察中期(模型建立后36～72 h)，考慮與膿毒血癥發(fā)展的初期的持續(xù)劇烈炎癥反應(yīng)有關(guān)，對(duì)機(jī)體循環(huán)、呼吸功能產(chǎn)生嚴(yán)重影響[1，22]。而在危重癥患者中，T4可通過上調(diào)β-腎上腺素受體和增加心肌收縮力來發(fā)揮重要功效[23]。有研究證實(shí)，T4可減少血流動(dòng)力學(xué)不穩(wěn)定的患者對(duì)血管活性藥物的需要量[24]。本研究發(fā)現(xiàn)，T組大鼠在膿毒血癥模型建立后即予以左甲狀腺素治療可以降低96 h的病死率，其原因可能是甲狀腺素可助于穩(wěn)定膿毒血癥引起的機(jī)體血流動(dòng)力學(xué)不穩(wěn)定，從而協(xié)助改善各器官臟器灌注，減少臟器損害，對(duì)甲狀腺組織細(xì)胞的超微觀察也證實(shí)左甲狀腺素治療后組織細(xì)胞結(jié)構(gòu)破壞相對(duì)減輕，組織結(jié)構(gòu)相對(duì)完整。

綜上所述，膿毒血癥大鼠在給予甲狀腺激素替代治療后可以改善其病死率，觀察甲狀腺組織細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)相對(duì)破壞減輕，但臨床上使用甲狀腺素替代治療膿毒血癥后甲狀腺功能異常的療效仍需進(jìn)一步研究。

[1] Singer M,Deutschman CS,Seymour CW,et al.The third international consensus definitions for sepsis and septic shock(Sepsis-3)[J].JAMA,2016,315(8):801-810.

[2] 中華醫(yī)學(xué)會(huì)重癥醫(yī)學(xué)分會(huì).中國嚴(yán)重膿毒癥/膿毒性休克治療指南(2014)[J].全科醫(yī)學(xué)臨床與教育,2015,54(4):401-426.

[3] Danai P,Martin GS.Epidemiology of sepsis:recent advances[J].Curr Infect Dis Rep,2005,7(5):329-334.

[4] 石松菁,林興盛,楊火保.多器官功能障礙綜合征患者胰腺損害的探討[J].中華急診醫(yī)學(xué)雜志,2013,22(8):846-849.

[5] Khardori R,Castillo D.Endocrine and metabolic changes during sepsis:an update[J].Med Clin North Am,2012,96(6):1095-1105.

[6] 涂福泉.膿毒血癥大鼠甲狀腺功能改變和Caspase-3蛋白表達(dá)及細(xì)胞凋亡的關(guān)系[D].福建醫(yī)科大學(xué),2014.

[7] Hubbard WJ,Choudhry M,Schwacha MG,et al.Cecal ligation and puncture[J].Shock,2005,24 Suppl 1:52-57.

[8] Warner MH,Beckett GJ.Mechanisms behind the non-thyroidal illness syndrome:an update[J].J Endocrinol,2010,205(1):1-13.

[9] Yaglova NV.Morphofunctional analysis of development of nonthyroid disease syndrome in experimental endotoxicosis[J].Bull Exp Biol Med,2009,148(5):829-833.

[10] Meyer S,Schuetz P,Wieland M,et al.Low triiodothyronine syndrome:a prognostic marker for outcome in sepsis[J].Endocrine,2011,39(2):167-174.

[11] 王 茜,楊會(huì)云,王建月,等.成年期甲狀腺功能減退癥大鼠額葉突觸結(jié)合蛋白I表達(dá)及T4替代治療作用[J].中華地方病學(xué)雜志,2010,29(3):239-242.

[12] Yaglova NV.Disorders in the secretory cycle of follicular thyrocytes and their correction with thyrotropic hormone in experimental non-thyroidal illness syndrome[J].Bull Exp Biol Med,2011,152(2):253-257.

[13] Haasper C,Kalmbach M,Dikos GD,et al.Prognostic value of procalcitonin(PCT)and/or interleukin-6(IL-6)plasma levels after multiple trauma for the development of multi organ dysfunction syndrome(MODS)or sepsis[J].Technol Health Care,2010,18(2):89-100.

[14] Jekarl DW,Lee SY,Lee J,et al.Procalcitonin as a diagnostic marker and IL-6 as a prognostic marker for sepsis[J].Diagn Microbiol Infect Dis,2013,75(4):342-347.

[15] Soong J,Soni N.Sepsis:recognition and treatment[J].Clin Med(Lond),2012,12(3):276-280.

[16] Otero-Anton E,Gonzalez-Quintela A,Lopez-Soto A,et al.Cecal ligation and puncture as a model of sepsis in the rat:influence of the puncture size on mortality,bacteremia,endotoxemia and tumor necrosis factor alpha levels[J].Eur Surg Res,2001,33(2):77-79.

[17] Nagaya T,Fujieda M,Otsuka G,et al.A potential role of activated NF-kappa B in the pathogenesis of euthyroid sick syndrome[J].J Clin Invest,2000,106(3):393-402.

[18] Joosten KF,de Kleijn ED,Westerterp M,et al.Endocrine and metabolic responses in children with meningoccocal sepsis:striking differences between survivors and nonsurvivors[J].J Clin Endocrinol Metab,2000,85(10):3746-3753.

[19] Chapital AD,Hendrick SR,Lloyd L,et al.The effects of triiodothyronine augmentation on antithrombin III levels in sepsis[J].Am Surg,2001,67(3):253-256.

[20] Inan M,Koyuncu A,Aydin C,et al.Thyroid hormone supplementation in sepsis:an experimental study[J].Surg Today,2003,33(1):24-29.

[21] Brent GA,Hershman JM.Thyroxine therapy in patients with severe nonthyroidal illnesses and low serum thyroxine concentration[J].J Clin Endocrinol Metab,1986,63(1):1-8.

[22] Levy MM,Fink MP,Marshall JC,et al.2001 SCCM/ESICM/ACCP/ATS/SIS International Sepsis Definitions Conference[J].Crit Care Med,2003,31(4):1250-1256.

[23] Lodha R,Vivekanandhan S,Sarthi M,et al.Thyroid function in children with sepsis and septic shock[J].Acta Paediatr,2007,96(3):406-409.

[24] Zuppa AF,Nadkarni V,Davis L,et al.The effect of a thyroid hormone infusion on vasopressor support in critically ill children with cessation of neurologic function[J].Crit Care Med,2004,32(11):2318-2322.

A study of thyroxine replacement therapy in rats with sepsis

TU Fu-quan,LIN Xing-sheng,LIU Qing

(Fujian Medical University Union Hospital,Fuzhou 350001,China)

Objective To investigate the prognosis of septic rats for thyroxine replacement therapy and the change of ultrastructure in thyroid tissue.Methods A total of 40 pathogen-free male rats weighing 180 to 220 g were selected.Rats were randomly divided into the sepsis group(Group S)and thyroxine replacement therapy group(Group T),with 20 rats in each group.All rats were induced to septic modal by cecal ligation and puncture(CLP).The rats in Group T were administrated L-thyroxine(10 μg/100 g)by hypodermic injection per time in 0 hour,24 hours,48 hours and 72 hours after the CLP.The rats in Group S were given the same dose normal saline.All rats were taken each 1.5 ml blood before CLP,24 hours,48 hours and 72 hours after CLP.After each blood collection,rats were taken normal saline(10 μg/100 g)for blood loss replenished.After centrifugation,blood samples were used for detection of thyroid hormones(FT3,FT4and TSH)and interleukin-6(IL-6).The rats′ survival rate within 96 hours after CLP was recorded.The survival rats were executed and taken the thyroid tissue for observation of ultrastructure.Results After model establishment in 24 hours,48 hours and 72 hours,the FT3levels in Group S and Group T were lower(P<0.05),and the FT3level in Group T was lower than those at each time point in Group S(P<0.01).The FT4level in Group S was lower than that before surgery,and the FT4level in Group T was higher than that before surgery and in Group S(P<0.05).The TSH level in Group T was lower than that before surgery and in Group S(P<0.05).After model establishment in 24 hours,48 hours and 72 hours,the IL-6 levels in both groups were higher than those before surgery,and the level at 24 hours and 48 hours were higher than that in 72 hours;the IL-6 levels between the both groups had no statistical significance(P>0.05).The levels of FT3,FT4and TSH at 24 hours,48 hours and 72 hours had no statistical significance(P>0.05).IL-6 levels at 24 hours and 48 hours were higher than that at 72 hours(P<0.05).The survival rate in Group T was higher than that in Group S(P<0.05).Under electron microscope,a series of pathological changes were found in thyroid follicular epithelial cells,such as the nucleus became smaller and showed pyknosis,cytoplasm was replaced by a lot of vacuole,the cell membrane broke,and the thyroid follicle in Group T was more complete than that in Group S.Conclusion Thyroxine replacement therapy can raise the survival rate of septic rat within 96 hours after CLP,and under electron microscopy,the structural damage of the thyroid follicle is reduced.

Sepsis; Thyroxine replacement therapy; Ultrastructure

涂福泉(1989-)，男，江西南昌人，醫(yī)師，碩士

2095-5561(2017)04-0228-05 DOI∶10.16048/j.issn.2095-5561.2017.04.08

2017-05-29