（西南大學(xué)食品科學(xué)學(xué)院，重慶400715）

牦牛酸乳特色發(fā)酵劑的研發(fā)

張靖晞，廉桂芳，索化夷

（西南大學(xué)食品科學(xué)學(xué)院，重慶400715）

通過對傳統(tǒng)發(fā)酵牦牛酸乳中分離、鑒定的17株馬克斯克魯維酵母菌進(jìn)行性能篩選，選出乳糖利用率高、產(chǎn)胞外多糖能力強(qiáng)、耐酸性的一株馬克斯克魯維酵母菌。它與實(shí)驗(yàn)室保存的發(fā)酵性能良好的干酪乳桿菌和嗜熱鏈球菌組合發(fā)酵，并通過單因素試驗(yàn)、正交試驗(yàn)以確定最佳發(fā)酵條件。結(jié)果表明最佳發(fā)酵條件：菌液（濃度為1×109mL-1）體積比干酪乳桿菌∶嗜熱鏈球菌∶馬克斯克魯維酵母菌為1∶1∶4，接種量為4%，發(fā)酵溫度為35℃，加糖量為4 g/100 mL，此時(shí)感觀評分達(dá)到89.20分，滴定酸度達(dá)到94.420T，綜合評定值為0.775。

馬克斯克魯維酵母；乳糖利用率；產(chǎn)胞外多糖能力；耐酸性；組合發(fā)酵

0 引言

牦牛在我國主要分布于青藏高原地區(qū)，素有萬能畜種之稱[1]。牦牛酸乳屬于Ⅳ型發(fā)酵乳，其由乳酸菌和酵母菌共同發(fā)酵而成。酵母菌可提高乳制品的風(fēng)味[2],其與乳酸菌的共生作用使發(fā)酵乳具有穩(wěn)定的特性[3-4]。同時(shí)酵母菌的參與還可抑制有害菌的生長[5-6]。

馬克斯克魯維酵母作為傳統(tǒng)發(fā)酵牦牛酸乳的重要酵母菌，對牦牛酸乳的風(fēng)味品質(zhì)有重要影響。

本實(shí)驗(yàn)通過對實(shí)驗(yàn)室保存的馬克斯克魯維酵母菌進(jìn)行性能篩選，篩選出乳糖利用率高、產(chǎn)胞外多糖能力強(qiáng)、耐酸性的一株目標(biāo)菌株，并與實(shí)驗(yàn)室保存的干酪乳桿菌和嗜熱鏈球菌組合發(fā)酵，通過正交試驗(yàn)確定最佳發(fā)酵條件，從而發(fā)酵出具有特色風(fēng)味的牦牛酸乳，為進(jìn)一步認(rèn)識利用并開發(fā)出有自主產(chǎn)權(quán)的傳統(tǒng)酸乳發(fā)酵劑提供一定參考。

1 實(shí)驗(yàn)

1.1 菌種

采自于西藏羊八井地區(qū)傳統(tǒng)發(fā)酵的牦牛酸乳中，經(jīng)分離、純化、鑒定并保存于甘油中的17株馬克斯克魯維酵母菌菌株（1-1，4-1，6-1，8-1，10-1，13-1，16-1，18-1，19-1，20-1，23-1，25-1，30-1，31-1，32-1，33-1，34-1）；西南大學(xué)食品科學(xué)學(xué)院保藏干酪乳桿菌28-2(發(fā)酵性能為：產(chǎn)胞外多糖量質(zhì)量濃度為76.93mg/L,產(chǎn)雙乙酰的質(zhì)量濃度為5.09 mg/L，產(chǎn)乙醛的質(zhì)量濃度為23.76 mg/L，嗜熱鏈球菌H3-3 906,西南大學(xué)食品科學(xué)學(xué)院保藏。

1.2 試劑

PDA馬鈴薯葡萄糖瓊脂，YPD培養(yǎng)基，MRS固體培養(yǎng)基，MRS肉湯，均為BR生物試劑；乳糖，氫氧化鈉，苦味酸，苯酚，亞硫酸氫鈉，硫酸鋅，氫氧化鋇，三氯乙酸，濃硫酸，葡萄糖，均為分析純；牦牛奶粉,乳制品。

1.3 儀器設(shè)備

電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱（DGG-9140A），可見分光光度計(jì)（722），PH計(jì)（PHS-3C型），磁力攪拌器（78-1），無菌操作臺（SW-CJ-2F），離心機(jī)（5810）。

1.4 方法

1.4.1 酵母菌的活化

先取150 L保存于甘油中的菌液于5 mL YPD液體培養(yǎng)基中，捆扎好于搖床上28℃，轉(zhuǎn)速為220 r/min培養(yǎng)24 h。再按3%接種量（150 μL）接種于5mL液體培養(yǎng)基中，捆扎好于搖床上28℃，轉(zhuǎn)速為220 r/min培養(yǎng)24 h。最后將活化的菌液無菌條件下劃線接種于PDA固體培養(yǎng)基（經(jīng)121℃，20 min殺菌）中，用無菌封口膠帶紙封好，倒置于恒溫培養(yǎng)箱中，28℃培養(yǎng)48 h。

1.4.2 乳糖利用率的測定

配制乳糖標(biāo)準(zhǔn)液并繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。使用接種環(huán)無菌條件下挑起一環(huán)于平板中生長完好的單菌落轉(zhuǎn)移至5 mL YPD液體培養(yǎng)基中，28℃培養(yǎng)24 h。取3%的接種量（150 L）于5 mL質(zhì)量濃度為120 g/L的脫脂乳中（115℃滅菌15 min），28℃培養(yǎng)24 h，取出測定其乳糖含量B。留一組未接種菌液的5 mL脫脂乳做同樣處理，作為脫脂乳乳糖含量的測定,測定結(jié)果為A。乳糖利用率為：

1.4.3 產(chǎn)胞外多糖能力

參照劉烺新[8]提取胞外多糖的方法，得到沉淀后的胞外多糖。將胞外多糖溶于10 mL蒸餾水中，得到EPS的水溶液。再根據(jù)硫酸-苯酚法測定酵母菌胞外多糖（EPS）的含量。

1.4.4 耐酸能力

用接種環(huán)取已在平板上活化的菌種一環(huán)，接種于5 mL YPD液體培養(yǎng)基中，28℃下培養(yǎng)24 h，再按3%（150 μL）的接種量分別接種于已滅菌的pH值分別為2.0，3.0，4.0的5 mL YPD液體培養(yǎng)基中，28℃恒溫培養(yǎng)24 h。同時(shí)以pH值為5.5的YPD液體培養(yǎng)基作空白對照，每個(gè)監(jiān)測點(diǎn)作3次重復(fù)。采用平板菌落計(jì)數(shù)法來測定菌株存活率，以此來判斷菌株的耐酸能力。存活率為

式中：C處理為經(jīng)處理后的培養(yǎng)基上所得活菌數(shù)（mL-1）；C對照為對照組的培養(yǎng)基上所得活菌數(shù)（mL-1）。

1.4.5 發(fā)酵乳發(fā)酵流程[9]

牦牛奶粉120 g/L（質(zhì)量濃度）→殺菌（110℃，10 min）→冷卻→接種→適溫發(fā)酵→冷卻→冷藏后熟（4℃,24 h）→成品。

1.4.6 牦牛酸乳發(fā)酵工藝條件優(yōu)化

（1）牦牛酸乳發(fā)酵菌株配比的單因素實(shí)驗(yàn)。按1.4.5的發(fā)酵流程和預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，添加4 g/100 mL的白砂糖，將菌種分別以3∶3∶2，1∶1∶1，1∶1∶2，1∶1∶4，1∶1∶6，1∶1∶8（干酪乳桿菌∶嗜熱鏈球菌∶馬克斯克魯維酵母菌）的體積比，以3%的接種量接種發(fā)酵，37℃發(fā)酵至凝固，在冷藏后熟后取樣測定滴定酸度，感官評價(jià)其風(fēng)味效果，選擇適宜的菌株配比水平。

（2）牦牛酸乳發(fā)酵接種量的單因素實(shí)驗(yàn)。按照1.4.5的發(fā)酵流程和預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，用組合菌株1∶1∶2的菌種體積比，添加4 g/100 mL的白砂糖，分別以1%，2%，3%，4%，5%，6%的菌種量接種；37℃發(fā)酵至凝固，記錄時(shí)間，冷藏后熟后取樣測定滴定酸度，感官評價(jià)其風(fēng)味效果，選擇適宜的接種量水平。

（3）牦牛酸乳發(fā)酵溫度單因素實(shí)驗(yàn)。按照1.4.5的發(fā)酵流程和預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，添加4 g/100 mL的白砂糖，用組合菌株1∶1∶2的菌種體積比，以3%的接種量接種發(fā)酵，分別在29，31，33，35，37，39℃的溫度條件下發(fā)酵至凝固，記錄時(shí)間，冷藏后熟并取樣測定滴定酸度，感官評價(jià)其風(fēng)味效果，選擇適宜的發(fā)酵溫度水平。

（4）牦牛酸乳發(fā)酵加糖量的單因素實(shí)驗(yàn)。按照1.4.5的發(fā)酵流程和預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，用組合菌株1∶1∶2的菌種體積比，分別添加質(zhì)量濃度為（2，3，4，5，6，7）g/ 100 mL的白砂糖，以3%的接種量接種，37℃發(fā)酵至凝固，記錄時(shí)間，在冷藏后熟后取樣測定滴定酸度，感官評價(jià)其風(fēng)味效果，選擇適宜的加糖量水平。

1.4.7 牦牛酸乳發(fā)酵工藝的正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)

選取菌液體積比（A）、接種量（B）、發(fā)酵溫度（C）、加糖量（D）單因素試驗(yàn)較優(yōu)的發(fā)酵條件設(shè)計(jì)正交試驗(yàn)因素水平表，在此基礎(chǔ)上，以滴定酸度和感官評分作為評定指標(biāo)，采取L9（34）正交實(shí)驗(yàn)來確定最優(yōu)的發(fā)酵工藝條件。采用多指標(biāo)正交試驗(yàn)的變異系數(shù)分析方法[10-11]對滴定酸度和感官評分兩個(gè)指標(biāo)進(jìn)行計(jì)算得出綜合評定值。從而確定最佳發(fā)酵工藝參數(shù)。

1.4.8 酸乳樣品指標(biāo)的測定

（1）滴定酸度的測定。以GB/T 5413.34—2010《乳和乳制品酸度的測定》[12]中對酸度的測定方法為標(biāo)準(zhǔn),利用濃度為0.1 mol/L的NaOH溶液對發(fā)酵乳后熟24 h的酸度進(jìn)行滴定。

（2）感官評價(jià)方法。將凝固后的發(fā)酵乳置于4℃冷藏24 h后，由經(jīng)過專業(yè)感官評價(jià)訓(xùn)練的評審員10人對牦牛酸乳的色澤、氣味和滋味、組織狀態(tài)進(jìn)行感官評價(jià)，評定標(biāo)準(zhǔn)如表1和表2所示。

表1 發(fā)酵乳感官評價(jià)評分[16-17]

2 結(jié)果與分析

2.1 乳糖含量測定結(jié)果

以吸光度值為縱坐標(biāo)，乳糖濃度為橫坐標(biāo)，得到線性回歸方程：為Y=0.4236X+0.0044，R2=0.9977(Y為吸光度Abs,X為乳糖質(zhì)量濃度mg/mL)。

經(jīng)測定表明，不同菌株乳糖利用能力有所不同。由表3可以看出，實(shí)驗(yàn)菌乳糖利用能力介于10.24%～71.69%之間。乳糖利用率越高，表明實(shí)驗(yàn)菌株乳糖利用能力越強(qiáng)，在發(fā)酵乳產(chǎn)品中對風(fēng)味和組織的影響程度越高。因此根據(jù)表3，初步篩選出9株乳糖利用率在50%以上的試驗(yàn)菌株，分別為1-1，6-1，8-1，16-1，23-1，25-1，30-1，33-1，34-1。

表2 發(fā)酵乳氣味和滋味感官評價(jià)評分[13-14]

表3 17株菌乳糖利用率%

2.2 產(chǎn)胞外多糖含量測定結(jié)果

以吸光度值為縱坐標(biāo)，葡萄糖濃度為橫坐標(biāo)，得到線性回歸方程為Y=0.0067X+0.0065，R2=0.998(Y為吸光度Abs,X為葡萄糖濃度μg/mL)

表4 9株菌產(chǎn)胞外多糖質(zhì)量濃度μg/mL

胞外多糖可以提高乳制品的組織狀態(tài)。由表4知，不同菌株產(chǎn)胞外多糖產(chǎn)量不同，9株試驗(yàn)菌中，產(chǎn)量較高的菌有：1-1，6-1，30-1和33-1；產(chǎn)量分別為60.52，72.91，72.62，71.27 μg/mL。Lin等[15]認(rèn)為發(fā)酵時(shí)間是影響胞外多糖產(chǎn)量、分子量和組成的重要環(huán)境因素，向低脂脫脂牛奶中添加干酪素水解物能顯著促進(jìn)細(xì)胞的生長和提高胞外多糖的產(chǎn)量。Welman[16-17]等認(rèn)為培養(yǎng)基的成分（碳源和氮源）、生長條件（溫度、pH值、培養(yǎng)時(shí)間）等都可能影響乳酸菌胞外多糖的產(chǎn)量。不同營養(yǎng)和環(huán)境條件下產(chǎn)生的多糖的化學(xué)結(jié)構(gòu)和生理功能也有差異。

由此可見，菌株產(chǎn)胞外多糖能力除了與培養(yǎng)條件及營養(yǎng)物質(zhì)的組成有關(guān)外，菌株的不同也是影響菌株產(chǎn)胞外多糖能力的關(guān)鍵因素。根據(jù)表4，選出4株產(chǎn)胞外多糖產(chǎn)量相對高的菌株1-1，6-1，30-1，33-1進(jìn)行耐酸性實(shí)驗(yàn)。

2.3 耐酸性實(shí)驗(yàn)結(jié)果

表5 實(shí)驗(yàn)菌株在不同酸性條件下的存活率%

菌株的耐酸性越強(qiáng)，越有利于酸乳的發(fā)酵，從而使酸乳產(chǎn)生獨(dú)特的風(fēng)味和香氣。由表5可以看出，在pH4.0的酸性條件下，4株菌的存活率都超過了50%；在pH3.0的酸性條件下，各菌株的存活率都大幅下降；在pH2.0的酸性條件下，1-1，6-1，33-1已經(jīng)不能生長；只有30-1有一定存活率，說明30-1耐酸性能力強(qiáng)于1-1，6-1和33-1。

根據(jù)乳糖利用率、產(chǎn)胞外多糖含量以及耐酸性能力三個(gè)指標(biāo)從而得出性能良好的馬克斯克魯維酵母菌30-1，并與干酪乳桿菌和嗜熱鏈球菌組合發(fā)酵并進(jìn)行發(fā)酵工藝條件的優(yōu)化。

2.4 牦牛酸乳發(fā)酵工藝條件的單因素實(shí)驗(yàn)

2.4.1 菌種體積比例的影響

圖1 不同菌種體積比的發(fā)酵乳發(fā)酵后熟24 h酸度和感官評分

菌種體積比的改變，對后熟24 h的發(fā)酵乳的酸度和感官評分有重要影響。由圖1可以看出，當(dāng)菌種比例為1∶1∶4時(shí)，其感官評分為90.8，達(dá)到最大，此時(shí)滴定酸度為86.4oT，酸度適中。隨著菌種體積比的改變（酵母菌含量的相對增加），滴定酸度和感官評價(jià)呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢。可能的原因是馬克斯克魯維酵母可產(chǎn)生高活性的β-半乳糖苷酶，它是一種乳糖酶，其可以催化乳制品中乳糖的水解，使乳糖消耗，乳酸生成。乳酸含量對酸乳的滴定酸度和感官評分至關(guān)重要。但當(dāng)乳酸含量過高時(shí)，導(dǎo)致口感偏酸，感官評分降低。由此初步確定菌種配比選取1∶1∶2，1∶1∶4與1∶1∶6。

2.4.2 接種量的影響

接種量的改變，對后熟24 h的發(fā)酵乳的酸度和感官評分有重要影響。由圖2可以看出，隨著接種量的增加，滴定酸度和感官評價(jià)呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢。當(dāng)接種量為4%時(shí)，其感官評分最高為89.3?？赡艿脑蚴钱?dāng)接種量較低時(shí)乳酸菌含量較低，在相同的發(fā)酵時(shí)間內(nèi)，乳酸菌發(fā)酵產(chǎn)生的乳酸較少，導(dǎo)致酸度不夠，同時(shí)pH值較大，導(dǎo)致無法使乳中的酪蛋白凝固，乳清析出較多，感官評分較低。隨著接種量的增加，乳酸菌含量增加，滴定酸度和感官評分也隨之增加。當(dāng)乳酸菌含量過高時(shí)，在相同的發(fā)酵時(shí)間內(nèi)，乳酸菌發(fā)酵產(chǎn)生的乳酸過多，導(dǎo)致酪蛋白凝固過快，口感粗糙，口感偏酸，感官評分降低。由此初步確定接種量配比選取3%、4%、5%。

圖2 不同接種量的發(fā)酵乳發(fā)酵后熟24 h酸度和感官評分

2.4.3 發(fā)酵溫度的影響

發(fā)酵溫度的改變，對后熟24 h的發(fā)酵乳的酸度和感官評分有重要影響。隨著溫度的增加，發(fā)酵乳的酸度呈遞增趨勢。干酪乳桿菌的最適生長溫度為37℃，嗜熱鏈球菌的最適生長溫度為40℃，隨著溫度的上升，逐漸接近其最適生長溫度，產(chǎn)生的乳酸量增加，從而酸乳的酸度增加。隨著酸度的逐漸增加，感官評分下降，主要原因是酸度太高，口感不適，從而影響感官評價(jià)的分?jǐn)?shù)。由圖3可以看出，當(dāng)溫度為35℃，其感官評分值最高，在此條件下產(chǎn)生的酸乳凝乳均勻，無乳清析出，酸度適中。因此，初步確定發(fā)酵溫度選取33，35，37℃進(jìn)行正交實(shí)驗(yàn)。

圖3 不同發(fā)酵溫度的發(fā)酵乳發(fā)酵后熟24 h酸度和感官評分

2.4.4 加糖量的影響

蔗糖添加量是影響感官評分的一個(gè)很重要的因素。添加蔗糖可以緩和酸度，改善風(fēng)味，提高口感質(zhì)量。由圖4可以看出，隨著糖量的增加，感官分值呈先增后降趨勢。當(dāng)糖量增加到4%時(shí)，感官分值達(dá)到最大值88.9；而當(dāng)蔗糖添加量超過4%時(shí)，感官分值則下降。這是由于當(dāng)糖量較多時(shí)，酸奶的酸度過大，致使酸奶的香味逐漸變淡而甜味逐漸增加，掩蓋了酸奶的風(fēng)味，直接影響對產(chǎn)品的感官分值。而隨著加糖量的增加，滴定酸度呈逐漸下降的趨勢，可能原因是過多糖量的加入，使水分活度降低，并增加了溶質(zhì)的反滲透作用，因而影響菌種的發(fā)酵，從而酸度降低。由此初步確定加糖量為3，4，5 g/mL進(jìn)行正交實(shí)驗(yàn)。

2.5 酸乳發(fā)酵條件的正交實(shí)驗(yàn)

圖4 不同加糖量的發(fā)酵乳發(fā)酵后熟24 h酸度和感官評分

在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，以菌液體積比（A）、接種量（B）、發(fā)酵溫度（C）、加糖量（D）單因素試驗(yàn)為探討因素，以滴定酸度和感官評分為評定指標(biāo)，進(jìn)行四因素三水平的正交實(shí)驗(yàn)，正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析如表6所示。

由表6正交試驗(yàn)極差R可知，4個(gè)影響酸奶發(fā)酵的因素由大到小的順序?yàn)锽＞A＞C＞D，即接種量影響最大，菌種比例次之，加糖量影響最小。由K值可知，各水平的影響順序?yàn)锳2＞A3＞A1，B2＞B1＞B3，C2＞C3＞C1，D2＞D1＞D3。由正交試驗(yàn)結(jié)果直觀分析可知，理論優(yōu)化的最佳組合為A2B2C2D2，這與綜合評分值最高的第4組實(shí)驗(yàn)A2B2C3D1結(jié)果不一致，因此需要做驗(yàn)證試驗(yàn)。

2.6 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

將理論優(yōu)化的最佳組合A2B2C2D2和第4組實(shí)驗(yàn)A2B2C3D1進(jìn)行實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，得到滴定酸度值和感官評分值，并進(jìn)行綜合評定值的計(jì)算，從而確定最佳的優(yōu)化方案，結(jié)果如表7所示。

由表7可以看出，理論優(yōu)化方案A2B2C2D2綜合評定值較A2B2C3D1高，即最佳的優(yōu)化方案為A2B2C2D2。而此時(shí)的優(yōu)化條件為菌種比例1∶1∶4，接種量為4%，溫度為35℃，加糖量為4 g/100 mL。按此條件下發(fā)酵的酸乳凝固均勻，組織結(jié)構(gòu)光滑細(xì)膩，無乳清析出，具有濃郁的酸奶風(fēng)味。

3 結(jié)論

通過乳糖利用率、產(chǎn)胞外多糖能力、耐酸性三項(xiàng)指標(biāo)篩選出具有優(yōu)良發(fā)酵性能的一株馬克斯克魯維酵母菌30-1，并與干酪乳桿菌、嗜熱鏈球菌組合發(fā)酵，在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，通過正交試驗(yàn)分析確定發(fā)酵乳最佳發(fā)酵工藝條件為：V干酪乳桿菌∶V嗜熱鏈球菌：V馬克斯克魯維酵母菌=1∶1∶4，接種量為4%，發(fā)酵溫度為35℃，加糖量為每百毫升4 g。在此生產(chǎn)條件下生產(chǎn)的酸乳組織狀態(tài)均勻細(xì)膩，酸度適中，氣味濃郁，感觀評分達(dá)到89.20分，滴定酸度達(dá)到94.420T，綜合評定值為0.775。該試驗(yàn)方法所得到的最佳生產(chǎn)工藝使酸乳的品質(zhì)和風(fēng)味都有了一定的提高。

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表6 酸乳發(fā)酵工藝的L9（34）正交實(shí)驗(yàn)

表7 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

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Research on special fermentation agent of yak yoghurt

ZHANG Jingxi,LIAN Guifang,SUO Huayi
(Food Science Department,Southwest University,Chongqing 400715，China)

By selecting the capabilities of 17 Kluyveromyces marxianus which were separated and identified from the yak yoghurt fermented with traditional method,we acquired 1 Kluyveromyces marxianus which had the best ability to utilize lactose,produce exopoly saccharides and resist acid.Then we fermented yogurt with this Kluyveromyces marxianus,Lactobacillus casei 28-2 and Streptococcus thermophilus H3-3 906, which were saved in the laboratory,to determine the optimum fermentation conditions by single factor tests and orthogonal experiments. The results showed that the optimal fermentation conditions were as follows:the volume ratio of bacteria and saccharomycetes(the concentra?tion of the three microorganisms all is 1×109mL-1)is 1∶1∶4(Lactobacillus casei/Streptococcus thermophilus/Kluyveromyces marxianus),the inocula?tion amount is 4%,the fermentation temperature is 35℃，the amount of sugar is 4 g/100 mL.Under these conditions,the titratable acidity of the fermented yogurt reached 94.42oT and the sensory score was 95.

Kluyveromyces marxianus;the ability to absorb lactose;the ability to produce exopoly saccharides;the ability to resist acid;fermen?tation combination.

TS252.56

：A

：1001-2230（2017）07-0013-05

2016-11-03

國家公益性行業(yè)（農(nóng)業(yè)）科研專項(xiàng)(201303085)；重慶市社會民生科技創(chuàng)新專項(xiàng)(cstc2015shmszx80021)；中央高?；緲I(yè)務(wù)費(fèi)項(xiàng)目(xdjk2016A018)。

張靖晞（1996-），女，本科，研究方向?yàn)槭称房茖W(xué)。

索化夷