(內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)乳品生物技術(shù)與工程教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，呼和浩特010018)

哈薩克斯坦傳統(tǒng)發(fā)酵乳制品中乳酸菌的多樣性

劉紅新，呼斯楞，劉文俊，孫天松

(內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)乳品生物技術(shù)與工程教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，呼和浩特010018)

為了闡明哈薩克斯坦傳統(tǒng)發(fā)酵乳制品中乳酸菌生物多樣性，采用傳統(tǒng)純培養(yǎng)方法對(duì)采集的5份傳統(tǒng)發(fā)酵乳制品中的乳酸菌進(jìn)行分離純化，運(yùn)用16S rRNA基因序列分析方法和系統(tǒng)發(fā)育樹研究進(jìn)行屬種鑒定。結(jié)果表明，從5份傳統(tǒng)乳制品中分離鑒定了49株乳酸菌分屬于4個(gè)屬8個(gè)種或亞種，乳桿菌屬（Lactobacillus）44株，片球菌屬（Pediococcus）1株、腸球菌屬（Enterococcus）3株，鏈球菌屬（Strep?tococcus）1株。其中乳桿菌屬、片球菌屬、腸球菌屬、鏈球菌屬是哈薩克斯坦地區(qū)傳統(tǒng)發(fā)酵乳制品中的主要乳酸菌，其中Pediococcus pento?saceus為優(yōu)勢(shì)菌種，占總分離株的22%。

乳酸菌；傳統(tǒng)發(fā)酵乳制品；16S rRNA基因序列分析

0 引言

傳統(tǒng)發(fā)酵乳制品是以乳為原料，在自然開放的環(huán)境中，經(jīng)微生物發(fā)酵后，通過(guò)不同工藝制作而成的發(fā)酵乳制品。包括：酸牛奶、酸馬奶、酥油、馬奶酒、曲拉、乳酒（以馬奶為主）等[1]。傳統(tǒng)發(fā)酵乳相比于鮮乳，不僅延長(zhǎng)了食品的保質(zhì)期，也具有獨(dú)特的風(fēng)味和良好的益生作用，深受廣大消費(fèi)者所喜愛[2]。近幾年對(duì)我國(guó)不同地區(qū)傳統(tǒng)乳制品中乳酸菌研究均有報(bào)道，但對(duì)哈薩克斯坦傳統(tǒng)乳制品中乳酸菌的研究甚少，而且不夠深入。

本論文采用實(shí)驗(yàn)室純培養(yǎng)方法對(duì)哈薩克斯坦傳統(tǒng)發(fā)酵乳制品中的乳酸菌進(jìn)行分離、純化，應(yīng)用16S rRNA基因序列分析方法對(duì)分離株進(jìn)行鑒定，主要對(duì)哈薩克斯坦傳統(tǒng)發(fā)酵乳制品中的乳酸菌多樣性進(jìn)行分析，更好的了解傳統(tǒng)發(fā)酵乳制品中乳酸菌的組成與種類。

1 實(shí)驗(yàn)

1.1 樣品來(lái)源

本研究中5份奶制品樣品由內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)乳品生物技術(shù)與工程教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室的研究人員于2015年6月16日～2015年6月18日在哈薩克斯坦的不同地區(qū)采集。樣品采集后低溫保存，帶回實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2 培養(yǎng)基與試劑

菌株分離與純化培養(yǎng)基為MRS固體和MRS液體培養(yǎng)基，M17固體和M17液體培養(yǎng)基，提取DNA所用試劑，PCR擴(kuò)增和電泳檢測(cè)所用試劑，酶類，Mark?er。

1.3 樣品采集

本研究樣品來(lái)自哈薩克斯坦地區(qū)不同加工成品的傳統(tǒng)乳制品，將采集的樣品置于4℃便攜式冰箱中以維持其低溫狀態(tài)，帶回實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行乳酸菌的分離純化等實(shí)驗(yàn)。

1.4 乳酸菌的分離純化及保存

乳酸菌計(jì)數(shù)：采用傾注培養(yǎng)法[3]。將樣品混勻，用濃度為0.85%的無(wú)菌生理鹽水以十倍稀釋法[4]對(duì)樣品進(jìn)行梯度稀釋，選取10-5，10-6，10-7稀釋液1 mL于無(wú)菌培養(yǎng)皿中（組內(nèi)做兩個(gè)平行），分別傾注20～25 mLMRS和M17固體培養(yǎng)基混勻，置于30℃恒溫培養(yǎng)箱中厭氧培養(yǎng)48～72 h。菌落形成后進(jìn)行計(jì)數(shù)，計(jì)數(shù)即為每毫升樣品的菌落數(shù)。

吸取0.2 mL上述不同梯度（10-5，10-6，10-7）的稀釋液分別涂布于加有放線菌酮和多黏菌素（1×10-5）的MRS和M17固體培養(yǎng)基上，涂布后置于37℃恒溫培養(yǎng)箱中厭氧培養(yǎng)48 h，待菌落形成后，觀察并記錄菌落形態(tài)（顏色、形狀、大小、邊緣等），隨機(jī)挑取形態(tài)學(xué)特征不同的單個(gè)菌落，于MRS或M17固體培養(yǎng)基上劃線分離2～3次，直至鏡檢結(jié)果為純的單菌后編號(hào)并傳代。選取革蘭氏陽(yáng)性、過(guò)氧化氫陰性的純培養(yǎng)物，加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.1%谷氨酸鈉的脫脂乳保護(hù)劑，分裝混勻后置于-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 總DNA的提取及純度的檢測(cè)

純化好的菌株采用液氮反復(fù)凍融-CTAB法提取乳酸菌基因組DNA[5-6]。再用ND-1000型微量紫外分光光度計(jì)測(cè)其濃度和純度。再用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1.0%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。

1.616 S rRNA基因的PCR擴(kuò)增

PCR擴(kuò)增16S rRNA基因的引物采用細(xì)菌通用引物[7]，引物序列為：

FA-27F：5'-GCAGAGTTCTCGGAGTCACGA AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′，

RA-1495R：5'-AGCGGATCACTTCACACAG GACTACGGCTACCTTGTTACGA-3′。

擴(kuò)增體系：5 μL10×EasyTaq Buffer(+Mg2+)；4 μL High Pure dNTPs（2.5 mmol/L）；1.5 μL引物FA-27F（濃度10 mmol/L）；1.5 μL引物RA-1495R（10 mmol/L）；0.5 μL EasyTaq DNA polymerase（5 U/μ L）；2 μL DNA模板（質(zhì)量濃度100 ng/μL）；35.5 μL ddH2O。

PCR擴(kuò)增循環(huán)參數(shù)為：94℃預(yù)變性5 min；94℃變性1 min，58℃退火1 min，72℃延伸2 min，30個(gè)循環(huán)；72℃末端延伸10 min[8]。

擴(kuò)增完畢后，取約2 μL的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1.0%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，若在1 500 bp處有清晰的擴(kuò)增條帶且無(wú)拖尾、彌散現(xiàn)象，則PCR擴(kuò)增成功。將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物送往上海美吉生物公司進(jìn)行純化和DNA測(cè)序。

1.7 同源性分析

將測(cè)序得到的DNA序列運(yùn)用DNA Star 5.01軟件中的SepMan模塊，對(duì)所測(cè)得菌株的兩條16S rRNA基因序列進(jìn)行整理、拼接、校準(zhǔn)，得到1 450 bp左右的有效序列，再利用NCBI中的BLAST（http://blast.ncbi. nlm.nih.gov/Blast.cgi）將拼接好的序列與數(shù)據(jù)庫(kù)中已鑒定的乳酸菌16S rDNA序列進(jìn)行同源性比對(duì)，將待鑒定菌株序列與同源性最高的模式菌株序列應(yīng)用MEGA 5.0（http://www.megasoftware.net）軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，進(jìn)行遺傳進(jìn)化研究。

2 結(jié)果分析與討論

2.1 乳酸菌的計(jì)數(shù)結(jié)果

活菌數(shù)是乳制品樣品新鮮程度的重要指標(biāo)。由表1可知，哈薩克斯坦傳統(tǒng)乳制品樣品活菌數(shù)在4.95～7.67 mL-1（對(duì)數(shù)值）之間，平均值為6.34±0.05 mL-1（對(duì)數(shù)值）。其中駝奶、酸馬奶高于106mL-1，符合新的酸奶國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)。楊吉霞等人[9]研究了西藏、云南、新疆3個(gè)地區(qū)奶酪中的乳酸菌活菌數(shù)分別為3.74～4.60，3.62～4.98，3.31～4.49 mL-1（對(duì)數(shù)值）。楊彥榮等[10]在自俄羅斯卡爾梅克共和國(guó)奶酪樣品中乳酸菌數(shù)為6.64～9.05 mL-1（對(duì)數(shù)值）。呼斯楞等人[11]對(duì)內(nèi)蒙古呼倫貝爾傳統(tǒng)乳制品進(jìn)行分析研究乳酸菌活菌數(shù)在6.80～9.00 mL-1（對(duì)數(shù)值）之間。Bao Qiuhua[12]對(duì)四川曲拉進(jìn)行研究，活菌數(shù)為（7.18±1.49）mL-1（對(duì)數(shù)值）。由此可見哈薩克斯坦地區(qū)乳制品的新鮮程度比較高。

表1 哈薩克斯坦傳統(tǒng)乳制品中乳酸菌活菌計(jì)數(shù)結(jié)果

2.2 乳酸菌的鑒定

2.2.1 乳酸菌分離株的菌落形態(tài)及表型特征

根據(jù)乳酸菌的形態(tài)學(xué)特征[13-14]，初步從4份傳統(tǒng)乳制品樣品中共分離出49株疑似乳酸菌的菌株。在MRS和M17固體培養(yǎng)基上菌株的菌落呈圓形，中等大小，凸起，乳白色，濕潤(rùn)，邊緣整齊，有些菌落表面光滑有些粗糙。經(jīng)過(guò)革蘭氏染色、過(guò)氧化氫酶反應(yīng)，均為革蘭氏陽(yáng)性，過(guò)氧化氫陰性菌。初步將49株菌定為乳酸菌。

2.2.2 菌種DNA提取和16S rRNA擴(kuò)增結(jié)果

DNA濃度和OD260/280的測(cè)定：OD260/280值在1.8～2.0間即為純DNA樣品。將其質(zhì)量濃度稀釋至100 ng/μL后對(duì)乳酸菌分離株16S rRNA基因進(jìn)行擴(kuò)增。經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，可以觀察到在大約1 500 bp的位置處有一條清晰明亮的條帶，并且無(wú)彌散現(xiàn)象，無(wú)明顯非特異擴(kuò)增現(xiàn)象。

圖1 部分分離菌16S rRNA基因的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳圖

這表明菌株的16S rRNA基因擴(kuò)增產(chǎn)物可以滿足測(cè)序的要求。將16S rRNA基因擴(kuò)增產(chǎn)物送于上海美吉生物科技有限公司進(jìn)行測(cè)序。所有的16S rD?NA序列都與GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中的模式株有99%及以上的相似度。

2.2.3 系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建和乳酸菌鑒定結(jié)果

將測(cè)序獲得的16S rRNA基因序列通過(guò)NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中BLAST進(jìn)行同源序列比對(duì)分析，以與模式菌株序列同源性大于98%為種的鑒定閾值，將49株分離株鑒定為乳酸菌的4個(gè)屬，8個(gè)種。部分分離株與模式株系統(tǒng)發(fā)育樹如圖2所示。

圖2 哈薩克斯坦地區(qū)代表性分離株的16S rRNA基因序列的系統(tǒng)發(fā)育樹

由圖2可以看出，IMAU95170(KU555483)、IMAU 95157(KU555493)與模式菌株Lactobacillus brevis ATCC 14869聚為一類，且同源性為100%，故將其鑒定為L(zhǎng)ac?tobacillus brevis。菌株IMAU95177(KU555498)、IMAU9 5172(KU555504)與模式菌株P(guān)ediococcus pentosaceus DSM 20336(T)聚為一類，且同源性為100%，因此可將其鑒定為Pediococcus pentosaceus。菌株IMAU95148 (KU555495)、IMAU95152(KU555481)與模式菌株Lac?tobacillus plantarum ATCC 14917(AJ965482)聚為一類，且同源性為99%，故將其歸為L(zhǎng)actobacillus plantarum。菌株IMAU95145(KU555491)與模式菌株Lactobacillus crustorum LMG 23699T聚為一類，且同源性高達(dá)100%，因此可將其歸為L(zhǎng)actobacillus crustorum。菌株IMAU95140(KU555436)、IMAU95181(KU555455)與模式菌株Lactobacillus helveticus(AM113779)聚為一類，且同源性高達(dá)100%，故將其鑒定為L(zhǎng)actobacillus helveti?cus。菌株IMAU95149(KU555457)、IMAU95186 (KU555488)與模式菌株Enterococcus faecium 1ATCC 19434聚為一類，且同源性達(dá)到99%，因此鑒定為En?terococcus faecium。IMAU95187(KU555511)與模式菌株Streptococcus thermophilus ATCC 19258聚為一類，同源性達(dá)到100%，故將其歸為Streptococcus thermophilus。

2.3 優(yōu)勢(shì)菌種分析

哈薩克斯坦地區(qū)傳統(tǒng)發(fā)酵乳制品中乳酸菌的分離結(jié)果見表2。由表2可知，5份傳統(tǒng)發(fā)酵乳制品中分離出的49株乳酸菌疑似菌株，經(jīng)16S rDNA序列測(cè)定和同源性分析鑒定，分屬于4個(gè)屬8個(gè)種或亞種。5份樣品均分離到Pediococcus pentosaceus，共11株，占總分離株的22%，為五份哈薩克斯坦地區(qū)的優(yōu)勢(shì)菌種。其中HSK1、HSK2、HSK4樣品分離出Lactobacillus helveticus，且共分離出16株，占總分離株的33%，說(shuō)明Lactobacil?lus helveticus為哈薩克斯坦地區(qū)HSK1、HSK2、HSK4樣品中乳酸菌的優(yōu)勢(shì)菌種。由表2還可以看出，HSK5（奶酪）分離的菌種類別最多，分別為L(zhǎng)actobacillus plan?tarum、Lactobacillus brevis、Lactobacillus crustorum、Pediococcus pentosaceus、Enterococcus faecium。其次為HSK4（奶酪），分別為L(zhǎng)actobacillus helveticus、Lactobacillus plantarum、Lac?tobacillus brevis、Pediococcus pentosaceus。由于本次采樣樣品比較少，而且沒有定點(diǎn)、全面采樣，可能是HSK1（酸駝奶）和HSK2（酸馬奶）分離的菌種類別較少的原因，以后研究進(jìn)行改善。綜上所述，本研究的5份傳統(tǒng)發(fā)酵乳制品中優(yōu)勢(shì)菌種為Pediococcus pentosaceus，占總分離株的22%。

表2 哈薩克斯坦地區(qū)傳統(tǒng)乳制品中乳酸菌的分離結(jié)果

3 結(jié)論

本研究從哈薩克斯坦地區(qū)采集的5份傳統(tǒng)發(fā)酵乳制品樣品中乳酸菌數(shù)為4.95～7.67 mL-1（對(duì)數(shù)值），乳酸菌含量都比較高。5份乳樣品中共分出49株菌，經(jīng)鑒定分別歸屬于Streptococcus thermophilus、Enterococcus faecium、Pediococcus pentosaceus、Lactobacillus plantarum、Lac?tobacillus brevis、Lactobacillus crustorum、Lactobacillus helveti?cus、Lactobacillus delbrueckii subsp.Bulgaricus 8個(gè)種或亞種。其中Pediococcus pentosaceus為哈薩克斯坦地區(qū)傳統(tǒng)發(fā)酵乳制品中的優(yōu)勢(shì)菌種，占總分離株的22%。

4 討論

4.1 研究方法的可靠性

16S rRNA基因序列分析方法在乳酸菌分離鑒定中應(yīng)用較多，近幾年，隨著核酸測(cè)序技術(shù)的發(fā)展，越來(lái)越多的16S rRNA基因序列被輸入數(shù)據(jù)庫(kù)，有大量的數(shù)據(jù)和強(qiáng)大的數(shù)據(jù)庫(kù)作支持。本文采用16S rRNA基因序列分析方法對(duì)不同樣品中乳酸菌進(jìn)行分離鑒定，與傳統(tǒng)生理生化方法相比，此方法更為可靠[15]。

4.2 菌種分析

本研究的5份傳統(tǒng)發(fā)酵乳制品中優(yōu)勢(shì)菌種為Pediococcus pentosaceus，而Aydemir等[16]所研究的奶酪中優(yōu)勢(shì)菌為L(zhǎng)actobacillus casei和Lactobacillus plantarum；Watanabe等[17]和Takeda等[18]對(duì)內(nèi)蒙古自然發(fā)酵牛乳進(jìn)行研究，結(jié)果表明，德氏乳桿菌保加利亞亞種(Lac?tobacillus delbrueckii subsp.bulgaricus)是蒙古國(guó)自然發(fā)酵牛乳的優(yōu)勢(shì)乳酸菌菌群。Airidengcaicike等[19]對(duì)西藏藏南和藏北地區(qū)發(fā)酵酸牛乳進(jìn)行分析研究，分析表明在寒冷的藏北那曲、拉薩地區(qū)以發(fā)酵乳桿菌(Lactoba?cillus fermentum)和干酪乳桿菌(Lactobacillus casei)為優(yōu)勢(shì)菌群。前人也曾報(bào)道，當(dāng)環(huán)境酸度較高時(shí)，乳酸球菌的生長(zhǎng)受到抑制[20-21]，所以戊糖片球菌多數(shù)在酸腌菜、泡菜、青貯料等中分離得到，和本文分離的結(jié)果存在差異，可能與當(dāng)?shù)氐臍夂?、環(huán)境、發(fā)酵溫度和發(fā)酵時(shí)間以及制作方法等因素有關(guān)。本研究對(duì)傳統(tǒng)發(fā)酵乳制品進(jìn)行多樣性分析，這對(duì)豐富我國(guó)乳酸菌菌庫(kù)很有幫助，為乳酸菌資源開發(fā)與研究奠定良好的基礎(chǔ)。

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Survey of diversity of Lactic acid bacteria in traditional fermented milk products from Kazakhstan

LIU Hongxin，HU Sileng，LIU Wenjun，SUN Tiansong
(Key Laboratory of Dairy Biotechnology and Engineering,Ministry of Education,Inner Mongolia Agricultural Universi?ty,Huhhot 010018,China)

The aim of this paper is to research the diversity of Lactic acid bacteria in traditional fermented milk products from Kazakhstan.Lactic acid bacteria were isolated and purified by traditional pure culture form traditional fermented milk products samples,and then all isolates were identified by 16S rRNA gene sequence analysis.A total of 49 strains of Lactic acid bacteria were classified into 4 genera and 8 species or subspe?cies,namely Lactobacillus(44 strains),Pediococcus(1 strains),Enterococcus(3 strains),Streptococcus(1 strain).Pediococcus pentosaceus was regarded as the dominant species,occupied 22%of the total isolates.

Lactic acid bacteria；traditional fermented milk products；16S rDNA sequence analysis

TS252.54，Q939.11+7

：A

：1001-2230（2017）07-0009-04

2016-09-06

國(guó)家科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目（2013BAD18B01）；國(guó)家自然科學(xué)基金課題（31471711）。

劉紅新（1991-），女，碩士研究生，研究方向?yàn)槲⑸锷砼c發(fā)酵工藝。

孫天松