（廣東出入境檢驗(yàn)檢疫局，廣州510623）

液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定嬰幼兒食品中維生素D3的質(zhì)量濃度

林海丹，謝守新，鐘鈺，劉超，謝玉珊，丁博，鄒志飛

（廣東出入境檢驗(yàn)檢疫局，廣州510623）

建立了同位素內(nèi)標(biāo)液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定嬰幼兒食品中維生素D3質(zhì)量分?jǐn)?shù)。試樣加同位素內(nèi)標(biāo)后，乙醇-50%氫氧化鉀溶液皂化，石油醚萃取，Atlantis T3色譜柱（100 mm×2.1 mm，3 μm），甲醇-5 mmol/L甲酸胺溶液作為流動(dòng)相，梯度洗脫進(jìn)行液相分離，采用電噴霧正離子方式，多反應(yīng)選擇離子監(jiān)測(cè)，內(nèi)標(biāo)法峰面積定量。嬰幼兒食品中維生素D3質(zhì)量濃度在2～200 μg/L范圍內(nèi)線性良好，相關(guān)系數(shù)r均大于0.99，配方奶粉和米粉在10，50和100 μg/kg三個(gè)質(zhì)量分?jǐn)?shù)水平的添加回收率分別為86.1%～107%和86.2%～106%,變異系數(shù)分別為4.48%～7.08%和2.10%～4.26%(n=6)。方法的定量限為10 μg/kg。方法簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確，適用于嬰幼兒食品中維生素D3的檢測(cè)。

液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法；嬰幼兒食品；維生素D3

0 引言

維生素D是一種脂溶性維生素，與人體健康關(guān)系密切的是維生素D2（麥角骨化醇）和維生素D3（膽鈣化醇）。嬰幼兒食品中通常添加的維生素D3作為必需成分，我國(guó)也制定了其使用限量標(biāo)準(zhǔn)[1-3]。

食品中維生素D檢測(cè)的經(jīng)典方法是樣品經(jīng)皂化，萃取凈化后液相色譜法分析，如我國(guó)國(guó)標(biāo)方法[4]，但是乳品中維生素D的含量較低，需采用半制備色譜法純化、富集后才能滿足檢測(cè)需求，該方法繁瑣，同時(shí)也可能有基質(zhì)干擾，可操作性不強(qiáng)。近年來(lái)，選擇性強(qiáng)、靈敏度高的液相色譜-質(zhì)譜法[5-7]已有應(yīng)用于維生素D的檢測(cè)，如AOAC方法[8]。

本研究采用同位素內(nèi)標(biāo)法，高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜測(cè)定嬰幼兒食品中維生素D3，旨在建立一種簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確的定性定量方法。

1 實(shí)驗(yàn)

1.1 材料與試劑

甲醇（HPLC級(jí)），石油醚，乙醇，無(wú)水硫酸鈉，氯化鈉，氫氧化鉀，抗壞血酸，淀粉酶(酶活力≥1 500 U/ g)，維生素D3標(biāo)準(zhǔn)品（純度≥97%），氘代維生素D3標(biāo)準(zhǔn)溶液（維生素D3-[6,19,19-2H3]），100 mg/L，純度≥97%）。

用乙醇配制維生素D3標(biāo)準(zhǔn)溶液（質(zhì)量濃度10 mg/L），使用前需校正，參見(jiàn)GB 5413.9-2010附錄A。再用乙醇逐級(jí)稀釋維生素D3標(biāo)準(zhǔn)溶液配成2～200 μg/L的維生素D3標(biāo)準(zhǔn)工作液，每毫升標(biāo)準(zhǔn)工作溶液含有100 ng的氘代維生素D3。

1.2 儀器與設(shè)備

AB 4000 QTRAP串聯(lián)質(zhì)譜儀配有電噴霧離子源，島津液相色譜儀(四元低壓梯度輸液泵,自動(dòng)進(jìn)樣器,柱溫箱)，AB公司Analyst儀器控制及數(shù)據(jù)處理軟件，分析天平，恒溫箱，水浴振蕩器，渦旋振蕩器，減壓旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器。

1.3 方法

1.3.1 樣品前處理

準(zhǔn)確稱取1 g試樣于50 mL離心管中，加入10 mL約40～50℃的水使，100 μL氘代維生素D3標(biāo)準(zhǔn)溶液（1 mg/L），渦旋混合30 s。淀粉試樣需加入0.4 g淀粉酶，渦旋混合30 s，充氮排出空氣，蓋上瓶蓋。放入恒溫箱中，60℃培養(yǎng)30 min，取出備用。

于上述處理的試樣溶液加入0.4 g抗壞血酸，加12 mL乙醇，渦旋混合30 s，加入5 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為50%氫氧化鉀水溶液，渦旋混合30 s，充氮排出空氣，蓋上瓶蓋，置于75℃水浴振蕩40～50 min，取出立即冷卻至室溫。用少量飽和氯化鈉水溶液將上述皂化液全部轉(zhuǎn)入250 mL分液漏斗中，加入30 mL石油醚，輕輕搖動(dòng)，排氣后蓋好瓶塞，置于分液漏斗振蕩儀劇烈振蕩3 min，靜置分層，收集石油醚層，按上述方法進(jìn)行第二次萃取，合并石油醚于分液漏斗中，用飽和氯化鈉水溶液洗至近中性，石油醚經(jīng)裝有脫脂棉和無(wú)水硫酸鈉的漏斗過(guò)濾至100 mL雞心瓶中，置減壓旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，40℃蒸干，立即加入乙醇1 mL，渦旋混合30 s，過(guò)0.45 μm濾膜后，供液相色譜質(zhì)譜LC-MS/MS測(cè)定。

1.3.2 色譜及質(zhì)譜條件

色譜柱為Atlantis T3柱（100 mm×2.1 mm，3 μm）；流動(dòng)相為甲醇(A)-5 mmol/L甲酸胺(B)，0～2min，A為95%；2.01～7min，A為98%；7.01～10 min，A為95%；流速為0.40 mL/min；柱溫為40℃；進(jìn)樣量為10 μL。

質(zhì)譜條件如表1和表2所示。

表1 電噴霧離子源（ESI）的各參數(shù)

2 結(jié)果與討論

2.1 同位素的選擇

液相色譜質(zhì)譜定量分析采用同位素內(nèi)標(biāo)法，由于同位素的物理，化學(xué)性質(zhì)相近，在樣品前處理時(shí)加入同位素內(nèi)標(biāo)，既校正了回收率又同時(shí)有效校正質(zhì)譜分析時(shí)的基質(zhì)效應(yīng)。

2.2 樣品前處理方法的優(yōu)化

乳品中維生素D是脂溶性的，經(jīng)典方法，如國(guó)標(biāo)法和AOAC方法均采用乙醇-氫氧化鉀溶液皂化，皂化時(shí)添加抗壞血酸保護(hù)維生素D，避免氧化，與國(guó)標(biāo)法相比，本方法采用液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法檢測(cè)，靈敏度高，因此本方法減少稱樣量，抗壞血酸加入改為直接添加固體試劑，減少體系的溶劑體積，這樣有利于下一步的皂化。皂化置振蕩器中振搖，體積少，更加振動(dòng)充分，選擇氣密性好的具塞離心管，避免密封不好帶入氧氣造成維生素D的氧化損耗。提高皂化溫度，實(shí)驗(yàn)表明溫度提高至75℃，維生素D沒(méi)損失，而油脂皂化更加徹底，回收率和實(shí)際樣品的檢測(cè)結(jié)果更為準(zhǔn)確。

表2 多反應(yīng)選擇離子監(jiān)測(cè)方式(MRM)的各參數(shù)

2.3 質(zhì)譜條件的優(yōu)化

比較了APCI和ESI離子源，發(fā)現(xiàn)APCI源的維生素D靈敏度和信噪比都不如ESI源，同時(shí)對(duì)樣品采用不同源分析，考察基質(zhì)干擾，APCI源沒(méi)有明顯改善基質(zhì)干擾，因此采用ESI電噴霧離子源。

對(duì)1 mg/L標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行母離子和子離子掃描和對(duì)其質(zhì)譜參數(shù)優(yōu)化，結(jié)果表明正離子模式監(jiān)測(cè)的靈敏度高。維生素D及其內(nèi)標(biāo)的子離子全掃描質(zhì)譜圖見(jiàn)圖1-圖2。確定的質(zhì)譜參數(shù)后，采用維生素D標(biāo)準(zhǔn)溶液自動(dòng)進(jìn)樣，進(jìn)行優(yōu)化色譜流動(dòng)相和離子源氣體的各參數(shù)。當(dāng)分別用甲醇-水、甲醇-0.1%甲酸、甲醇-0.1%乙酸、甲醇-5 mmol/L甲酸銨，甲酸銨的響應(yīng)值相對(duì)較高，采用乙腈代替甲醇，響應(yīng)值沒(méi)有明顯變化。因此選用甲醇-5 mmol/L甲酸銨作為流動(dòng)相，靈敏度足以滿足要求。

圖1 維生素D3的子離子掃描質(zhì)譜

2.4 質(zhì)譜碎裂機(jī)理解析

對(duì)維生素D3質(zhì)譜子離子掃描獲得碎片進(jìn)行解析如圖3所示。

2.5 色譜條件的優(yōu)化

圖2 氘代維生素D3的子離子掃描質(zhì)譜

圖3 維生素D3的質(zhì)譜解析

經(jīng)質(zhì)譜條件篩選后選用甲醇-5 mmol/L甲酸銨溶液作為流動(dòng)相，考察其色譜行為，對(duì)樣液進(jìn)行分析，考察峰形，基質(zhì)干擾等分離問(wèn)題，試驗(yàn)梯度洗脫條件，確定最佳的洗脫梯度?？疾觳煌V柱，維生素D3在很多普通C18色譜柱上都可以得到很好的峰形，考察樣液的基質(zhì)峰與目標(biāo)峰的色譜分離行為，確定采用waters Atlantis T3柱(100 mm×2.1 mm，粒度3 μm,)，分離效果好。試驗(yàn)梯度洗脫條件，確定最佳的洗脫梯度，維生素D3標(biāo)準(zhǔn)（50 μg/L）及其內(nèi)標(biāo)（100 μg/L）的MRM圖如圖4-圖6所示。

圖4 維生素D3標(biāo)準(zhǔn)m/z 385.4/259.3離子對(duì)色譜

圖5 維生素D3標(biāo)準(zhǔn)m/z 385.4/107離子對(duì)色譜

圖6 標(biāo)準(zhǔn)內(nèi)標(biāo)m/z 388.6/259.2離子對(duì)色譜

圖7 配方奶粉內(nèi)標(biāo)m/z 388.6/259.2離子對(duì)色譜

圖8 配方奶粉m/z 385.4/259.3離子對(duì)色譜

圖9 配方奶粉m/z 385.4/107離子對(duì)色譜

圖10 米粉m/z 385.4/259.3離子對(duì)色譜

圖11 米粉m/z 385.4/107離子對(duì)色譜

圖12 米粉內(nèi)標(biāo)m/z 388.6/259.2離子對(duì)色譜

2.6 線性范圍

用乙醇配成的一系列質(zhì)量濃度的標(biāo)準(zhǔn)混合工作溶液按實(shí)驗(yàn)的色譜條件進(jìn)行測(cè)定，以分析物與內(nèi)標(biāo)物峰面積比(Y)-分析物與內(nèi)標(biāo)物質(zhì)量濃度比(X)作校正曲線，得到線性回歸方程Y=1.17X+0.011，維生素D3質(zhì)量濃度在2～200 μg/L范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)均大于0.99。

2.7 回收率、精密度及定量限

用不含維生素D的嬰幼兒配方奶粉（由雀巢公司提供無(wú)添加維生素D的配方奶粉）和米粉樣品（市售）進(jìn)行添加回收和精密度實(shí)驗(yàn)，維生素D3添加定量限水平的多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(MRM)色譜如圖7～圖12所示。配方奶粉和米粉在10，50和100 μg/kg 3個(gè)質(zhì)量分?jǐn)?shù)水平的添加回收率分別為86.1%～107%和86.2%～106%,變異系數(shù)分別為4.48%～7.08%和2.10%～4.26%(n=6)。方法的回收率和精密度符合GB/T 27404-2008《實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量控制規(guī)范食品理化檢測(cè)》對(duì)檢測(cè)方法確認(rèn)的技術(shù)要求對(duì)回收率和精密度的要求，結(jié)果見(jiàn)表3。

實(shí)驗(yàn)表明樣品中維生素D3在添加10 μg/kg水平時(shí)，信噪比（S/N）大于10，且回收率和精密度滿意，因此以10 μg/kg作為方法的定量限。

表3 嬰幼兒食品中維生素D3的添加回收率和精密度(n=6)

2.8 實(shí)際樣品分析

對(duì)含維生素D3的質(zhì)控樣品（美贊臣提供的經(jīng)全球比對(duì)定值的樣品）進(jìn)行測(cè)定6次，平均測(cè)定值91.0μg/ kg，變異系數(shù)為4.30%(n=6)。結(jié)果在全球各實(shí)驗(yàn)室定值范圍（72.3～97.0μg/kg）內(nèi)。

3 結(jié)束語(yǔ)

本方法研究建立了嬰幼兒食品中維生素D3的高效液相質(zhì)譜聯(lián)用法。方法的樣品的前處理簡(jiǎn)單、易操作、定量準(zhǔn)確，適用于嬰幼兒食品中維生素D3的檢測(cè)。與國(guó)標(biāo)法比較，儀器的靈敏度提高了，不需采用半制備色譜的方法可以達(dá)到檢測(cè)的要求，減少試劑的消耗和縮短了檢測(cè)時(shí)間，同時(shí)質(zhì)譜法的定性的準(zhǔn)確性高。與其它同類方法比，采用同位素內(nèi)標(biāo)定量，有效降低基質(zhì)效應(yīng)和校正回收，定量更準(zhǔn)確。

[1]GB 10765-2010《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)嬰兒配方食品》[S].

[2]GB10767-2010《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)較大嬰兒和幼兒配方食品》[S].

[3]GB 10769-2010《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)嬰幼兒谷類輔助食品》[S].

[4]GB 5413.9-2010《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)嬰幼兒食品和乳品中維生素A、D、E的測(cè)定》[S]

[5]謝玉珊.謝守新.宋陽(yáng).液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法測(cè)定乳品中維生素D3質(zhì)量濃度[J].中國(guó)乳品工業(yè),2015.43(1):33-35.

[6]霍艷敏.王駿.段文增.HPLC-APCI(+)-MS/MS測(cè)定乳制品中的維生素D2及D3[J].分析測(cè)試學(xué)報(bào),2016.35(3):327-331.

[7]朱姜.張鵬.楊嘉.高效液相色譜_串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定奶粉中的維生素A、維生素D、維生素E[J].食品與藥品檢驗(yàn),2015.25(11):1733-1735.

[8]AOAC Official Method 2012.11 First,Action 2012《Simultaneous De?termination of Vitamins D2and D3in Infant Formula and Adult/Pediat?ric Nutritional Formula ESI LC-MS/MS》[S].

Determination of Vitamin D3in foods for infants and young children with iso?tope-labeled internal standard by liquid chromatography tandem mass spec?trometry

LIN Haidan，XIE Shouxin，ZHONG Yu，LIU Chao，XIE Yushan，DING Bo，ZOU Zhifei
(Guangdong Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau,Guangzhou 510623,China)

To develop a isotope-labeled internal standard liquid chromatography tandem mass spectrometry（LC-MS/MS）method for the determination of vitamin D3in foods for infants and young children.The sample was inoculated with a isotope-labeled internal standard and saponified with ethanol–50%potassium hydroxide，followed by extraction with petroleum ether.The chromatographic separation was per?formed on the Atlantis T3 column(100 mm×2.1 mm，3 μm）,using methanol-5 mmoL/L ammonium formate solution as the mobile phase by gradient elution.The method applied positive electrospray ionization and multiple reaction monitoring mode and quantified with peak ar?ea with internal standard method.A good linearity was obtained for 2～2000 μg/L with a correlation coefficient above 0.99.The average re?coveries from three different were with the range of 86.1%to 107%and 86.2%to 106%respectively in formula and rice flour at spiked levels of 10,50,100 μg/kg.and the relative standard deviations were between 4.48%to 7.08%and 2.60%to 4.26%respectively(n=6).The limit of quantification was 10 μg/kg.This method is simple,accurate and suitable for determination of vitamin D3in foods for infants and young chil?dren.

liquid chromatography tandem mass spectrometry；foods for infants and young children；vitamin D3

TS252.7

：A

：1001-2230（2017）07-0056-04

2017-02-13

林海丹（1970-），女，研究員，主要從事食品化學(xué)分析工作。