趙佳琪，王婉瑩，范業(yè)寧，馬春平，張東紅，呂 揚(yáng)，趙 臣

(吉林醫(yī)藥學(xué)院檢驗(yàn)學(xué)院，吉林吉林 132013)

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基于SOE-PCR的核酸疫苗pIRES2-MLAA34-HSP70的構(gòu)建及免疫效果研究

趙佳琪，王婉瑩，范業(yè)寧，馬春平，張東紅，呂 揚(yáng)，趙 臣△

(吉林醫(yī)藥學(xué)院檢驗(yàn)學(xué)院，吉林吉林 132013)

目的 構(gòu)建pIRES2-MLAA34-HSP70重組質(zhì)粒，并檢測(cè)其免疫效果。方法 采用逆轉(zhuǎn)錄PCR(RT-PCR)的方法提取急性單核細(xì)胞白血病相關(guān)抗原基因MLAA-34和熱休克蛋白(HSP)70基因，設(shè)計(jì)特異性重疊引物，以重疊延伸PCR(SOE-PCR)技術(shù)擴(kuò)增MLAA34-HSP70融合基因，構(gòu)建核酸疫苗pIRES2-MLAA34-HSP70。將核酸疫苗免疫BALB/c小鼠，檢測(cè)小鼠脾淋巴細(xì)胞對(duì)U937細(xì)胞的殺傷作用及小鼠脾細(xì)胞懸液中白細(xì)胞介素(IL)-2、IL-4和γ干擾素(IFN-γ)水平。結(jié)果 擴(kuò)增出MLAA34-HSP70融合基因2 956 bp，成功構(gòu)建了核酸疫苗pIRES2-MLAA34-HSP70，經(jīng)鑒定與預(yù)期結(jié)果一致；脾淋巴細(xì)胞殺傷活性結(jié)果顯示，核酸疫苗pIRES2-MLAA34-HSP70對(duì)U937細(xì)胞的殺傷效率明顯高于其他實(shí)驗(yàn)組及對(duì)照組(P<0.01)；核酸疫苗pIRES2-MLAA34-HSP70組細(xì)胞因子IL-2、IL-4和IFN-γ水平亦明顯高于其他實(shí)驗(yàn)組及對(duì)照組(P<0.01)。結(jié)論 成功構(gòu)建了pIRES2-MLAA34-HSP70核酸疫苗，該核酸疫苗能誘發(fā)強(qiáng)烈的體液免疫，增強(qiáng)機(jī)體對(duì)腫瘤細(xì)胞的免疫應(yīng)答，對(duì)MLAA34陽(yáng)性細(xì)胞具有特異性殺傷作用。

疫苗，DNA；重疊延伸PCR；白血病，單核細(xì)胞，急性；MLAA-34；熱休克蛋白質(zhì)類70

核酸疫苗是將編碼某種抗原蛋白的外源基因?qū)雱?dòng)物體細(xì)胞內(nèi)，并通過宿主細(xì)胞的表達(dá)系統(tǒng)合成抗原蛋白，誘導(dǎo)宿主產(chǎn)生對(duì)該抗原蛋白的免疫應(yīng)答反應(yīng)，以達(dá)到預(yù)防和治療疾病的目的[1]?？乖砦换蚴呛怂嵋呙绲暮诵牟糠?，以融合基因?yàn)槟康幕驑?gòu)建核酸疫苗已是業(yè)界的共識(shí)。將相同或相似功能的基因融合，可以增強(qiáng)目的蛋白的免疫原性，提高核酸疫苗的免疫保護(hù)效應(yīng)。重疊延伸PCR(gene splicing by overlap extension PCR,SOE-PCR)采用互補(bǔ)末端引物，使PCR產(chǎn)物形成重疊鏈，從而將來源不同的多個(gè)基因片段拼接在一起[2]。利用SOE-PCR技術(shù)不需要內(nèi)切酶消化和連接酶處理即可進(jìn)行有效的基因重組，因而在構(gòu)建融合基因、定點(diǎn)突變及基因敲除等方面有著廣泛的應(yīng)用[3]。本研究擬采用SOE-PCR技術(shù)將急性單核細(xì)胞白血病相關(guān)抗原基因MLAA-34及熱休克蛋白70(HSP70)融合為MLAA34-HSP70融合基因，進(jìn)而構(gòu)建核酸疫苗pIRES2-MLAA34-HSP70，免疫BALB/c小鼠并檢測(cè)其脾淋巴細(xì)胞對(duì)U937細(xì)胞的殺傷效應(yīng)，為核酸疫苗的抗腫瘤研究提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料 U937細(xì)胞、pIRES2-EGFP和pIRES2-EGFP-HSP70質(zhì)粒為本課題組保存。BALB/c鼠[無特定病原體(SPF)級(jí)，雌性，6～8周齡]購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司。噻唑藍(lán)(MTT)試劑、限制性內(nèi)切酶(EcoRⅠ/BamHⅠ)購(gòu)自美國(guó)NEB公司，總RNA提取試劑盒、無內(nèi)毒素質(zhì)粒提取試劑盒、逆轉(zhuǎn)錄PCR(RT-PCR)試劑盒、T4 DNA連接酶、膠回收純化和酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)等試劑盒購(gòu)自生工生物工程(上海)股份有限公司，胎牛血清、RPMI 1640(高糖)培養(yǎng)基購(gòu)自美國(guó)Hyclone公司；無水乙醇、氯仿等常規(guī)試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 引物設(shè)計(jì)與合成 根據(jù)質(zhì)粒pIRES2-EGFP多克隆位點(diǎn)情況選取EcoRⅠ和BamHⅠ酶切位點(diǎn)進(jìn)行基因克隆。MLAA-34基因(GenBank：AY288977.2)擴(kuò)增片段理論長(zhǎng)度為1 014 bp，HSP70基因(GenBank：NM_005345.5)擴(kuò)增片段理論長(zhǎng)度為1 927 bp，P2和P3引物設(shè)計(jì)重疊序列GGC GGC GGC GGC GGC，引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，見表1。

表1 引物堿基序列

1.3 細(xì)胞培養(yǎng)及基因提取

1.3.1 U937細(xì)胞培養(yǎng) U937細(xì)胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基中，37 ℃ 5%CO2，收集U937細(xì)胞并調(diào)整細(xì)胞濃度至2×105/mL，接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每孔加U937細(xì)胞100 μL作為脾淋巴細(xì)胞殺傷活性實(shí)驗(yàn)的靶細(xì)胞。

1.3.2 MLAA-34基因提取 U937細(xì)胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基中， 37 ℃ 5%CO2，收集培養(yǎng)的U937細(xì)胞，Trizol法抽提總RNA，逆轉(zhuǎn)錄合成互補(bǔ)RNA(cRNA)，分別以P1/P2和P3/P4為引物，嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行RT-PCR。PCR反應(yīng)條件：94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 60 s，共30個(gè)循環(huán)；最后72 ℃ 5 min。RT-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳鑒定，用膠回收試劑盒回收純化PCR產(chǎn)物。

1.4 SOE-PCR擴(kuò)增MLAA34-HSP70融合基因 將回收純化的PCR產(chǎn)物，MLAA-34和HSP70目的基因片段作為模板，以P1、P4為引物，采用SOE-PCR法擴(kuò)增融合基因MLAA34-HSP70。SOE-PCR反應(yīng)條件：94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 60 s，共30個(gè)循環(huán)；最后72 ℃ 5 min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳鑒定，用膠回收試劑盒回收純化PCR產(chǎn)物。

1.5 核酸疫苗pIRES2-MLAA34-HSP70的構(gòu)建及鑒定 提取質(zhì)粒pIRES2-EGFP，與回收的MLAA34-HSP70融合基因片段分別進(jìn)行EcoRⅠ/BamHⅠ雙酶切，37 ℃ 1.5 h，酶切產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖電泳回收純化，利用T4 DNA連接酶將MLAA34-HSP70融合基因亞克隆至pIRES2-EGFP質(zhì)粒中，16 ℃連接過夜，構(gòu)建pIRES2-MLAA34-HSP70重組質(zhì)粒。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌(E.coli)DH5α感受態(tài)細(xì)胞，并在卡那霉素抗性LB培養(yǎng)基上涂板培養(yǎng)。將卡那霉素抗性LB培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的陽(yáng)性轉(zhuǎn)化克隆子編號(hào)，用接種環(huán)挑取克隆子(不要完全挑完)于3 mL LB液體培養(yǎng)基中37 ℃過夜培養(yǎng)，次日提取pIRES2-MLAA34-HSP70質(zhì)粒并進(jìn)行PCR擴(kuò)增和酶切鑒定。

1.6 核酸疫苗免疫BALB/c小鼠 質(zhì)粒DNA大量制備和純化(按試劑盒說明書進(jìn)行)并用生理鹽水調(diào)整至1.0 g/L。BALB/c鼠40只，分為4組，每組10只。對(duì)照組(A組)、實(shí)驗(yàn)組(B、C、D組)分別在小鼠兩側(cè)股四頭肌肌內(nèi)注射空質(zhì)粒pIRES2、pIRES2-MLAA34、pIRES2-HSP70和pIRES2-MLAA34-HSP70，每只100 μg。小鼠每次接種前24 h，均用0.25%布比卡因100 μL預(yù)處理。在0、2、4周進(jìn)行3次同樣劑量免疫。

1.7 脾淋巴細(xì)胞懸液的制備 末次免疫后第7天，處死小鼠，置70%乙醇浸泡3～5 min，無菌取脾臟，置于不含胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基中，剪去脂肪及筋膜組織，于200目不銹鋼網(wǎng)篩上研碎，重懸于含5%胎牛血清的Hank′s液中，2 000 r/min離心5 min，低滲裂解紅細(xì)胞，用含10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基清洗3次，并調(diào)整濃度為1×107/mL。

1.8 脾淋巴細(xì)胞殺傷活性的檢測(cè) 取步驟1.7制備的脾淋巴細(xì)胞懸液，倍比稀釋。96孔細(xì)胞培養(yǎng)板各反應(yīng)孔中加脾淋巴細(xì)胞100 μL，使效靶比分別為50∶1、25∶1、12.5∶1和6.25∶1(各設(shè)3個(gè)復(fù)孔)，在37 ℃ 5%CO2中孵育24 h，測(cè)定每組小鼠特異性淋巴細(xì)胞殺傷活性。反應(yīng)結(jié)束后，每孔加入20 μL MTT工作液，37 ℃反應(yīng)4 h，棄去MTT反應(yīng)液，每孔加入二甲基亞砜(DMSO)200 μL，室溫振蕩10 min，酶標(biāo)儀測(cè)定570 nm處吸光度值(A570)。脾淋巴細(xì)胞殺傷活性(%)=[1-(反應(yīng)孔A570-效應(yīng)細(xì)胞對(duì)照孔A570)/靶細(xì)胞對(duì)照孔A570]×100%。

1.9 細(xì)胞因子水平的檢測(cè) 將步驟1.7制備的脾淋巴細(xì)胞懸液加入96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，每孔100 μL(各設(shè)3個(gè)復(fù)孔)，37 ℃ 5%CO2培養(yǎng)72 h，以純化的MLAA-34蛋白(20 μg/mL)刺激抗原。以刀豆蛋白A(ConA，10 μg/mL)為陽(yáng)性對(duì)照，未用抗原刺激孔為陰性對(duì)照，培養(yǎng)48 h后收集上清液，ELISA法檢測(cè)細(xì)胞因子，包括白細(xì)胞介素(IL)-2、IL-4和干擾素-γ(IFN-γ)水平(嚴(yán)格按照試劑盒說明書操作)。

2 結(jié) 果

2.1 SOE-PCR擴(kuò)增MLAA34-HSP70融合基因結(jié)果 以MLAA-34基因和HSP70基因?yàn)槟０?，以P1、P4為引物，采用SOE-PCR法擴(kuò)增MLAA34-HSP70融合基因，經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳鑒定，見圖1。

1：標(biāo)記物；2：MLAA34-HSP70融合基因；3：HSP70基因；4：MLAA34基因

圖1 MLAA34-HSP70融合基因擴(kuò)增結(jié)果

2.2 核酸疫苗pIRES2-MLAA34-HSP70的構(gòu)建及鑒定 將質(zhì)粒pIRES2-EGFP與MLAA34-HSP70融合基因分別進(jìn)行EcoRⅠ/BamHⅠ雙酶切，采用T4連接酶將MLAA34-HSP70融合基因與pIRES2-EGFP載體連接，構(gòu)建重組質(zhì)粒pIRES2-MLAA34-HSP70，挑取陽(yáng)性克隆菌，擴(kuò)增后提取重組質(zhì)粒進(jìn)行PCR及EcoRⅠ/BamHⅠ雙酶切鑒定，經(jīng)1.0%瓊脂糖電泳鑒定，見圖2。

2.3 脾淋巴細(xì)胞殺傷活性的檢測(cè) 將核酸疫苗分組免疫小鼠后，檢測(cè)致敏脾淋巴細(xì)胞對(duì)U937細(xì)胞的殺傷效率，見表2。其中，核酸疫苗D組的殺傷效率明顯高于A、B、C組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；而A、B、C組殺傷效率比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

2.4 細(xì)胞因子水平的檢測(cè) 脾淋巴細(xì)胞懸液經(jīng)純化的MLAA-34蛋白刺激后，ELISA法檢測(cè)脾細(xì)胞上清液中細(xì)胞因子IL-2、IL-4和IFN-γ水平，見表3。核酸疫苗D組的細(xì)胞因子IL-2、IL-4和IFN-γ水平明顯高于A、B、C組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。B組和C組上述各細(xì)胞因子水平明顯高于A組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。B組和C組間上述各細(xì)胞因子水平比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

1：標(biāo)記物；2：pIRES2-MLAA34-HSP70重組質(zhì)粒；3：雙酶切鑒定結(jié)果；4：PCR鑒定結(jié)果

圖2 重組質(zhì)粒pIRES2-MLAA34-HSP70的鑒定

*：P<0.01，與D組比較

表3 小鼠脾淋巴懸液細(xì)胞因子水平比較

*：P<0.01，與A組比較；#：P<0.01，與D組比較

3 討 論

核酸疫苗制作簡(jiǎn)單、應(yīng)用安全，是白血病免疫治療的策略之一。核酸疫苗導(dǎo)入宿主體內(nèi)后可被抗原提呈細(xì)胞或機(jī)體組織細(xì)胞攝取，在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)蛋白抗原，刺激機(jī)體產(chǎn)生細(xì)胞免疫和體液免疫，免疫保護(hù)作用好[4]。在構(gòu)建核酸疫苗時(shí)筆者使用了SOE-PCR技術(shù)，將MLAA-34基因和HSP70基因融合在一起，形成MLAA34-HSP70融合基因。MLAA-34基因與急性單核細(xì)胞白血病的發(fā)生密切相關(guān)，其表達(dá)下調(diào)能顯著抑制U937細(xì)胞在體外的增殖，同時(shí)會(huì)誘發(fā)白血病細(xì)胞的凋亡，是理想的急性白血病免疫治療的靶基因[5-7]。HSP70參與腫瘤基因調(diào)控及細(xì)胞增殖，具有抗原遞呈功能，能強(qiáng)烈刺激免疫系統(tǒng)針對(duì)腫瘤抗原的免疫反應(yīng)，進(jìn)而誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生特異性抗腫瘤免疫應(yīng)答，以HSP為基礎(chǔ)的腫瘤疫苗是目前腫瘤疫苗研究中的熱點(diǎn)[8-9]。

SOE-PCR技術(shù)的關(guān)鍵主要在于引物的設(shè)計(jì)，在設(shè)計(jì)引物時(shí)，重疊序列可以是基因序列上的任意位點(diǎn)，不需要考慮融合位點(diǎn)及其附近的特殊序列。通過特定的重疊互補(bǔ)序列的引物作為橋梁，從而使PCR擴(kuò)增產(chǎn)物末端形成了相同的重疊鏈，通過重疊鏈的延伸將PCR擴(kuò)增片段拼接起來，從而將兩個(gè)目的基因融合在一起，相比于限制性內(nèi)切酶的酶切和連接酶的連接更加簡(jiǎn)便快捷[10]。因此，在融合基因、突變體分子的構(gòu)建過程中，特別是在人類體細(xì)胞敲除、疫苗的研究、多克隆抗體的產(chǎn)生，以及在植物基因工程中具有廣泛的應(yīng)用[11-13]。本研究設(shè)計(jì)引物時(shí)采用柔性肽基因GGC GGC GGC GGC GGC作為重疊序列，融合蛋白MLAA-34和HSP70之間以柔性肽相連接，保證了兩個(gè)蛋白融合表達(dá)且正確折疊，MLAA-34和HSP70皆能發(fā)揮其獨(dú)特功能，從而保證了核酸疫苗的免疫活性。實(shí)驗(yàn)表明，核酸疫苗pIRES2-MLAA34-HSP70免疫BALB/c小鼠后，致敏脾淋巴細(xì)胞對(duì)U937細(xì)胞具有較強(qiáng)的殺傷效率，明顯高于其他實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組，說明核酸疫苗pIRES2-MLAA34-HSP70能有效地刺激機(jī)體產(chǎn)生針對(duì)U937細(xì)胞的特異性殺傷作用；此外，致敏小鼠脾細(xì)胞培養(yǎng)液中細(xì)胞因子IL-2、IL-4和IFN-γ水平明顯增高，說明該核酸疫苗能誘發(fā)強(qiáng)烈的體液免疫，增強(qiáng)機(jī)體對(duì)腫瘤細(xì)胞的免疫應(yīng)答，具有明顯的免疫保護(hù)作用。

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Study on immune effect of DNA vaccine pIRES2-MLAA34-HSP70 constructed by SOE-PCR*

ZhaoJiaqi，WangWanying，F(xiàn)anYening，MaChunping，ZhangDonghong，LvYang，ZhaoChen△

(InspectionCollegeofJilinMedicalUniversity,Jilin,Jilin132013,China)

Objective To construct the DNA vaccine pIRES2-MLAA34-HSP70,and to detect its immune effect.Methods The acute monocytic leukemia associated antigen gene MLAA-34 and heat-shock protein (HSP)70 gene were extracted by using RT-PCR.The specific overlapping primer was designed,and the fusion gene MLAA34-HSP70 was amplified by using SOE-PCR technique.Then the DNA vaccine pIRES2-MLAA34-HSP70 was constructed,and BALB/c mice were immunized with this DNA vaccine.The splenic lymphocyte killing activity was detected by using MTT,levels of IL-2,IL-4 and IFN-γ were also detected by using ELISA.Results The MLAA34-HSP70 gene (2 956 bp) and the DNA vaccine pIRES2-MLAA34-HSP70 was amplified and constructed successfully.The killing efficiency of DNA vaccine pIRES2-MLAA34-HSP70 in U937 cells was significantly higher than that in other experimental groups and control group (P<0.01),and levels of IL-4,IL-2 and IFN-γ in DNA vaccine pIRES2-MLAA34-HSP70 group were significantly higher than those in the other experimental groups and control group (P<0.01).Conclusion The DNA vaccine pIRES2-MLAA34-HSP70 is constructed successfully.It is shown that the DNA vaccine induces strong humoral immunity,which could enhance immune responses to tumor cells and specificlly kill MLAA34 positive cells.

vaccines，DNA；gene splicing by overlap extension PCR；leukemia，monocytic，acute；MLAA-34；heat-shock protein 70

??·基礎(chǔ)研究

10.3969/j.issn.1671-8348.2017.19.006

吉林省科技廳自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(20160101179JC)；吉林省衛(wèi)生和計(jì)劃生育委員會(huì)項(xiàng)目(2015Z071)；吉林省教育廳“十三五”科技項(xiàng)目(JJKH20170416KJ)；吉林省大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)課題(2015024)；國(guó)家級(jí)大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計(jì)劃項(xiàng)目(201613706019)。 作者簡(jiǎn)介：趙佳琪(1996-)，在讀本科，主要從事血液系統(tǒng)疾病免疫治療方面的研究?！?/p>

，E-mail：s2209503@sina.com。

R733.7

A

1671-8348(2017)19-2612-03

2016-11-18

2017-02-06)