李環(huán)明 楊洪升 薛春梅

摘要[目的]優(yōu)化2種野外采集白腐真菌菌絲產(chǎn)漆酶液體培養(yǎng)基。[方法]對(duì)2種采集的白腐真菌輪紋韌革菌（Stereum ostrea）和朱紅密孔菌（Pycnoporus cinnabarinus）通過(guò)分離純化得到白腐真菌菌絲，應(yīng)用ABTS法測(cè)定其產(chǎn)漆酶活性，研究碳源、氮源、金屬陽(yáng)離子、pH、溫度、轉(zhuǎn)速對(duì)白腐真菌產(chǎn)漆酶的影響。[結(jié)果]輪紋韌革菌最佳培養(yǎng)基是葡萄糖20.00 g、硝酸鉀5.00 g、NaH2PO4 5.00 g、CuSO4 1.00 g、初始pH 6、溫度25 ℃、轉(zhuǎn)速170 r/min，在第11天其產(chǎn)漆酶活性達(dá)到最大，為1.557 U/mL，是PDA液體培養(yǎng)基產(chǎn)漆酶活性的2.7倍。朱紅密孔菌最佳培養(yǎng)基是麥芽糖25.00 g、酵母膏5.00 g、NaH2PO4 1.00 g、KCl 2.00 g、初始pH 7、溫度30 ℃、轉(zhuǎn)速200 r/min，在第9天其產(chǎn)漆酶活性達(dá)到最大，為1.478 U/mL，是PDA液體培養(yǎng)基產(chǎn)漆酶活性的2.3倍。[結(jié)論]篩選出2種野外白腐真菌產(chǎn)漆酶最佳培養(yǎng)基，為漆酶的進(jìn)一步研究提供了參考。

關(guān)鍵詞 白腐真菌；漆酶；培養(yǎng)基；篩選

中圖分類號(hào) S182 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A 文章編號(hào) 0517-6611（2017）03-0001-03

Abstract[Objective] The aim was to optimize the liquid culture medium of two species of field acquisition white rot fungi.[Method] By isolating and purifying two species of white rot fungi，Stereum ostrea and Pycnoporus cinnabarinus，white rot fungus hyphae were collected，and the liquid culture medium of laccase was screened.ABTS method was applied to measure the activity of laccase.Effects of carbon sources，nitrogen sources，metal cations，pH，temperature and rotational speed on laccase produced by white rot fungi were studied.[Result] The optimum medium of Stereum ostrea was glucose 20.00 g，potassium nitrate 5.00 g，NaH2PO4 5.00 g，CuSO4 1.00 g，the initial pH 6，temperature 25 ℃， rotational speed 170 r/min，and the laccase activity reached the maximum on the 11th day the maximum value reached 1.557 U/mL which was 2.7 times of the laccase activity of PDA liquid culture.The optimum medium of Pycnoporus cinnabarinus was maltose 25.00 g，yeast extract 5.00 g，NaH2PO4 1.00 g，KCl 2.00 g，the initial pH 7，temperature 30 ℃，rotational speed 200 r/min，and the laccase activity reached the maximum in the 9 d，the maximum value 1.478 U/mL which was 2.3 times of the laccase activity of PDA liquid culture.[Conclusion] The opitimal liquid culture medium of two species of field acquisition white rot fungi is obtained so as to provide reference for further study of laccase.

Key words White rot fungus；Laccase；Culture medium；Screen

白腐真菌是一類使木材呈白色腐朽的真菌，可在特定條件下產(chǎn)各種酶系[1]，包括漆酶、木質(zhì)素過(guò)氧化氫酶和錳過(guò)氧化氫酶等[2-3]。在白腐真菌產(chǎn)的酶系中，漆酶的應(yīng)用非常廣泛。在染料脫色方面，馬利[4]、傅愷[5]、張麗[6]、王天女等[7]對(duì)重組血紅密孔菌產(chǎn)漆酶對(duì)活性藍(lán)等染料進(jìn)行脫色結(jié)果分析，其脫色率達(dá)93%。在環(huán)境污染的處理方面，彭丹對(duì)黃孢原毛平革菌在固態(tài)發(fā)酵體系產(chǎn)真菌漆酶對(duì)五氯酚（PCP）降解進(jìn)行研究，結(jié)果表明在沒(méi)有氧化還原介體時(shí)粗漆酶液能降解PCP，反應(yīng)6 h降解率為37.8%，粗酶液中加入5 mmol/L氧化還原介體（ABTS）能獲得更高的降解率，達(dá)97.0%；將粗漆酶液用（NH4）2SO4鹽析純化，用提純后漆酶降解PCP，6 h后降解率為81.8%[8-9]。在農(nóng)藥處理方面，程科[1]對(duì)白腐菌漆酶純化分離并對(duì)阿特拉津進(jìn)行降解研究，結(jié)果表明，在最優(yōu)降解條件下，阿特拉津降解率響應(yīng)預(yù)測(cè)值為52.41%，驗(yàn)證值為52.32%，最適條件下的降解率提高了10%～15%。此外，漆酶能選擇性地催化木質(zhì)素降解，這一特性可用于紙漿生產(chǎn)。漆酶還可用來(lái)測(cè)定食品中抗壞血酸的總含量，該方法已應(yīng)用于白酒、啤酒、奶粉等食品檢測(cè)[10]。筆者研究了2種野外采集的白腐真菌液體粗酶液中漆酶的活性，對(duì)產(chǎn)漆酶的液體培養(yǎng)基進(jìn)行優(yōu)化，以期得到最佳的培養(yǎng)基配方。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 儀器與試劑。

恒溫水浴鍋、YXQ-LS-立式壓力蒸汽滅菌鍋、KA-1000低速離心機(jī)、BS-2F振蕩培養(yǎng)箱、ZHWY-2102全溫?fù)u床振蕩器、SPX-250B-G型恒溫光照培養(yǎng)箱。呋喃西林、ABTS、KNO3、MgSO4、NaH2PO4、H2O2、CuSO4、CaCl2、KCl、ZnSO4、醋酸-醋酸鈉緩沖液。

1.1.2 供試菌種。菌種采于佳木斯市四豐鄉(xiāng)小樺山，根據(jù)真菌鑒定圖譜鑒定為輪紋韌革菌、朱紅秘孔菌。

1.1.3 培養(yǎng)基。

PDA選擇培養(yǎng)基：土豆100.00 g，葡萄糖5.00 g，呋喃西林0.25 g，瓊脂10.00 g，定容至500 mL。斜面培養(yǎng)基：稱去皮馬鈴薯200.00 g，切成小塊，加適量（完全浸沒(méi)馬鈴薯）蒸餾水，煮20～30 min，用9層紗布過(guò)濾出馬鈴薯浸出液，加入葡萄糖20.00 g、NaH2PO4 3.00 g、MgSO4·7H2O 1.50 g、瓊脂20.00 g，蒸餾水定容至1 000 mL[11]。液體標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)基：馬鈴薯200.00 g，煮20～30 min，用9層紗布過(guò)濾，加入葡萄糖20.00 g、NaH2PO4 3.00 g、MgSO4·7H2O 1.50 g、蛋白胨5.00 g，蒸餾水定容至1 000 mL。

1.2 方法

1.2.1 菌種分離及擴(kuò)大培養(yǎng)。先用75%乙醇擦拭1次，用剪刀剪開(kāi)菌體，在中間剪一小塊菌體接種到PDA選擇培養(yǎng)基上，當(dāng)菌絲萌發(fā)至長(zhǎng)2 cm時(shí)，切取菌絲尖端1 mm左右，接入新配制PDA母種培養(yǎng)基上，重復(fù)3～5次，以不長(zhǎng)雜菌為分離成功[1]。

1.2.2 液體菌種的制備。在每瓶PDA液體培養(yǎng)基中接種3塊10 mm的菌片，25 ℃、110 r/min培養(yǎng)13 d。

1.2.3 培養(yǎng)基的篩選。

1.2.3.1 碳源篩選。以不加馬鈴薯的液體標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)基為基準(zhǔn)，設(shè)置葡萄糖、乳糖、可溶性淀粉、麥芽糖、蔗糖5個(gè)不同碳源處理，另設(shè)不加碳源為對(duì)照，篩選最佳碳源。

1.2.3.2 氮源篩選。設(shè)置硝酸鉀、硫酸銨、 酵母膏、牛肉膏、蛋白胨5個(gè)氮源處理，以不加氮源為對(duì)照，篩選最佳氮源。

1.2.3.3 金屬陽(yáng)離子篩選[6]。設(shè)置Zn2+、Ca2+、Mg2+、K+、Cu2+5個(gè)因素，以不加金屬陽(yáng)離子為對(duì)照。

1.2.3.4 營(yíng)養(yǎng)因素正交試驗(yàn)。試驗(yàn)因素與水平見(jiàn)表1。

1.2.3.5 溫度的篩選。以營(yíng)養(yǎng)因素正交試驗(yàn)篩選出來(lái)的最佳組合為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，分別設(shè)置15、20、25、30、35、40 ℃共6個(gè)不同溫度處理。

1.2.3.6 初始pH的篩選。用5% NaOH和0.2 mol/mL HCl將發(fā)酵培養(yǎng)基的初始pH分別設(shè)置為4、5、6、7、8、9。

1.2.3.7 搖床轉(zhuǎn)速篩選。設(shè)置110、140、170、200、230 r/min，以不設(shè)轉(zhuǎn)速為對(duì)照。

1.2.3.8 培養(yǎng)時(shí)間的篩選。根據(jù)對(duì)2種白腐真菌培養(yǎng)基營(yíng)養(yǎng)因素及條件的篩選，最后得出最佳培養(yǎng)基配方，并且進(jìn)行培養(yǎng)，測(cè)定1、3、5、7、9、11、13、15 d等不同時(shí)間段產(chǎn)漆酶活性。

1.2.4 漆酶活性測(cè)定。

1.2.4.1 胞外酶的提取。對(duì)液體培養(yǎng)基進(jìn)行紗布過(guò)濾，冰箱冷藏24 h后4 000 r/min離心15 min，上清液即為胞外提取液[12-13]。

1.2.4.2 漆酶活性測(cè)定。采用ABTS法。

空白樣（4.0 mL）：2.0 mL 0.2 mol/L醋酸-醋酸鈉緩沖液（pH 4.5）+0.4 mL 0.3 mol/L ABTS +1.2 mL去離子水+0.4 mL失活酶液。樣品（4.0 mL）：2.0 mL 0.2 mol/L醋酸-醋酸鈉緩沖液（pH 4.5）+0.4 mL 0.3 mol/L ABTS+1.2 mL去離子水+0.4 mL酶液。在40 ℃下應(yīng)用可見(jiàn)分光光度計(jì)檢測(cè)420 nm波長(zhǎng)處吸收值變化，30 s間隔讀數(shù)，記錄240 s內(nèi)吸收值變化，定義1 min內(nèi)氧化1 μmol ABTS所需要的酶量為1個(gè)漆酶活力單位（U），已知420 nm波長(zhǎng)處ABTS摩爾消光系數(shù)ε420=3.6×104 L/（mol·cm）。

2 結(jié)果與分析

2.1 營(yíng)養(yǎng)因素對(duì)白腐真菌產(chǎn)漆酶的影響

5種碳源中，輪紋韌革菌產(chǎn)漆酶液體培養(yǎng)基中最佳碳源是葡萄糖，其產(chǎn)漆酶最大值為0.578 U/mL；朱紅密孔菌產(chǎn)漆酶液體培養(yǎng)基中最佳碳源是麥芽糖，其產(chǎn)漆酶最大值為0.642 U/mL（圖1）。

5種氮源中，輪紋韌革菌產(chǎn)漆酶液體培養(yǎng)基中最佳氮源是硝酸鉀，其產(chǎn)漆酶最大值為1.069 U/mL；朱紅密孔菌產(chǎn)漆酶液體培養(yǎng)基中最佳氮源是酵母膏，其產(chǎn)漆酶最大值為0.752 U/mL（圖2）。

2.2 金屬陽(yáng)離子對(duì)白腐真菌產(chǎn)漆酶的影響

由圖3可知，金屬陽(yáng)離子Mg2+、Cu2+對(duì)輪紋韌革菌產(chǎn)漆酶都有促進(jìn)作用，Cu2+對(duì)輪紋韌革菌促進(jìn)最大，在添加了Cu2+的液體培養(yǎng)基中，其產(chǎn)漆酶最大值為1.349 U/mL。而Ca2+對(duì)其有抑制作用，添加了Ca2+的液體培養(yǎng)基產(chǎn)漆酶值為0.389 U/mL，Zn2+、K+影響不大，和不加金屬離子產(chǎn)漆酶相差不大。

金屬陽(yáng)離子K+、Mg2+、Cu2+對(duì)朱紅密孔菌產(chǎn)漆酶都有促進(jìn)作用，K+對(duì)朱紅密孔菌促進(jìn)作用最大，在添加了K+的液體培養(yǎng)基中，其產(chǎn)漆酶最大值為0.931 U/mL。而Ca2+對(duì)其有抑制作用，添加了Ca2+的液體培養(yǎng)基產(chǎn)漆酶值為0.056 U/mL，Zn2+對(duì)朱紅密孔菌產(chǎn)漆酶影響不大。

2.3 不同營(yíng)養(yǎng)因素正交試驗(yàn)結(jié)果

綜合評(píng)價(jià)，輪紋韌革菌液體營(yíng)養(yǎng)因素培養(yǎng)基最優(yōu)組合為A2B2C3D1，此時(shí)獲得的菌絲產(chǎn)漆酶為1.386 U/mL。即優(yōu)化后的最適培養(yǎng)基為：葡萄糖20.00 g，硝酸鉀5.00 g，NaH2PO4 5.00 g，CuSO4 1.00 g。由極差R值可知，影響菌絲體產(chǎn)漆酶的因素大小順序?yàn)槠咸烟?、硝酸鉀、CuSO4和NaH2PO4，葡萄糖和硝酸鉀對(duì)試驗(yàn)結(jié)果有極顯著影響（表2）。

朱紅密孔菌液體營(yíng)養(yǎng)因素培養(yǎng)基最優(yōu)組合為A3B2C1D3，此時(shí)獲得的菌絲產(chǎn)漆酶為0.940 U/mL。即優(yōu)化后的最適培養(yǎng)基為：麥芽糖25.00 g，酵母膏5.00 g，NaH2PO4 1.00 g，KCl 2.00 g。由極差R值可知，影響菌絲體產(chǎn)漆酶的因素大小順序?yàn)辂溠刻?、酵母膏、NaH2PO4和KCl，麥芽糖和酵母膏對(duì)試驗(yàn)結(jié)果有極顯著影響（表3）。

2.4 培養(yǎng)條件對(duì)白腐真菌產(chǎn)漆酶的影響

2.4.1 pH對(duì)白腐真菌產(chǎn)漆酶的影響。

由圖4可知，輪紋韌革菌在pH 6的液體培養(yǎng)基中產(chǎn)漆酶量最大，為1.395 U/mL，且偏堿的培養(yǎng)基不適合菌絲體產(chǎn)漆酶。朱紅密孔菌產(chǎn)漆酶最適pH為7，產(chǎn)漆酶最大值為0.940 U/mL，偏堿的培養(yǎng)基對(duì)其有抑制作用。

2.4.2 溫度對(duì)白腐真菌產(chǎn)漆酶的影響。

由圖5可知，輪紋韌革菌最適溫度為25 ℃，產(chǎn)漆酶最大值為1.386 U/mL，朱紅密孔菌最適溫度為30 ℃，產(chǎn)漆酶最大值為0.972 U/mL。溫度過(guò)高和過(guò)低，2種白腐真菌漆酶活性都降低。

2.4.3 轉(zhuǎn)速對(duì)白腐真菌產(chǎn)漆酶的影響。

由圖6可知，輪紋韌革菌最佳轉(zhuǎn)速為170 r/min，產(chǎn)漆酶最大值為1.482 U/mL，朱紅密孔菌最佳轉(zhuǎn)速為200 r/min，產(chǎn)漆酶最大值為1.117 U/mL，在靜置狀態(tài)下2種白腐真菌產(chǎn)漆酶活性都非常低。

2.5 培養(yǎng)時(shí)間對(duì)產(chǎn)漆酶的影響 結(jié)果表明，輪紋韌革菌在最佳培養(yǎng)基培養(yǎng)下，開(kāi)始1～5 d漆酶活性較低，在第7天有下降，7～11 d快速增長(zhǎng)并且達(dá)到最大，在第11天其產(chǎn)漆酶活性為1.557 U/mL，13～15 d漆酶活性稍有下降，并且達(dá)到平穩(wěn)。朱紅密孔菌在最佳培養(yǎng)基培養(yǎng)下，開(kāi)始1～3 d漆酶活性較低，3～7 d平穩(wěn)增長(zhǎng)，并且在7～9 d快速增長(zhǎng)，達(dá)到最大，在第9天其產(chǎn)漆酶活性為1.478 U/mL，在11 d有下降，11～13 d產(chǎn)漆酶活性變化不大，到15 d又有下降。

3 結(jié)論

輪紋韌革菌最佳培養(yǎng)基是葡萄糖20.00 g、硝酸鉀5.00 g、NaH2PO4 5.00 g、CuSO4 1.00 g、初始pH 6、溫度25 ℃、轉(zhuǎn)速170

r/min，在第11天其產(chǎn)漆酶活性達(dá)到最大，為1.557 U/mL，是PDA液體培養(yǎng)基產(chǎn)漆酶活性的2.7倍。朱紅密孔菌最佳培養(yǎng)基是麥芽糖25.00 g、酵母膏5.00 g、NaH2PO4 1.00 g、KCl 2.00 g、初始pH 7、溫度30 ℃、轉(zhuǎn)速200 r/min，在第9天其產(chǎn)漆酶活性達(dá)到最大，為1.478 U/mL，是PDA液體培養(yǎng)基產(chǎn)漆酶活性的2.3倍。通過(guò)對(duì)2種白腐真菌產(chǎn)漆酶培養(yǎng)基的篩選，得出最佳培養(yǎng)基配方，為后期的漆酶研究提供了理論依據(jù)。

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